CUG-结合蛋白1调节HSC活化和肝纤维化

TGF-β通过p38 MAPK增加HSC中CUGBP1的表达

然后我们检测了人HSC细胞系LX-2细胞和经TGF-β处理的原代小鼠HSC中CUGBP1的水平，因为TGF-α诱导的HSC活化在肝纤维化形成中起着重要作用。TGF-β在LX-2细胞和原代小鼠HSC中强烈诱导CUGBP1，但在人肝L02细胞和原发小鼠肝细胞中不诱导(图2a-c). 接下来，我们观察到TGF-β没有抑制CUGBP1 mRNA的降解(图2d). 使用TGF-β信号抑制剂，我们观察到TGF-α受体I抑制剂SB431542和p38 MAPK抑制剂SB203580，但c-Jun N末端激酶（JNK）抑制剂SP600125、细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂FR 180204、，或Smad3抑制剂SIS3阻断TGF-β处理的LX-2细胞中CUGBP1表达的增加(图2e). 据报道，TGF-β通过p38 MAPK激活激活转录因子2（ATF2）^17,18始终发现TGF-β通过p38 MAPK在LX-2细胞中诱导ATF2磷酸化(图2f). 使用基因2启动子工具，在人类CUGBP1启动子中发现了类似的cAMP反应元件（CRE）(图2g). 此外，在TGF-β刺激下，发现pT-ATF2与LX-2细胞中CUGBP1启动子的CRE样区域结合(图2h). 因此，我们假设TGF-β通过p38 MAPK/ATF-2途径诱导LX-2细胞中CUGBP1 mRNA的表达。

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图2

TGF-β通过p38 MAPK增加HSC中CUGBP1的表达。

(一)人肝星状细胞系LX-2或人肝细胞L02细胞CUGBP1 mRNA定量PCR分析⁻¹TGF-β持续6 h（平均值±s.e.m。；n个=3, **P（P）<0.01（按学生）t吨-测试）。(b条,c)小鼠原代HSC LX-2细胞CUGBP1的Western blot分析(b条)和原代小鼠肝细胞(c)用或不用5 ng/ml处理⁻¹TGF-β持续24小时。数据代表三个独立实验（平均值±s.e.m。；n个=3, **P（P）<0.01学生t吨-测试）。(d日,e（电子）)用放线菌素D（1μg ml）处理LX-2细胞⁻¹)并且有或没有5 ng ml⁻¹指示时间间隔的TGF-β(d日). 用或不用SB431542（10μM）、SB203580（10μM）、SP600125（10μL）、FR180204（10μR）或SIS3（20μM）处理LX-2细胞，在5 ng ml⁻¹TGF-β治疗6小时(e（电子）). 然后进行定量PCR检测CUGBP1的剩余mRNA表达。（平均值±标准误差。；n个=3, *P（P）<0.05, **P（P）经Dunnett检验后的单因素方差分析，<0.01）。(（f）)用5 ng ml SB431542处理或不处理LX-2细胞后的Western blot分析⁻¹TGF-β治疗24小时(克)人类CUGBP1基因启动子和转录因子的Gene2promotor分析。(小时)将CUGBP1-CRE-Bio或mCUGBP1/CRE-Bio与LX-2细胞的总细胞提取物混合，进行探针下拉分析（f）使用SoftLink Soft Release avidin树脂制备沉淀用于蛋白质印迹。中的数据（f）和小时是两个独立实验的代表。

CUGBP1通过减少IFN-γ表达促进HSC激活

接下来，我们假设增加的CUGBP1可能调节HSC激活。我们使用siRNA敲低LX-2细胞中的CUGBP1，定量PCR分析表明，siRNA-CUGBP1mRNA成功地减少了94%的CUGBB1 mRNA(图3a). CUGBP1沉默显著降低LX-2细胞中HSC活化标记物α-SMA的mRNA和蛋白表达(图3b，c)并且在激活的LX-2细胞中增加了IFN-γ，一种经典的抗纤维化因子(图3b、d)或激活的初级鼠标HSC(图3e). 相反，CUGBP1的敲除并不影响肝L02细胞或小鼠原代肝细胞中α-SMA的表达、增殖或凋亡(补充图2a–c).

