肝病学。作者手稿；2017年12月1日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
PMCID公司：PMC5116014
尼姆斯：NIHMS811403标准
肝和星状细胞系中的HIV/HCV揭示了病毒和细胞类型之间的协同纤维化转录激活
,1 ,1 ,2 ,2 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,2和1
哈辛塔·福尔摩斯
1哈佛医学院马萨诸塞州总医院胃肠科
罗希特·金达尔
2哈佛医学院马萨诸塞总医院医学工程中心
希亚姆·S·贝尔
2哈佛医学院马萨诸塞总医院医学工程中心
辛西娅·布里萨克
1哈佛医学院马萨诸塞州总医院胃肠科
纳迪亚·阿拉特拉科奇
1哈佛医学院马萨诸塞州总医院胃肠科
安娜·利多夫斯基
1哈佛医学院马萨诸塞州总医院胃肠科
Dahlene N.Fusco公司
1哈佛医学院马萨诸塞州总医院胃肠科
埃斯佩兰斯·谢弗
1哈佛医学院马萨诸塞州总医院胃肠科
林文宇（Wenyu Lin）
1哈佛医学院马萨诸塞州总医院胃肠科
马丁·亚穆什
2哈佛医学院马萨诸塞总医院医学工程中心
1哈佛医学院马萨诸塞州总医院胃肠科
2哈佛医学院马萨诸塞总医院医学工程中心
摘要
HIV/HCV联合感染会加速进行性肝纤维化，但其机制尚不清楚。HCV和HIV在单细胞培养的肝细胞和肝星状细胞（HSC）中独立诱导促纤维化标记物TGFβ1（由活性氧物种（ROS）介导）和NFκB，但它们不能解释自然发生的细胞间串扰。我们创建了一个在体外建立共培养模型，研究HIV和HCV对肝纤维化的作用。在Huh7.5.1和LX2细胞中创建由功能性ROS（ARE）、NFκB和SMAD3启动子驱动的GFP报告细胞系，使用转座产生共培养。报告细胞系暴露于HIV、HCV或HIV/HCV。测量3条通路的激活情况，并根据感染状况进行比较。还测量了细胞外基质产物（Col1A1和TIMP1）。HCV和HIV通过ROS（ARE）、NFκB和SMAD3在共同培养的两种细胞系中独立激活TGFβ1信号。HIV/HCV共同暴露后，这些纤维化途径的激活是额外的。这一点在检测Col1A1和TIMP1时得到了证实，与单独检测两种病毒相比，HIV/HCV共同暴露后共同培养的LX2细胞中的mRNA和蛋白质水平显著升高。此外，与单细胞培养中的任何一种细胞类型相比，共培养模型中这些促纤维化基因的表达显著更高，表明Huh7.5.1和LX2细胞之间存在相互作用和反馈机制。我们的结论是，HIV通过ROS、NFκB和TGFβ1的上调，在肝细胞和HSC细胞系中加重了HCV驱动的促纤维化程序。此外，肝细胞和HSC细胞系的共同培养显著增加了Col1A1和TIMP1的表达。我们的新型共培养报告细胞模型为研究转录性纤维化反应提供了一个有效且更真实的系统，并可能为肝纤维化提供重要的见解。
关键词：HIV/HCV共同暴露、肝纤维化、TGFβ1、活性氧物种、NFκB/RelA、SMAD3、Col1A1、TIMP1、抗氧化反应元件、共培养
介绍
在美国大约100万感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的人中，30%的人由于共享传播途径而同时感染丙型肝炎病毒（HCV）[1]. 众所周知，丙型肝炎病毒的慢性感染与严重的肝脏相关发病率和死亡率有关。在高活性抗逆转录病毒治疗（HAART）时代，肝病现在是艾滋病感染者死亡的第三大原因，仅次于艾滋病相关原因和非艾滋病定义的癌症[1]. 与HCV单一感染相比，HIV合并HCV感染可加速HIV/HCV相关纤维化进展[2–4]. 在这种情况下，与丙型肝炎病毒相关的肝病迅速导致晚期纤维化或肝硬化患者的比例急剧上升，被推荐进行肝移植的合并感染患者数量增加，等待肝移植患者的等待死亡率上升，肝脏相关死亡率急剧上升[5].
肝纤维化是对慢性肝损伤的一种创伤愈合反应，导致细胞外基质（ECM）产物的积聚，包括胶原蛋白、纤维连接蛋白和蛋白聚糖。肝星状细胞（HSC）是ECM的主要来源，因此是肝脏内驱动肝纤维化形成的主要细胞类型[6]. 肝损伤后细胞因子转化生长因子β1（TGFβ1）的过度表达已被广泛证实。TGFβ1的诱导通过多种途径在多种细胞类型中发生，包括活性氧物种（ROS）、细胞外信号调节激酶（ERK）、Jun氨基末端激酶（JNK）和活化B细胞的核因子κ轻链增强子（NFκB）[7–9]. TGFβ1也能激活HSC[10]进而进一步上调TGFβ1的生成[11]诱导I型α1胶原（Col1A1）和金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）的表达，导致ECM沉积，导致肝纤维化[12].
HCV和HIV都可以分别通过实质细胞和非实质细胞在肝脏内感染。此前，我们已经证明，在感染HCV或HIV的肝细胞或HSC系的单一培养模型中，HCV和HIV各自通过诱导促纤维化细胞因子，如TGFβ1，促进纤维化发生[7]. 其他几个研究小组也证明丙型肝炎病毒可诱导线粒体氧化应激和活性氧[13–15]. 在一项后续研究中，我们发现HCV通过诱导ROS以及p38丝裂原活化蛋白激酶、JNK和ERK1/2依赖性途径上调TGFβ1[16]. 我们还发现ROS对TGFβ1的诱导是NFκB依赖性的[16].
与HCV在肝细胞内感染不同，HIV不能感染肝细胞。然而，最近的证据支持HIV能够通过趋化因子受体依赖机制感染HSC[17]. 此外，HIV-1还能够与半胱氨酸-X-半胱氨酸受体4（CXCR4）和趋化因子基序受体5（CCR5）相互作用并通过其发出信号，这两种受体是HIV进入所需的共受体，在HSC和肝细胞上都表达[18–20]. 此外，HIV感染可诱导氧化应激并上调TGFβ1的表达[17]. 因此，HIV-1可能直接或间接参与HIV/HCV联合感染患者的肝纤维化。虽然HIV本身及其包膜糖蛋白gp120都能增加TGFβ1水平，但它们也能增加HCV诱导的TGFβ2在HIV/HCV共同感染的感染性JFH1 HCV组织培养模型中的表达[17]. 此外，肝细胞和其他常驻肝细胞群产生的TGFβ1进一步上调肝细胞中HCV的复制，从而增强对HCV感染的反应[18].