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图3

CUGBP1调节激活HSC中IFN-γ和α-SMA的表达。

(一)转染si-CUGBP1或对照siRNA 48小时的LX-2细胞CUGBP1的定量PCR分析(b条,c)用si-CUGBP1或对照siRNA转染LX-2细胞48小时后，用或不用5 ng ml⁻¹TGF-β持续24 h。细胞提取物进行定量PCR分析（平均值±标准偏差。；n个=3) (b条)和蛋白质印迹分析(c). (d日)ELISA测定上清液IFN-γ（平均值±标准偏差。；n个=3). (e（电子）)用si-CUGBP1或对照siRNA转染48小时，然后用或不用5 ng/ml处理的原代小鼠HSC的CUGBP1、α-SMA和IFN-γ的免疫荧光分析⁻¹TGF-β持续24小时（比例尺，50μm）。这些数据代表了三个独立的实验**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。

据报道，IFN-γ信号通过诱导Smad7表达降低HSC激活^15,19,20我们证明，LX-2细胞中的CUGBP1沉默增加了IFN-γ、信号转导子和转录激活子1（STAT1）磷酸化和Smad7的表达，但没有抑制pSmad2的表达(图4a、b). 接下来，我们使用了两种方法来抑制IFN-γ信号：使用抗IFN-γ抗体中和IFN-γ，以及阻断STAT1缺陷细胞系U3A中STAT1的激活。IFN-γ中和几乎完全消除了CUGBP1击倒后α-SMA的减少(图4c). STAT1缺陷细胞系U3A细胞中的CUGBP1沉默没有抑制α-SMA的表达(图4d). 2fTGH细胞中信号传导下游转录物Smad7的mRNA表达也增加(图4d). 这些结果表明，由于CUGBP1的沉默，IFN-γ信号传导的增加有助于α-SMA表达的减少。

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图4

CUGBP1通过减少IFN-γ的产生促进HSC活化。

(一)用si-CUGBP1或对照siRNA转染LX-2细胞48 h，然后用或不用TGF-β（5 ng ml）处理⁻¹)对于指示的时间间隔。然后对细胞提取物进行Western blot分析。(b条)pY-STAT1和Smad7表达的折叠变化一. (c)用si-CUGBP1或对照siRNA转染LX-2细胞48 h，然后用或不用TGF-β（5 ng ml）处理⁻¹)或抗IFN-γ抗体（1μg ml⁻¹)如24小时所示，对细胞提取物进行定量PCR分析（平均值±标准偏差。；n个=3). (d日)用si-CUGBP1或对照siRNA转染人纤维肉瘤2fTGH（亲代）细胞和U3A（STAT1-null 2fTGH）细胞60 h。对指示基因表达的定量PCR分析（平均值±标准差。；n个=3). 这些数据代表了三个独立的实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01（按学生）t吨-测试；NS，不显著。

此外，通过mRNA测序，我们发现激活的LX-2细胞中CUGBP1的敲除改变了TGF-β信号通路相关基因的mRNA表达，包括α-SMA、骨形态发生蛋白受体II型（BMPR2）、Smad5、p107、p300和rho相关的线圈蛋白激酶1（ROCK1；补充表1). 这些结果表明，HSC中CUGBP1的减少可能导致TGF-β信号通路中相关分子的更广泛变化。