此前，我们提供了证据表明，HIV和HCV通过诱导活性氧来调节ECM成分的产生和沉积，包括Col1A1和TIMP1，从而独立调节肝纤维化[7]. 这种调节在肝细胞和HSC中以NFκB依赖的方式发生。此外，我们已经证明，HIV/HCV共同暴露会增强这些促纤维化细胞因子的产生，从而导致肝细胞和HSC中Col1A1和TIMP1的表达增加。这些数据表明，与接触任何一种病毒相比，艾滋病毒和丙型肝炎病毒都有助于肝脏内几种细胞类型的肝纤维化形成，并且在艾滋病毒/丙型肝炎共同接触的情况下，艾滋病毒和HCV协同作用诱导肝纤维化形成。
细胞间的相互作用对许多器官系统的功能和反应至关重要，而肝脏是细胞类型之间相互作用至关重要的一个典型例子。由于缺乏足够的小动物模型来研究艾滋病毒/丙型肝炎病毒的共同感染，这一点更加复杂；黑猩猩是唯一支持艾滋病毒和丙型肝炎病毒感染的健壮动物模型，而这两种病毒的感染成本很高，许多人无法获得。因此，非常需要更真实地再现细胞培养系统体内HIV/HCV共同感染期间的肝脏环境，这也可以更广泛地应用于其他肝脏疾病。跨阱共培养系统能够以实时、高通量的方式评估特定细胞类型内的细胞间相互作用。了解细胞间相互作用如何调节或放大组织对病毒感染的反应，可以进一步了解加速肝脏疾病的复杂细胞过程，并确定可能适合治疗应用的新靶点。为了进一步探讨HIV和HCV协同刺激肝纤维化的机制，使用更接近于体内在肝脏环境下，我们开发了肝细胞和HSC的报告细胞系，并将其置于共同培养中。
材料和方法
细胞培养
我们使用Huh7.5.1细胞（由美国加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所Francis Chisari博士善意提供）进行实验，该细胞是Huh7人肝癌细胞的一个子系，对HCV复制具有高度的许可性[21]，LX2细胞–永生化人肝星状细胞[22]和293T人胚胎肾细胞。从HCV/HIV血清阴性供肝的非实质细胞部分分离出原代肝星状细胞（Triangle Research Labs，Durham，NC，USA）。如前所述隔离HSC[23]. 细胞培养在补充有10%胎牛血清（Mediatech，Manassas，VA，USA）、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素（Lonza/BioWhittaker，Walkersville，MD，USA，MD）的Dulbecco改良Eagle's培养基（Mediaech，Manasas，VA和USA）中，并在含有5%二氧化碳的湿空气中保持在37°C。
病毒库存
感染性JFH1基因型2a克隆[24]是Takaji Wakita博士慷慨捐赠的，用于制备细胞培养衍生的丙型肝炎病毒颗粒，如前所述[24]. HIV NL4-3病毒克隆是从拉贡研究所（MGH Harvard，Boston，MA，USA）获得的一种分子克隆的高度细胞病变CXCR4-热带病毒。HIV库存病毒的产生如前所述[25].
报告质粒的构建
如前所述，构建了三种主要通路的转录因子反应元件的报告质粒[26,27]. 第一个报告质粒是抗氧化反应元件（ARE，代表ROS反应），第二个是NFκB，第三个是SMAD3，代表TGFβ1反应。简而言之，慢病毒表达报告质粒均使用绿色荧光蛋白（copGFP）慢病毒载体（SBI，加州山景城，美国）生成。该载体包含copGFP基因上游的最小CMV启动子。ARE、NFκB和SMAD3的转录因子反应元件（TRE）序列分别为TTTGCTGAGTCACTGTGA、GGGACTTTCC和CAGACA。ARE、NFκB和SMAD3 TREs在计算与综合生物学中心（美国马萨诸塞州波士顿）合成。使用copGFP慢病毒载体中的EcoRI和SpeI限制位点亚克隆这些插入物。为了提高效率，构建了三个质粒，其中包含每个报告人的特异TRE的多个副本。质粒产生后，DNA序列得到验证。特异性转录因子与TRE的结合调节copGFP的表达。
慢病毒报告系统颗粒的制备
慢病毒报告系统颗粒如前所述生成[28]. 简而言之，293T细胞与包装载体psPAX2（Addgene质粒12260）、pRSV-REV（Addgene-plasm 12253）和pMD2.G（Addgeneplasm 122 59）共同转染产生慢病毒颗粒。在转染后48小时和72小时收集慢病毒上清液，通过0.45µm过滤器过滤，并在−80°C下进行校准和储存，直至进一步使用。
siRNA转染
使用Lipofectamine RNAiMAX试剂（Invitrogen）将siRNA转染到细胞中。Dharmacon On-Target Plus智能池人类siRNA（Fisher Scientific Life Science Research）用于基因敲除RelA（siRelA）、NRF2（siNRF2）、SMAD3（siSMAD3）和非靶向阴性对照（siNeg）。通过western blot证实每个基因敲除的蛋白质水平。
稳定报告细胞系的产生
这三个报告系统在含有8 mg/mL聚brene的情况下稳定转导到Huh7.5.1和LX2细胞系中4小时（Sigma Life Science and Biochemicals，St.Louis，MO，USA）。然后通过流式细胞术评估报告细胞系的基础GFP活性。选择GFP阴性细胞并进行分类以进行后续实验。48小时后，用适当的TRE诱导剂（ARE的叔丁基醌（tBHQ）、NFκB的TNFα和SMAD3的TGFβ1）刺激转导的报告细胞系48小时。GFP阳性细胞总数小于10%。因此，在再生医学与技术中心（MGH，波士顿，马萨诸塞州，美国）使用流式细胞术对这些GFP阳性细胞进行了阳性筛选和分类，从而使这个具有最低背景GFP活性的功能性GFP阳性人群得以扩大用于我们的研究。
报告细胞系的效率评估
通过测定GFP阳性细胞在适当诱导剂刺激下的数量来评估每个报告细胞系的效率。这是使用BD FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）使用流式细胞术进行的，计算为GFP阳性细胞总数的百分比和几何平均荧光强度（geoMFI）GFP阳性人群（报告为感染HCV、HIV或HIV/HCV后geoMFI与模拟治疗细胞相比的倍数变化）。使用Flowing软件（2.5.1版，芬兰图尔库生物技术中心）分析数据，并用荧光显微镜进行确认。简单地说，细胞在磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗，并用4%多聚甲醛在PBS中固定15分钟。固定后，细胞再次在PBS中清洗5分钟。然后用1:10000稀释的DAPI在PBS中培养报告细胞，并使用EVOS FL数字倒置荧光显微镜（美国纽约州格兰德岛Life technologies）评估GFP荧光。使用ImageJ v1.47（美国马里兰州贝塞斯达NIH）对GFP阳性细胞进行定量。使用Otsu方法计算最佳阈值，并计算放大倍数为40倍时每个高功率场中GFP阳性细胞的比例[29].