CUGBP1通过与GRE结合诱导IFN-γmRNA衰减

CUGBP1通过结合HeLa细胞中短寿命人类转录物3′-UTR中的GRE促进mRNA衰减²¹因此，我们使用计算方法在IFN-γmRNA序列中搜索GRE，并在IFN-βmRNA序列的3′-UTR中鉴定出一个9核苷酸一致序列，5′-UGUGUUUU-3′(图5a). 接下来，我们使用mRNA-蛋白沉淀法测量了CUGBP1和IFN-γGRE之间的结合，其中IFN-γ-GRE-Biotin(图5b，泳道1和2），但未突变IFN-γGRE生物素(图5b，3号和4号车道）绑定并沉淀CUGBP1。一个冷的IFN-γGRE探针，但不是一个突变的IFN-βGRE探针成功地与IFN-γ-GRE-Biotin竞争结合CUGBP1(图5c)，表明CUGBP1特别与IFN-γGRE结合。我们进一步使用不同浓度的冷IFN-γGRE探针进行了竞争性RNA-结合实验，并测定了含CUGBP1的IFN-γ-GRE络合物的平衡解离常数为5.7nM(图5d，e). 这种结合以时间依赖的方式导致IFN-γmRNA的衰变，使用siRNA敲除CUGBP1几乎完全抑制了这种mRNA衰变(图5f).

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图5

CUGBP1通过与GRE序列结合诱导IFN-γmRNA衰减。

(一)IFN-γmRNA的3′-UTR装箱序列显示类似的GRE序列。IFN-γ-GRE-Bio和突变IFN-γ-GRE-Bio的序列用于结合反应。(b条)mRNA下拉分析通过将IFN-γ-GRE-Bio或mIFN-γ/GRE-Bio与LX-2细胞的总细胞提取物混合进行。使用SoftLink Soft Release avidin树脂制备沉淀用于蛋白质印迹。(c,d日)使用不同浓度的冷IFN-γ-GRE探针或mIFN-γ-GRE探针竞争IFN-γGRE-Bio与CUGBP1之间的结合。(e（电子）)实验如所示d日进行三次，并使用磷光成像仪定量结合带。(（f）)用si-CUGBP1或对照siRNA转染LX-2细胞48小时，并用放线菌素D处理指定时间。收集细胞进行定量PCR分析。

减少CUGBP1表达减轻小鼠肝纤维化

我们从天然产物中筛选了CUGBP1表达的小分子抑制剂，以进一步证实CUGBP1-在HSC激活中的作用，并确定了一种可能用于治疗肝纤维化的CUGBP1/抑制剂。我们发现fraxinellone从Dictamni皮质降低TGF-β激活的LX-2细胞中与HSC激活抑制相关的CUGBP1、α-SMA和前胶原α1（I）的mRNA和蛋白表达(补充图3a–c). 然后在过度表达或沉默CUGBP1的细胞中检测fraxinellone的作用。使用siRNA沉默CUGBP1几乎完全消除了fraxinellone对α-SMA表达的抑制(补充图3d，左）。类似地，使用pCDNA3 CUGBP1在LX-2细胞中过度表达CUGBB1几乎可以逆转fraxinellone介导的α-SMA水平下降(补充图3d，右侧）。这些结果表明，白蜡烯酮对TGF-β诱导的α-SMA表达的影响依赖于CUGBP1丰度。然后我们研究了白蜡烯酮对HSC活化的影响是否与IFN-γ的产生有关。值得注意的是，fraxinellone以剂量和时间依赖性的方式触发了LX-2细胞中IFN-γmRNA的表达(补充图3e). Western blotting还显示，白蜡烯酮导致LX-2细胞中STAT1磷酸化的剂量依赖性增加，而AG490预处理消除了白蜡烯对胶原-α1（I）表达的影响(补充图3f). 这些结果表明，在HSC激活或体内平衡中，CUGBP1和IFN-γ信号之间存在关系，而HSC激活和体内平衡是由fraxinellone调节的。关于fraxinellone抑制CUGBP1表达的机制，我们观察到fraxinellone没有促进CUGBP1mRNA或蛋白的降解(补充图4).