跨阱系统中Huh7.5.1和LX2细胞的共培养
建立了Huh7.5.1和LX2细胞的共培养跨阱系统()，允许通过多孔膜在细胞类型之间自由交换蛋白质（串扰），但仍允许对细胞类型进行分区，以便进行细胞特异性分析。共培养跨阱系统的制备如下：Huh7.5.1细胞在2×10512孔板中的细胞/孔，LX2细胞以1×10接种5放置在无细胞12孔板上的0.4µM跨孔板（Costar Corp.Kennebunk，ME，USA）。培养过夜后，将LX2接种的Transwell装载到含有Huh7.5.1的孔中。再过24小时后，用无血清培养基洗涤细胞。Huh7.5.1细胞与HSC的比率为2:1，以说明与HSC相比，Huh7.5-1细胞的细胞增殖速度更快，目的是在进行分析时达到10:1的比率[30]. 所有实验均一式三份。
共培养跨阱模型示意图将支持HCV感染的Huh7.5.1细胞接种到较大的底部跨孔中，将肝星状细胞（LX2）接种到较小的上部跨孔中。分隔两个微孔的膜具有0.4微米的多孔性，允许两种细胞类型之间的分泌分子自由交换。然后将HCV和/或HIV添加到培养基中，MOI为3。
MOI=感染的多重性
单培养和共培养细胞系的HCV和HIV暴露
细胞与HCV JFH1和/或HIV NL4-3病毒在37°C、含5%CO的湿空气中以3的感染倍数（MOI）孵育2在4小时的吸附期后，去除含有病毒的培养基，用PBS清洗细胞，并用新鲜的生长培养基再替换72小时，在此期间收集细胞的RNA和蛋白质。
定量RT-PCR
使用RNeasy Mini Kit（德国希尔登市齐根）从细胞中分离出总RNA。按照制造商的说明（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司），在逆转录酶反应中使用总共1µg提取的RNA，使用高容量cDNA逆转录试剂盒生成补充DNA（cDNA）。然后使用DyNAmo HS SYBR Green qPCR试剂盒（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA），使用1µl合成的cDNA，通过定量PCR测定CoL1A1和TIMP1 mRNA的表达。引物序列列于CoL1A1和TIMP1 mRNA表达归一化为GAPDH，以计算纤维化基因/GAPDH任意单位（折叠表达）。
表1
| 正向底漆 | 反向底漆 |
|---|
| CoL1A1公司 | ATGTTCAGCTTTTGTGGACCTC公司 | TTCGTCTTGGCCCTCACTT公司 |
| GAPDH公司 | ACCTTCCCACATGGTGTCTGA公司 | GCTCCTCCTGTTCGACAGTCA公司 |
| TIMP1公司 | ACTTCCAAGGTCCCACAAC公司 | ACTTCCAAGGTCCCACAAC公司 |
| JFH-1型 | TCTGCGGAACCGTGAGTA公司 | TCAGGCAGTACCACAAGGC公司 |
蛋白质定量（Western Blot）
使用NuPAGE Novex Bis-Tris预制的4~12%梯度凝胶（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离全细胞裂解液中的蛋白质，并转移到硝化纤维素膜。一级抗体抗肌动蛋白（小鼠mAB；西格玛生命科学和生物化学）、抗TIMP1（兔pAB；细胞信号技术公司，美国马萨诸塞州丹佛市）、抗CoL1A1（兔pAB；赛默费希尔，伊利诺伊州罗克福德市，美国）、磷酸化和非磷酸化NFκB（RelA）（兔pAB；细胞信号科技公司，美国马州丹弗市）、，将磷酸化NRF2（兔mAB；abcam，剑桥，马萨诸塞州，美国）、未磷酸化NRF2（兔pAB；abcam）和磷酸化和未磷酸化SMAD3（兔mAB；细胞信号技术公司）在4°C下孵育过夜。二级抗体、抗鼠IgG（Donkey mAB；amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA）和抗兔IgG。
统计分析
使用GraphPad Prism v6（美国加利福尼亚州拉霍亚）和Microsoft Excel 2013进行统计分析。连续数据以中位数+四分位间距表示，并使用Mann-Whitney U检验进行比较，结果被认为是显著的，P<0.05。使用ImageJ软件对蛋白质印迹进行定量分析，并将其归一化为β-肌动蛋白。给出了三个独立实验的平均值加上平均值的标准误差。
结果
表达功能性ARE、NFκB或SMAD3驱动报告基因的稳定细胞系的产生
三种报告细胞系的效率
刺激后，在所有三个转导的报告细胞系中观察到GFP信号增加。在Huh7.5.1细胞中，用适当的刺激物刺激后，ARE、NFκB和SMAD3的GFP阳性细胞百分比分别为44.4%、76.7%和59.1%(). 同样，在LX2转导的报告细胞系中，刺激后GFP信号增加（ARE为83.1%，NFκB为68.5%，SMAD3为86.6%）(). 报告细胞系也使用荧光显微镜进行了测试，在刺激所有报告细胞系后发现GFP荧光信号激活的效率相似().
报告细胞系的效率使用（A）流式细胞术和（B）荧光显微镜检测新生成的Huh7.5.1和LX2报告细胞系在刺激后对ARE、NFκB和SMAD3的效率。在用适当的刺激物刺激48小时后（tBHQ用于ARE，TNFα用于NFκB，TGFβ1用于SMAD3），通过流式细胞术和荧光显微镜测量，与模拟处理的细胞相比，GFP阳性细胞的数量显著增加。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（C） NRF2、RelA和SMAD3 siRNA预处理显著降低了tHBQ、TNFα和TGFβ对报告细胞系（LX2和Huh7.5.1）的影响。用siRNA转染报告细胞系。转染后48小时，用适当的刺激物刺激细胞48小时。流式细胞术检测细胞。siRNA预处理显著降低了刺激后GFP阳性细胞的百分比。
ARE=抗氧化反应元件；tBHQ公司=第三种-丁基对苯二酚；NFκB=核因子-κB；TNFα=肿瘤坏死因子α；SMAD3=SMAD家族成员3；TGFβ1=转化生长因子β1。
然后，我们证明了我们可以通过使用siRNA在合适的刺激物刺激后有效地阻断转录反应元件的下游激活。我们使用NRF2 siRNA作为ARE报告子，RelA siRNA作为NFκB报告子，SMAD3 siRNA作为SMAD3报告子。siRNA转染后GFP阳性细胞的百分比显著降低（ARE为26.8%，NFκB为9.4%，SMAD3为20.4%）(). 同样，在LX2报告细胞系中，经siRNA预处理后GFP阳性细胞显著减少（ARE为14.7%，NFκB为14.1%，SMAD3为17.9%）()证实了这些报告细胞系的效率。
新型transwell报告者共同培养模型的验证
与HIV共同暴露可增强HCV对ARE应答基因的诱导
活性氧诱导NRF2磷酸化，进而驱动抗氧化基因的ARE依赖性转录。以更真实的方式更充分地剖析HCV和HIV之间的关系在体外系统中，我们探索了与HIV共同暴露可能会增加HCV相关的纤维化，但需要肝脏内细胞之间的相互对话才能完全激活这些纤维化前通路。首先，我们验证了我们的新报告人共培养模型，其中Huh7.5.1和LX2细胞通过跨阱分离，如这种配置有助于两种细胞类型之间的通信，同时也允许恢复单独的细胞类型以进行进一步的单独分析。为了证实HCV和HIV在我们的共培养报告子模型系统中的协同作用，我们首先评估了在含有ROS调节ARE报告子的肝细胞和HSC细胞系中ARE反应基因的诱导。将这些细胞系共培养并暴露于HIV、HCV和HIV/HCV。
通过GFP阳性细胞的百分比测量，与Huh7.5.1细胞中的模拟感染相比，HCV单感染显著诱导了ARE（HCV和模拟感染的GFP阳性细胞分别为37%和15.5%，P＜0.005；)GFP信号的geoMFI（HCV和模拟感染的诱导率分别为1.5倍和1倍，P<0.005；)通过Western blot检测ARE调节的转录因子磷蛋白-NRF2（P-NRF2）的数量(). 与模拟感染相比，暴露于HCV后的LX2细胞也发现了类似的结果（GFP阳性细胞百分比测量的ARE激活率为30%对5.2%；GFP信号的geoMFI为1.5倍对1倍；Western blot；). 与GFP阳性细胞比例显著较高（22%对15.6%，P<0.05）、geoMFI较高（1.2倍对1倍，P<0.05(). 然而，与模拟处理细胞相比，HIV暴露后的LX2细胞没有显著差异().
模拟治疗、HCV暴露、HIV暴露和HIV/HCV共同暴露72小时后在LX2细胞和Huh7.5.1细胞中诱导ARE应答基因用流式细胞术（A）GFP阳性细胞百分率测定ARE反应基因的激活；（B） 流式细胞术检测GFP阳性细胞的geoMFI；和（C）磷酸化NRF2。C部分的上面板显示磷酸化NRF2（P-NRF2）、总NRF2和β肌动蛋白蛋白水平的代表性蛋白质印迹。C部分的下面板描述了暴露于HCV和/或HIV 72小时后P-NRF2与总NRF2比率的密度测定量化。
*P<0.05
**P<0.005
HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒；GFP=绿色荧光蛋白；geoMFI=几何荧光强度；ARE=抗氧化反应元件；P-NRF2=磷酸化NRF2
Hh7.5.1细胞与HCV/HIV共培养时，ARE激活程度最高，其中GFP阳性细胞百分比最高（41.6%，P<0.05），GFP信号强度geoMFI最高（1.8倍诱导，P<0.005），P-NRF2诱导最大()验证了我们之前在单一培养模型中的发现。在与Huh7.5.1细胞共同培养的LX2细胞中观察到类似的趋势().
HCV和HIV在共培养模型中协同诱导NFκB应答基因
NFκB是一种调节多种促炎基因表达的转录因子[31]在肝纤维化形成中也起着重要作用[32]. 我们之前已经证明HCV和HIV通过NFκB诱导独立调节纤维化[7].
因此，我们在我们的共培养模型系统中评估了NFκB报告细胞。再次，我们验证了HCV或HIV单次暴露与两种细胞系的模拟治疗相比显著诱导NFκB活化(). 当考虑到所有测试参数时，可以观察到这一点：在LX2细胞中GFP阳性细胞的百分比（HCV和模拟治疗分别为42.5%和1.5%；在Huh7.5.1细胞中HCV和模仿治疗分别为37%和7.5%；)GFP信号强度（在LX2细胞中，HCV和模拟治疗分别为2.2倍和1倍，P<0.05；在Huh7.5.1细胞中，丙型肝炎病毒和模拟治疗则分别为3.0倍和1倍数，P<0.05）；)和磷酸化RelA（P-RelA）的数量，这是NFκB复合物的一个亚单位(). 正如预期的那样，HIV/HCV共同暴露对报告人共同培养模型系统中NFκB应答基因的诱导具有加性效应，特别是在LX2细胞中，这证实了与HCV或HIV单独感染相比，HIV和HCV共同接触诱导NFκ）B应答基因更大程度().
模拟治疗、HCV暴露、HIV暴露和HIV/HCV共同暴露72小时后，与HCV和HIV共同暴露在LX2细胞和Huh7.5.1细胞中诱导NFκB应答基因NFκB应答基因的诱导通过流式细胞术测定GFP阳性细胞的百分比（A）；（B） 通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的geoMFI；和（C）磷酸化的RelA。C部分的上部面板显示磷酸化RelA、总RelA和βActin蛋白水平的代表性蛋白质印迹。C部分的下面板描述了暴露于HCV和/或HIV 72小时后P-RelA与总RelA比率的密度测定量化。
*P<0.05
HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒；GFP=绿色荧光蛋白；geoMFI=几何荧光强度；P-RelA=磷酸化RelA
在我们的新型报告人共培养模型中，HIV增强了SMAD3应答基因对HCV的诱导作用
接下来，我们在共培养模型中验证了我们的SMAD3 GFP报告细胞系，该细胞系评估TGFβ1应答基因的变化。HCV和HIV单次暴露均激活了两种细胞系中的TGFβ1，GFP阳性细胞百分比增加证明了这一点（HCV和模拟暴露在Huh7.5.1细胞中分别为32.8%和12.6%，LX2细胞中分别是28.3%和3.7%，P<0.05；)GFP信号的geoMFI（HCV和模拟暴露在Huh7.5.1细胞中分别为1.5倍和1倍，LX2细胞中分别是1.6倍和1倍数；)和磷酸化SMAD3(). 再次，我们证实，与单独接触两种病毒相比，HIV/HCV共同接触显著增加了报告者共同培养模型中TGFβ1的激活。正如所料，GFP阳性细胞百分比最高（LX2和Huh7.5.1分别为44.2%和59%，p<0.05），GFP信号的geoMFI最高（LX2和Huh7.5.1分别为2.2倍和2.3倍，p<0.005；).