fraxinelone对HSC活化的特异性作用进一步与BDL诱导的小鼠肝纤维化的改善有关。图6a结果显示，BDL处理的小鼠肝切片中观察到肝细胞脂肪变性、中央静脉壁轻度增厚、纤维增生、炎性细胞浸润和胶原沉积。Fraxinellone治疗以剂量依赖的方式显著改善了这些病理变化(图6a、b). 此外，纤维化小鼠血清透明质酸、层粘连蛋白、III型前胶原和肝羟脯氨酸（Hyp）的表达显著增加。20或40 mg kg治疗⁻¹fraxinellone显著减弱了这些生化变化(图6c、d). 此外，fraxinellone以剂量依赖性方式抑制肝组织中胶原蛋白α1（III）、胶原蛋白αl（IV）和α-SMA mRNA的表达水平(图6e).

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图6

xinellone减轻BDL诱导的小鼠肝纤维化。

在8周龄C57BL/6小鼠中，通过使用不可吸收的细丝系紧总胆管进行BDL。BDL术后每天灌胃1次，共4周。将小鼠随机分为5组(n个=每组8个）：Sham、BDL、BDL+fraxinellone 10 mg kg⁻¹，BDL+fraxinellone 20 mg kg⁻¹和BDL+fraxinellone 40 mg kg⁻¹. (一)肝组织的代表性照片，肝组织H&E染色、Masson染色和Sirius红色石蜡包埋切片的显微照片（比例尺，100μm）。(b条)Masson染色切片的胶原评分。(c)肝Hyp的表达水平。(d日)血清透明质酸、层粘连蛋白和III型前胶原的ELISA分析。(e（电子）)定量PCR分析小鼠肝脏中的α-SMA、α1（III）型胶原和α1（IV）型胶原。(b条–e（电子），平均值±标准误差。；n个=8). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）通过Dunnett检验后的单向方差分析，与BDL相比<0.001，^#P（P）<0.05，以及^###P（P）<0.001与学生的虚假t吨-测试。

在BDL诱导的肝纤维化中，20或40 mg kg⁻¹fraxinellone还降低了CUGBP1和α-SMA的蛋白表达(图7a、b)，同时增加IFN-γ表达水平(图7c). 此外，我们观察到，在经fraxinellone治疗的BDL小鼠的肝脏中，pY-STAT1表达增加，pSmad2表达减少(图7a). 接下来，我们使用reelin和α-SMA作为活化HSC的标记物²²。如中箭头所示图7c，我们确认α-SMA（红色）和卷轴蛋白（青色）阳性的HSC中存在IFN-γ（绿色）。此外，我们观察到BDL小鼠肝脏中细胞溶质和核CUGBP1表达水平均升高(补充图5a). 据报道，CUGBP1调控心脏或骨骼肌细胞核内心肌肌钙蛋白T（Tnnt2）、肌管蛋白相关1基因（Mtmr1）和肌肉特异性氯通道（Clcn1）的剪接模式²³我们发现，BDL小鼠肝脏中Tnnt2的剪接模式发生了改变，但Mtmr1或Clcn1没有改变(补充图5b). 这些结果表明，CUGBP1可能在肝纤维化的发展中调节mRNA剪接。

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图7

在BDL模型中，Fraxinellone调节TGF-β和IFN-γ信号传导。

(一)小鼠肝脏中α-SMA、CUGBP1、pSmad2、pSTAT1、Smad7和α-微管蛋白表达的Western blot分析。(b条)肝脏冷冻切片中α-SMA和CUGBP1表达的IHF分析（比例尺，100μm）。(c)肝脏冷冻切片中IFN-γ表达的IHF分析（比例尺，50μm）。箭头表示HSC中的IFN-γ（绿色），α-SMA（红色）和Reelin（青色）均为阳性。