在模拟治疗、HCV暴露、HIV暴露和HIV/HCV共同暴露72小时后，HIV增强了共同培养模型中SMAD3应答基因的HCV诱导。流式细胞术检测SMAD3应答基因激活率（A）GFP阳性细胞百分率；（B） 流式细胞术检测GFP阳性细胞的geoMFI；和（C）磷酸化SMAD3。C部分的上面板显示了磷酸化SMAD3、总SMAD3和β肌动蛋白蛋白水平的代表性蛋白质印迹。C部分的下面板描述了暴露于HCV和/或HIV 72小时后P-SMAD3与总SMAD3之比的密度测定量化。
*P<0.05
HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒；GFP=绿色荧光蛋白；geoMFI=几何荧光强度；P-SMAD3=磷酸化SMAD3
HIV/HCV共同暴露在共同培养模式中额外促进ECM生产
我们之前已经证明，在单细胞培养中，HIV增加了HSC和Huh7.5.1细胞系中CoL1A1和TIMP1的表达，并且HCV的添加进一步增加了这些ECM产物的表达[7]. 这两种病毒在诱导这些纤维生成基因产物方面的加性效应可能是在HIV/HCV联合感染患者中观察到的更具侵袭性疾病表型的基础。然而，这些数据是在单细胞培养系统中生成的，不能准确反映多细胞人类体内肝脏环境，因此不考虑可能由细胞类型之间的自然串扰引起的基因激活变化。
因此，我们试图评估在HIV和/或HCV感染背景下我们的新型报告者共培养模型中ECM产物COL1A1和TIMP1激活的差异，并直接将这些结果与我们以前的单培养模型进行比较。
单一文化模式
在LX2细胞或Huh7.5.1细胞的单细胞培养中，我们再次发现HIV和HCV分别诱导每个细胞系中CoL1A1和TIMP1的mRNA表达（2.0至4.0倍诱导，P<0.05；).
诱导（A）CoL1A1 mRNA表达的比较；（B） TIMP1 mRNA表达；（C） CoL1A1和TIMP1蛋白水平。C部分的上面板显示了暴露于HCV和/或HIV感染72小时后，LX2和Huh7.5.1细胞中CoL1A1和TIMP1细胞内蛋白水平的典型western blot。C部分的下面板显示了暴露于HCV和/或HIV 72小时后，归一化CoL1A1和TIMP1蛋白水平对β-肌动蛋白的密度定量；（D） 单细胞培养和与Huh7.5.1细胞共培养pHSC中CoL1A1和TIMP1 mRNA表达诱导的比较。
*P<0.05
**P<0.005
CoL1A1=胶原蛋白，I型，α1；TIMP1=金属蛋白酶组织抑制剂-1；HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒
与单独感染HIV相比，HIV/HCV共同暴露在单细胞培养的LX2和Huh7.5.1报告细胞中导致CoL1A1 mRNA的诱导显著增强（HIV/HCV-共同暴露诱导为3.5倍和3.6倍，而LX2与Huh7.5.1HIV单独暴露诱导为2.1倍和2.3倍，p<0.05；). 与HCV单一暴露相比，HIV/HCV联合暴露也显著增加了LX2细胞中CoL1A1的表达（3.5倍vs 2.2倍，p<0.005；). 相反，与HCV单次接触相比，HIV/HCV联合接触后Huh7.5.1细胞中CoL1A1 mRNA表达没有进一步增加().
与HCV感染相比，HIV暴露对刺激Huh7.5.1细胞中TIMP1 mRNA表达的影响较弱（1.4倍vs.3.7倍；).
在单细胞培养中，HCV和HIV暴露均上调LX2和Huh7.5.1报告细胞系中TIMP1的表达(). 然而，在LX2中与HIV/HCV共同暴露似乎没有进一步诱导单一培养中TIMP1的表达（0.5倍诱导；).
共同文化模式
然后，我们在相同的实验条件下评估了我们的共培养模型，以确定与Huh7.5.1细胞共培养的LX2细胞之间的合作串扰是否改变了与单一暴露模型系统相比，HCV、HIV和HIV/HCV共暴露后诱导的前纤维化ECM标记物CoL1A1和TIMP1的程度。
我们再次发现，HCV和HIV单次暴露均上调了共同培养的LX2和Huh7.5.1报告细胞系中CoL1A1和TIMP1 mRNA的表达（LX2与Huh7.5.1HCV和艾滋病毒暴露分别为3.9–4.2倍和1.1–3.0倍，P<0.05；). 虽然在Huh7.5.1和LX2中，与HIV和HCV共同培养和共同暴露并没有持续增加Huh7.5.1.中这些ECM产物的mRNA诱导，但我们观察到与Huh7.5-1细胞共同培养的LX2细胞中的两种前纤维化ECM标记物均显著上调，而在单培养的LX2报告细胞中观察到这两种标记物的上调。HIV/HCV共同暴露后，与Huh7.5.1细胞共同培养的LX2细胞中CoL1A1 mRNA表达增加了4.4倍，而单细胞培养的LX2细胞中仅增加了3.5倍（P<0.05；). TIMP1 mRNA表达的结果更为显著，在与Huh7.5.1细胞共同培养的LX2细胞中的诱导倍数为5.3倍，而在先前的单细胞培养模型中LX2的诱导倍数是3.0倍（p<0.005；). 然后，与之前的LX2细胞单细胞培养模型相比，我们证实了HIV/HCV联合暴露对我们新的共培养模型中总细胞裂解物中CoL1A1和TIMP1蛋白水平的影响(). 因此，这些数据强烈强调了HSC中纤维化前通路的协同激活在HCV和HIV相关肝纤维化发病机制中的重要性。
为了验证我们的发现，我们在从健康HIV/HCV血清阴性的人类肝脏捐赠者分离的原发性HSC（pHSC）中进行了相同的实验。pHSC在单培养或跨孔共培养系统中与Huh7.5.1细胞一起培养并暴露于HCV和/或HIV 72小时。在单培养和共培养模型中，暴露于HCV和/或HIV后，pHSC激活标记物Col1A1和TIMP1 mRNA表达显著增加（2至6倍诱导；p<0.05；). 正如在LX2细胞系中观察到的那样，与Huh7.5.1细胞共同培养的pHSC中，这些纤维化前标志物的表达显著高于单一培养的pHSE（p<0.05；). 这些数据验证了我们在报告细胞系共培养模型中的发现，表明pHSC前纤维化标记物的激活程度更高在体外与单独感染两种病毒相比，这两种病毒在激活这些途径方面都是相加的，可能有助于HCV/HIV复合感染中的加速纤维化。
HIV增加Huh7.5.1细胞对HCV感染的耐受性
已经证实JFH1感染Huh7.5.1细胞，但不感染HSC。然而，尽管HSC没有被HCV直接感染，但包括HSC在内的肝脏非实质细胞可能在维持正常肝细胞功能方面发挥核心作用。此外，在体外暴露于HIV包膜蛋白gp120会使HCV在肝细胞中的复制增加2-3倍。我们之前已经表明，HIV对两种主要的肝细胞类型（肝细胞和造血干细胞）有直接和间接的影响，导致HCV复制增加[7]. 然而，由于这些研究是在单一培养模型中进行的，因此尚不清楚细胞串扰对共培养细胞的贡献及其对HCV允许性的可能影响。
为了确定在HIV/HCV共同暴露后，LX2细胞与Huh7.5.1细胞共同培养的模型中是否进一步改变HCV耐受性，我们用HCV（JFH1）单独感染两组共同培养的细胞，或HCV与HIV共同培养72小时。我们在Huh7.5.1细胞单细胞培养中进行了平行实验。
在单细胞培养中，我们观察到与HCV单独培养相比，与HIV和HCV共同培养的Huh7.5.1细胞中HCV RNA显著增加（1.7倍对1倍，P<0.005；). 与单独感染HCV相比，在HIV/HCV联合感染中通过Western blot检测到的细胞内HCV核心增加2.5倍也证实了这一点().
在单培养和共培养模型中，HIV增加了Huh7.5.1细胞对HCV感染的耐受性，但在共培养模型下，HCV耐受性进一步增加HCV耐受性通过（A）细胞内HCV RNA水平（RT-PCR）和（B）HCV核心蛋白水平（western blot）测定。B部分的上面板显示了Huh7.5.1细胞内HCV核心蛋白水平的典型western blot。B部分的下面板显示了归一化HCV核心蛋白水平到β-肌动蛋白的密度定量，其中HCV单感染单培养被视为1倍变化。Huh7.5.1细胞在单培养或在跨孔共培养系统中添加LX2报告细胞系的情况下暴露于HCV和/或HIV 72小时。
HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒
在共培养模型中，当单独接触HCV时，我们发现与LX2细胞共培养的Huh7.5.1细胞中HCV感染的可能性更大（HCV RNA水平增加1.8倍；)HCV核心数量（增加3.0倍；). 此外，与Huh7.5.1单培养模型相比，与HIV和HCV共同暴露进一步提高了共培养模型中HCV的耐受性（HCV RNA增加3.2倍，HCV核心蛋白增加3.7倍；). 这些数据表明，HIV改变并增加了Huh7.5.1细胞对HCV感染的耐受性，并进一步强调了共同培养模式在为HIV/HCV共同暴露的疾病发病机制提供更丰富背景方面的重要性。
讨论
HCV联合感染在HIV感染者中高度流行，并与由加速纤维化进展驱动的更具侵略性的肝病表型相关。这反映在最近的研究中，这些研究表明，肝病现在是后HAART时代艾滋病毒感染者的第三大死亡原因。目前，除了解决肝脏疾病的根本原因外，没有任何治疗方法可以阻止或逆转肝纤维化。尽管HIV和最近HCV的治疗前景随着时间的推移而显著改善，但这些治疗可能仍无法有效逆转HIV/HCV合并感染患者的肝脏疾病自然史，这些患者已形成明显的纤维化或肝硬化。因此，人们一直致力于了解这些患者的肝纤维化发生和纤维化进展，以确定潜在的新干预方法。
在我们之前的单细胞培养研究中，我们证明了HIV、HCV和HIV/HCV共同暴露导致ROS、TGFβ1和NFκB的诱导。与接触HIV或HCV相比，在HIV/HCV共同接触的环境中，这些纤维化途径的激活更大。然而，由于这些研究是在单细胞培养模型中进行的，因此他们没有考虑到由细胞亚群之间的串扰介导的这些通路的进一步调节。因此，这些模型并没有忠实地再现体内肝脏环境，因此在解释这些数据时必须谨慎。
为了更准确地剖析HIV、HCV和HIV/HCV感染对肝纤维化形成的机制性贡献，我们创建了一个新的、可重复的在体外记者共同文化模式。我们为与肝脏内被HIV和HCV激活的两种主要细胞类型中的肝纤维化相关的关键假设转录因子通路的反应元件生成了报告质粒；Huh7.5.1细胞（支持HCV感染并由HIV发出信号）和LX2 HSC（由HIV和HCV发出信号）。该共培养模型采用跨阱方法，允许细胞间通信，从而可以评估细胞类型之间的串扰在与HIV或HCV接触以及与HIV/HCV共同接触的情况下对纤维化前通路（ARE（ROS）、NFκB和SMAD3）激活的贡献。此外，跨阱方法允许对细胞类型进行分区，以便进行细胞特异性分析，但仍允许在细胞类型之间自由交换分泌因子。
使用这种共培养系统，我们证实HIV和HCV暴露都会诱导氧化应激，从而在多细胞环境中上调TGFβ1的表达并诱导NFκB反应基因。我们再次观察到，与单独感染HIV或HCV相比，在HIV/HCV共同暴露的情况下，这些纤维化途径的诱导作用更强。然而，当与旧的单一培养模型相比时，我们发现在共培养模型中，LX2细胞中ECM基因COL1A1和TIMP1的上调更大。这些数据不仅证实了HIV/HCV共同暴露对肝纤维化的加性作用，而且证明了Huh7.5.1和LX2细胞之间发生串扰，并导致LX2细胞中促纤维化途径的进一步激活。这些数据支持我们的共培养报告者模型系统是一种有效的方法，可以剖析肝纤维化前通路的转录激活，并证实与模拟暴露相比，HCV和HIV在两种报告细胞系中显著诱导了这些通路。因此，我们的数据强烈强调了共培养模型系统在HCV、HIV或HIV/HCV暴露背景下评估肝纤维化的关键重要性，以便更准确地研究和模拟体内了解肝病的发病机制。我们的数据也验证了我们之前在单细胞培养系统中的发现，并证明HIV和HCV在共同培养中驱动TGFβ1原纤维途径方面具有相加效应。