同样，40 mg kg⁻¹fraxinellone缓解CCl₄-诱导性肝纤维化(补充图6a–d). Fraxinellone还降低了纤维化肝脏中CUGBP1和α-SMA的表达(补充图6e). 此外，为了确定fraxinellone对肝纤维化的治疗作用，我们在CCL后5周或3周给小鼠服用fraxinellone₄治疗并发现fraxinellone能够抑制已建立的纤维化的进展(补充图7). 该化合物不影响LX-2细胞的自发增殖、PDGF诱导的增殖或凋亡(补充图8和9). 上述结果表明，fraxinellone可作为一种潜在的抗纤维化药物。因此，我们假设用fraxinellone获得的HSC中CUGBP1的减少被认为是改善肝纤维化的一种可能机制。

组织芯片天狼星红染色和免疫组织荧光

福尔马林固定和石蜡包埋肝纤维化组织阵列购自US Biomax（LV805a）（马里兰州罗克维尔）。组织阵列患者信息如所示补充表2.根据之前的报告进行了IHF³⁴将肝组织薄片（4μm）固定在丙酮中进行免疫组织荧光，并用指示的抗体染色。IHF中使用的抗体有：抗CUGBP1（Santa Cruz Biotechnology，SC-20003，1:50）、α-SMA（Santa Cruz Bietechnologies，SC-32251，1:50，IFN-γ偶联到PE-CF594（BD Biosciences，562303，1:50），山羊抗鼠IgG2a偶联到Alexa Fluor 594（Invitrogen，A-21135，1:500），山羊抗鼠IgG1偶联到Alexa Fluoro 647（Invit罗gen，A-21240，1:500，与Alexa Fluor 488结合的山羊抗鼠IgG2b（Invitrogen，A-21141，1:500）。然后用DAPI对切片进行染色，并用共焦激光扫描显微镜（德国莱卡）进行检查。天狼星红染色由Servicebio（中国武汉）公司进行。用Ishak量表评估肝纤维化分期³⁵.

老鼠

8周龄雄性C57BL/6小鼠由扬州大学实验动物中心（中国扬州）提供。根据美国国家科学院编制并由美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（1985年修订的美国国立卫生研究院出版物86-23）中概述的标准，所有雄性C57BL/6小鼠都接受了人道护理。在无病原体条件下，每笼饲养五只，在受控温度（22±2°C）和光周期（12:12-h光-暗周期）下，用柔软的床上用品进行饲养。在被纳入实验之前，他们被允许适应这些条件至少2天。所有动物实验程序均经南京大学（中国南京）动物护理委员会批准。

细胞培养

属于人类肉瘤细胞系2ftgh的细胞和属于U3A细胞系的细胞，U3A是一种缺乏STAT1表达的2ftgh突变细胞系，是乔治·斯塔克（克利夫兰临床基础研究所）赠送的。人正常肝细胞系L02购自中国医学科学院。人肝星状细胞系LX-2购自中国中南大学湘雅中心实验室。2ftgh、U3A和L02细胞在添加100 U ml的Dulbecco改良鹰培养基（Gibco，NY）中培养⁻¹青霉素，100μg ml⁻¹链霉素和10%胎牛血清（HyClone，中国北京），湿化5%（v/v）CO₂大气温度为37°C。LX-2细胞在含有2%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。

小鼠肝脏非实质性肝细胞的分离

根据报告的方案，从小鼠肝脏中分离出原代HSC³⁶包括以下步骤：小鼠肝脏的原位蛋白酶/胶原酶灌注，在体外消化、密度梯度分离和流式细胞术分选。在密度梯度分离后，收集原代非实质性肝细胞。流式细胞术分选用于分离HSC（类视网膜⁺)，肝巨噬细胞（F4/80⁺)、肝窦内皮细胞（CD146⁺)和自然杀伤细胞（NK1.1⁺). 用于分类的抗体有：与PE-Cy7偶联的抗F4/80抗体（eBioscience，25-4801-82，1:50），与PerCP-Vio700偶联的抗CD146抗体（miltenyi，130-103-865，1:10），与PE偶联的抗NK1.1抗体（millenyi，130-102-400，1:10）。