与以前的单一培养模式相比，这种新型的共同培养报告系统具有一些优势。使用跨阱方法，可以研究两种不同的细胞系，另外一个好处是聚酯膜允许两种细胞类型之间的串扰，因为它们仍然被分隔开来，它们可以单独进行分离和分析，这两种方法在单培养或条件培养基模型中都不可能实现。此外，跨阱方法允许在不受其他细胞类型污染的情况下播种纯细胞群体，就像percoll密度梯度细胞分数分离可能发生的情况一样，如果FACS分类不可用，则该方法简单易用。因此，有可能更深入地研究以前不可能的HIV/HCV相关肝病发病机制的关键驱动因素的相对作用。此外，在每个细胞系中引入稳定的荧光报告体，可以直接对HIV、HCV和HIV/HCV感染激活的相关纤维化前途径（ARE（ROS）、TGFβ1和NFκB）的转录激活进行活细胞分析。诱导程度可以通过流式细胞术或荧光显微镜进行评估和量化。然而，由于跨阱系统本身的阻抗以及与培养基相关的背景荧光，后者可能会受到部分限制。对在体外研究肝病发病机制的模型可能反过来确定新的靶点或治疗途径，这些靶点或途径有可能改变疾病进展，并提供一个更现实的系统来评估HAART治疗在在体外上下文。由于肝纤维化是导致肝硬化的常见途径，而与肝病的病因无关，因此这种新型报告者共培养模型系统的应用范围超出了病毒性肝炎和HIV肝病的发病机制。此外，共培养模型可以适应包括其他感兴趣的细胞类型，包括巨噬细胞细胞系，因此有潜力更准确地模拟体内条件。此外，这种新的共培养模型可用于更准确地研究药物代谢和毒性。
虽然首选原电池来更准确地模拟体内选择Huh7.5.1和LX2细胞来测试我们的共培养模型系统有几个原因，包括HCV感染的许可有限和基于供体来源的PHH的遗传异质性。然而，有可能调整我们的共同培养模型，将PHH与主要HSC结合起来，以评估非病毒性疾病。此外，已开发出从诱导多能干细胞中生成肝细胞样细胞的技术，并显示出作为研究在我们的共培养模型中易于替代的嗜肝病毒的优良细胞系的巨大前景。
总之，我们已经表明，肝细胞和星状细胞中HIV/HCV的共同暴露揭示了纤维化前通路的协同转录激活。我们还显示了肝细胞类型之间的相互对话对于最大限度地激活这些肝纤维化途径的重要性，与HSC单细胞培养相比，当肝细胞和HSC共同培养时观察到的增强的肝纤维化反应突出了这一点。因此，我们新颖、可重复且易于使用的共培养模型为研究肝纤维化提供了更真实的细胞培养系统，并能够评估细胞特异性反应在驱动HIV/HCV相关肝病中的作用。此外，我们的共同培养模型具有更广泛的适用性，超出了HIV/HCV相关肝病发病机制的范围，并可适用于包括其他感兴趣的细胞和疾病，因此有可能揭示肝病发病机理的新见解，从而有助于新的治疗发展。
致谢
我们感谢这些研究人员和机构提供以下信息：Ralf Bartenschlager博士和Takaji Wakita（传染性HCV病毒JFH-1 DNA构建）；Francis Chisari博士（Huh7.5.1细胞系）；Scott L.Friedman博士（HSC LX-2细胞）。我们还要感谢Todd Allen博士（美国马萨诸塞州波士顿MGH哈佛拉贡研究所）提供了通过NIH艾滋病研究和参考试剂项目获得的HIV NL4-3病毒克隆。
资金来源：NIH DK098079（RTC）、DK108370（RTC
缩写
| 艾滋病 | 获得性免疫缺陷综合征 |
| 是 | 抗氧化反应元件 |
| CCR5号机组 | 趋化因子基序受体5 |
| cDNA | 互补DNA |
| CXCR4系列 | 半胱氨酸-X-半胱氨酸受体4 |
| 第1A1列 | 胶原蛋白1型α1 |
| 发动机控制模块 | 细胞外基质 |
| ERK公司 | 细胞外信号调节激酶 |
| GFP公司 | 绿色荧光蛋白 |
| HAART公司 | 高效抗逆转录病毒治疗 |
| 丙型肝炎病毒 | 丙型肝炎病毒 |
| 艾滋病咨询门诊 | 人类免疫缺陷病毒 |
| 高速列车 | 肝星状细胞 |
| JNK公司 | jun氨基末端激酶（JNK） |
| 内政部 | 感染的多重性 |
| 核因子κB | 活化B细胞的核因子-κ-轻链增强子 |
| P-NRF2型 | 磷酸化NRF2 |
| P-RelA公司 | 磷酸化RelA |
| 第PAGE页 | SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| PHH公司 | 原代人肝细胞 |
| pHSC公司 | 原代肝星状细胞 |
| ROS公司 | 活性氧物种 |
| tBHQ公司 | 叔丁基醌 |
| 转化生长因子β1 | 转化生长因子β-1 |
| TIMP1公司 | 金属蛋白酶组织抑制剂1 |
| TRE公司 | 转录因子反应元件 |
工具书类
1Smith CJ、Ryom L、Weber R、Morlat P、Pradier C等。1999年至2011年艾滋病毒感染者潜在死亡原因趋势（D:A:D）：一项多部门合作。柳叶刀。2014;384:241–248.[公共医学][谷歌学者] 2Thein HH，Yi Q，Dore GJ，Krahn MD。慢性丙型肝炎病毒感染阶段特异性纤维化进展率的评估：荟萃分析和元回归。肝病学。2008;48:418–431.[公共医学][谷歌学者] 三。Kim AY，Chung RT。HIV-1和HCV的共同感染——一拳两拳。胃肠病学。2009;137:795–814. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4.Chen JY，Feeney ER，Chung RT.HCV和HIV共同感染：机制和管理。Nat Rev胃肠肝素。2014;11:362–371. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Ly KN、Xing J、Klevens RM、Jiles RB、Ward JW等。1999年至2007年间美国病毒性肝炎死亡率的增加负担。Ann医学实习生。2012;156:271–278.[公共医学][谷歌学者] 6Hernandez-Gea V，Friedman SL.肝纤维化的发病机制。《病理学年鉴》。2011;6:425–456.[公共医学][谷歌学者] 7Lin W，Wu G，Li S，Weinberg EM，Kumthip K，等。HIV和HCV通过诱导活性氧和NFkappaB协同促进肝纤维化。生物化学杂志。2011;286:2665–2674. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Bakin AV、Rinehart C、Tomlinson AK、Arteaga CL。p38丝裂原活化蛋白激酶是TGFβ介导的成纤维细胞转分化和细胞迁移所必需的。细胞科学杂志。2002;115:3193–3206.[公共医学][谷歌学者] 9.Thein HH，Yi Q，Dore GJ，Krahn MD。HIV感染者丙型肝炎病毒感染的自然史和高效抗逆转录病毒治疗时代HIV的影响：一项荟萃分析。