小鼠肝原代肝细胞的分离

根据之前的方案从小鼠肝脏中分离出原代小鼠肝细胞³⁷简而言之，小鼠肝脏首先通过门静脉原位灌注钙²⁺和镁²⁺在37.8°C下，添加0.5 mM EGTA和25 mM HEPES的游离Hank平衡盐溶液（HBSS）。然后，将缓冲液替换为HBSS中0.1%的胶原酶溶液（含有4 mM CaCl₂和0.8 mM MgSO₄). 灌注几分钟后，肝脏迅速从体腔中切除，并分散到冰冷的HBSS中。产生的细胞悬浮液通过无菌的70微米孔径尼龙细胞过滤器（Falcon；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）过滤，并在30℃下旋转三次克将颗粒悬浮在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中4分钟，用于原代肝细胞培养。

试剂和化学品

如前所述，获得了（3R）-3b-（3-呋喃基）-3ab，7-二甲基-1，3，3a，4，5，6-六氢异苯并呋喃-1-酮³⁸。Hyp测定试剂盒从南京建成生物工程研究所（中国南京）获得。本研究中使用的试剂购买如下。pCDNA3.1-CUGBP1质粒和探针来自Genscript（中国南京）。AG490从Sigma（Sigma-Aldrich China，Shanghai，China）购买。AAV-control、AAV-ShRNA-CUGBP1（合同号HH20160222RFF-AAV01）和AAV-pGFAP-CUGBP1。

VA-Lip-siRNA-CUGBP1的制备

用Genscript合成了小鼠CUGBP1（5′-CCAUGAACGGCUUUCAAAUUGGAAU-3′）的SiRNA。根据报道的方法制备VA-Lip-siRNA-CUGBP1³⁹简单地说，通过向50μl二甲基亚砜中加入5 mg VA来制备VA溶液。将280 nmol VA溶液和0.14μmol Lipotrust溶液（日本北海道北海道系统科学研究所）在25°C的1.5 ml管中旋涡混合。在25°C下搅拌，将12.24 nmol siRNA-control或siRNA-CUGBP1添加到VA-Lip溶液中。过滤VA-Lip-SiRNA溶液。收集部分，并用PBS对过滤器中截留的物质进行重组，以达到所需的剂量体内使用。

BDL诱导小鼠肝纤维化及给药

将8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为组。用异氟醚麻醉小鼠。所有手术都是在无菌条件下进行的。进行中线剖腹手术，用3-0手术丝在分叉处正下方靠近肝门的地方结扎总胆管，并在结扎之间切开，如前所述⁴⁰对照组进行了一次假手术，包括暴露而非结扎总胆管。每天给三组结扎小鼠灌胃10、20和40 mg kg⁻¹fraxinellone分别治疗4周。术后4周在全麻下采集肝脏。收集血清并在−70°C下储存，用于测定透明质酸、层粘连蛋白和III型前胶原。然后将肝脏分为三部分：（1）保存在10%福尔马林中进行组织学检查；（2） 在−70°C下冷冻用于Hyp分析；（3） 立即用于蛋白质和RNA分离。

胶原测定和纤维化组织学分级

将石蜡包埋的肝脏切片切割（5μm），并用苏木精-伊红、天狼星红和马森三色染色，以确定胶原蛋白的分布⁴¹宏观检查是由两名独立观察员盲目进行的。

Hyp含量测定

根据Hyp分析试剂盒的使用手册，采用分光光度法测定肝脏中的Hyp含量⁴²数据表示为Hyp（μg）/湿肝重量（g）。

酶联免疫吸附试验

人干扰素-γELISA试剂盒（DKW12-1000-096）购自中国深圳大科威。小鼠层粘连蛋白ELISA试剂盒（2900990015）购自伊顿生物科学公司（加利福尼亚州圣地亚哥）。小鼠III型前胶原N末端肽（CSB-E07928M）和透明质酸（CSB-E08121M）的ELISA试剂盒购自日本东京Cosmo Bio Co.，Ltd。

逆转录PCR和定量PCR

使用制造商描述的Tripure试剂（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）从小鼠肝组织或LX-2细胞中提取总RNA。使用0.5μg寡核苷酸（dT）通过反转录从2μg总RNA合成单标记cDNA₁₈底漆。PCR在94℃下进行30 s，58℃下进行1 min，72℃下进行1min。使用GAPDH RNA表达水平对数据进行标准化。定量PCR所用的引物见补充表3.

CUGBP1在LX-2细胞中的过度表达

用pCDNA3.1-CUGBP1（Genscript，7074764，中国南京）瞬时转染LX-2细胞，以检测CUGBP1的过度表达。转染24小时后，按指示处理细胞，并通过定量PCR进行评估。

免疫荧光细胞化学

用4%多聚甲醛（40分钟，室温），用以下抗体染色：抗CUGBP1（Santa Cruz Biotechnology，SC-20003，1:100），α-SMA（Santa Cruz Biotechnology，SC-32251，1:50），抗IFN-γ（Abcam，ab133566，1:200），并用第二抗体检测：与Alexa Fluor 594缀合的山羊抗小鼠IgG2a（Invitrogen，A-21135，1:1000），山羊抗鼠IgG1与Alexa Fluor 647结合（Invitrogen，A-21240，1:1000），山羊抗兔IgG结合Alexa Fluor 488（Invit罗gen，A-11008，1:100）。使用DAPI对盖玻片进行复染，并使用共焦激光扫描显微镜（奥林巴斯，成功湖，纽约）进行成像。考试是盲目进行的。

RNA干扰

对siRNA浓度为100 nM的细胞进行转染。根据制造商的建议，使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂（13778150）（Invitrogen，Carlsbad，CA）转染CUGBP1特异性siRNA（1299003）和非沉默siRNA（2935200）。

蛋白质印迹分析

在由50μM Tris-HCl、pH 8.0、50μM KCl、5μM DTT、1μM EDTA、0.1%SDS、0.5%Triton X-100和蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏，in）组成的裂解缓冲液中从肝组织或HSC细胞中提取蛋白质。提取的蛋白质通过聚丙烯酰胺SDS凝胶分离，并电泳转移到聚偏氟乙烯膜（Millipore，MA）上。在4°C的温度下，用指示的抗体在夜间对膜进行探测。western blot中使用的抗体为：ATF2（Abcam，ab32160，1:1000稀释）、pT-ATF2、CREB（Abcam，ab32515，1:1000稀释）、Lamin B（Abcan，ab133741，1:1000稀）和胶原蛋白-α1（I）（Abcam，ab138492，1:1000倍稀释）、Smad7（R&D Systems，MAB2029，1:1000稀释剂）、，CUGBP1（Santa Cruz Biotechnology，SC-20003，1:1000稀释）、pY-STAT1（Sanda Cruz biotechnoology，SC-8394，1:1000稀释）和α-SMA，pSmad2（细胞信号技术，8828，1:1000稀释）。然后将膜与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体一起孵育。使用LumiGLO化学发光底物系统（英国吉尔福德KPL）进行检测。使用Lab Works 4.0软件对相关表达进行密度测定，并根据β-微管蛋白、肌动蛋白或GAPDH的参考带进行计算。

统计分析

结果表示为平均值（s.e.m.）的平均值±s.e。由学生的统计评估t吨当只比较两个值集时进行检验，当数据涉及三个或更多组时进行单向方差分析，然后进行Dunnett检验。P（P）<0.05被认为是显著的。

我们感谢克利夫兰诊所基金会研究所的乔治·斯塔克博士提供了2fTGH和U3A细胞。我们感谢耶鲁大学的克拉拉·亚伯拉罕博士对这份手稿的批判性阅读。本研究得到了国家自然科学基金（Nos.81330079，81273569，81401292，81670553，81373466，91313303，81422050，91129728）、江苏省自然科学基金资助（BK20140614）。