艾滋病。2008;22:1979–1991.[公共医学][谷歌学者] 10.Zhan SS，Jiang JX，Wu J，Halsted C，Friedman SL，等。肝星状细胞吞噬凋亡小体诱导NADPH氧化酶，并与体内肝纤维化相关。肝病学。2006;43:435–443.[公共医学][谷歌学者] 11Canbay A、Feldstein AE、Higuchi H、Werneburg N、Grambihler A等。枯否细胞吞噬凋亡小体刺激死亡配体和细胞因子表达。肝病学。2003;38:1188–1198.[公共医学][谷歌学者] 12.Wang K，Lin B，Brems JJ，Gamelli RL。肝细胞凋亡通过TIMP1途径调节肝纤维化。细胞凋亡。2013;18:566–577.[公共医学][谷歌学者] 13.Korenaga M、Wang T、Li Y、Showalter LA、Chan T等。丙型肝炎病毒核心蛋白抑制线粒体电子传递并增加活性氧（ROS）的产生。生物化学杂志。2005;280:37481–37488.[公共医学][谷歌学者] 14Li Y，Boehning DF，Qian T，Popov VL，Weinman SA。丙型肝炎病毒核心蛋白通过刺激Ca2+单转运蛋白活性增加线粒体ROS生成。美国财务会计准则委员会J。2007;21:2474–2485.[公共医学][谷歌学者] 15Okuda M、Li K、Beard MR、Showalter LA、Scholle F等。丙型肝炎病毒核心蛋白诱导线粒体损伤、氧化应激和抗氧化基因表达。胃肠病学。2002;122:366–375.[公共医学][谷歌学者] 16Lin W，Tsai WL，Shao RX，Wu G，Peng LF，等。丙型肝炎病毒通过以核因子-κB依赖性方式产生活性氧来调节转化生长因子β1的产生。胃肠病学。2010;138:2509–2518. 2518，e2501。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17.Tuyama AC、Hong F、Saiman Y、Wang C、Ozkok D等。人类免疫缺陷病毒（HIV）-1感染人类肝星状细胞并促进I型胶原和单核细胞趋化蛋白-1的表达：对HIV/C型肝炎病毒诱导肝纤维化发病机制的影响。肝病学。2010;52:612–622. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Lin W，Weinberg EM，Tai AW，Peng LF，Brockman MA，等。HIV以TGF-β依赖性方式增加HCV复制。胃肠病学。2008;134:803–811.[公共医学][谷歌学者] 19.Rotman Y，Liang TJ。丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒的联合感染：病毒学、免疫学和临床结果。《维罗尔杂志》。2009;83:7366–7374. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Bruno R、Galastri S、Sacchi P、Cima S、Caligiuri A等。gp120调节人类肝星状细胞的生物学：HIV感染与肝纤维化之间的联系。内脏。2010;59:513–520.[公共医学][谷歌学者] 21Zhong J，Gastaminza P，Cheng G，Kapadia S，Kato T等。体外丙型肝炎病毒感染。美国国家科学院院刊。2005;102:9294–9299. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Xu L，Hui AY，Albanis E，Arthur MJ，O'Byrne SM，等。人肝星状细胞系，LX-1和LX-2：肝纤维化分析的新工具。内脏。2005;54:142–151. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Kitani H、Takenouchi T、Sato M、Yoshioka M、Yamanaka N。从成人肝细胞混合原代培养物中分离巨噬细胞的简单有效方法。J签证费用。2011 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Wakita T、Pietschmann T、Kato T、Date T、Miyamoto M等。从克隆病毒基因组组织培养中产生传染性丙型肝炎病毒。自然医学。2005;11:791–796. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Pedroza-Martins L，Gurney KB，Torbett BE，Uittenbogaart CH.人类免疫缺陷病毒1型分离株在胸腺细胞中的向性差异和复制动力学：共受体表达允许病毒进入，但不同亚群的生产性感染是在进入后水平确定的。《维罗尔杂志》。1998;72:9441–9452. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Janorkar AV，King KR，Megeed Z，Yarmush ML.使用肝细胞衍生报告细胞建立肝脂肪变性的体外细胞培养模型。生物技术生物工程。2009;102:1466–1474. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Wieder KJ、King KR、Thompson DM、Zia C、Yarmush ML等。微流体装置中表达谱分析报告细胞的优化。生物微器件。2005;7:213–222.[公共医学][谷歌学者] 28Salloum S、Wang H、Ferguson C、Parton RG、Tai AW.Rab18与丙型肝炎病毒NS5A结合，并促进病毒复制位点与脂滴之间的相互作用。《公共科学图书馆·病理学》。2013;9：e1003513。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29廖PS，陈TS，钟PC。多级阈值快速算法。信息科学与工程杂志。2001;17:713–727. [谷歌学者] 30.Narmada BC，Kang Y，Venkatraman L，Peng Q，Sakban RB，等。肝星状细胞靶向输送肝细胞生长因子转基因通过胆道输注增强其在纤维化灶的表达，以逆转二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化。人类基因治疗。2013;24:508–519. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Oeckinghaus A，Ghosh S.转录因子NF-kappaB家族及其调控。冷泉Harb Perspect生物。2009;1：a000034。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Luedde T，Schwabe RF。NF-kappaB在肝脏中——与损伤、纤维化和肝细胞癌相关。Nat Rev胃肠肝素。2011;8:108–118. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
