氧化还原生物。2016年12月；10: 274–284.
肿瘤细胞代谢H的能力下降2O（运行）2抗坏血酸在癌症治疗中的药理意义
,一 ,一 ,b条 ,c（c） ,c（c） ,b、，c、，d日和a、，b、，⁎
克莱尔·多斯基
一美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学人类毒理学跨学科研究生项目，IA 52242
维萨鲁特·布拉纳苏贾
一美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学人类毒理学跨学科研究生项目，IA 52242
布雷特·瓦格纳
b条美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学放射肿瘤学系自由基与辐射生物学项目，IA 52242
贾斯汀·威尔克斯
c（c）美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科，IA 52242
杜鹃（Juan Du）
c（c）美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科52242
约瑟夫·库伦
b条美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学放射肿瘤学系自由基与辐射生物学项目，IA 52242
c（c）美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科，IA 52242
d日美国爱荷华州爱荷华州52246市退伍军人事务医疗中心
加里·布埃特纳
一美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学人类毒理学跨学科研究生项目，IA 52242
b条美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学放射肿瘤学系自由基与辐射生物学项目，IA 52242
一美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学人类毒理学跨学科研究生项目，IA 52242
b条美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学放射肿瘤学系自由基与辐射生物学项目，IA 52242
c（c）美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科，IA 52242
d日美国爱荷华州爱荷华州52246市退伍军人事务医疗中心
2016年10月17日收到；2016年10月22日接受。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
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补充材料
GUID:B386B50B-4A73-4B9A-AAA9-5EFF16C215F8
摘要
抗坏血酸（AscH−)作为一种多功能还原剂。药理学剂量（P-AscH−; [血浆抗坏血酸−]≥≈20 mM），可通过静脉给药、P-AscH氧化实现−可以产生高通量H2O（运行）2在肿瘤中。过氧化氢酶是解毒高浓度H的主要酶2O（运行）2我们假设肿瘤细胞对P-AscH的敏感性−与正常细胞相比，这是因为它们代谢H的能力较低2O（运行）2H去除速率常数2O（运行）2(k个细胞)对15个不同组织类型的肿瘤细胞系和10个正常细胞系进行过氧化氢酶活性测定。细胞清除H的能力差异2O（运行）2结果显示，平均k个细胞正常细胞是肿瘤细胞的两倍。ED公司50P-AscH（50%克隆存活率）−与直接相关k个细胞过氧化氢酶活性。过氧化氢酶活性可能是肿瘤对P-AscH反应的一个有希望的指标−.
集锦
•
抗坏血酸在细胞培养基中氧化生成H通量2O（运行）2.
•
去除细胞外H的速率常数2O（运行）2在正常细胞中比在癌细胞中平均高2倍。
•
ED公司50高剂量抗坏血酸与肿瘤细胞清除细胞外H的能力相关2O（运行）2.
•
胰腺癌小鼠模型对药物抗坏血酸的反应与在体外结果。
1.简介
抗坏血酸在生物学中是一种多功能还原剂。当以健康的生理浓度（40–80µM）存在时，它表现出抗氧化性能。对于维持在细胞信号事件中起作用的酶的功能至关重要，即。脯氨酰羟化酶。当以药理剂量使用时（P-AscH−血浆水平≥≈20 mM），1它远高于通过健康饮食摄入获得的，并且只能通过静脉注射获得，它的氧化可以输送高流量的H2O（运行）2
[1],[2],[3],[4]。P-AscH的这一独特功能−目前正在研究将其用作多种癌症护理治疗标准的佐剂。两者都有在体外和体内研究表明，P-抗坏血酸具有不同的毒性−与相同组织来源的正常细胞相比，不同癌症类型和对癌细胞的选择性毒性[1],[3],[5],[6],[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13]这些研究表明H2O（运行）2由P-AscH氧化产生−作为其对癌细胞毒性的主要介导因子。不同组织类型癌细胞对P-AscH的敏感性差异−与正常细胞相比，它们的敏感性增加可能是由于它们清除H的能力不同2O（运行）2，这是抗氧化酶活性的一种功能，可解毒H2O（运行）2.
而H2O（运行）2是一种强氧化剂，由于其与大多数生物分子的反应动力学较慢，因此不太活泼。因此，它可以在细胞和组织中积累到相对较高的浓度。在那里它可以被激活以产生更多的活性氧化剂，例如血红素过氧化物酶和羟基自由基的化合物I。去除多余的H2O（运行）2因此，抗氧化酶对减少细胞损伤至关重要。负责消除H的主要酶2O（运行）2是过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化物酶原（Prx）[14],[15],[16],[17].使用建立的动力学模型在体外数据表明，过氧化氢酶是参与高浓度H解毒的主要酶2O（运行）2，例如由P-AscH氧化产生的那些−而GPx和Prxs负责去除低通量的H2O（运行）2
[16],[18],[19],[20],[21],[22],[23],[24],[25],[26]过氧化氢酶主要定位于有核哺乳动物细胞的过氧化物酶体，在那里催化H的分解2O（运行）2变成水和氧气[27].
对各种组织的生化研究表明，不同组织类型的内源性抗氧化酶水平差异很大[28]据推测，这反映了不同器官系统在发育和代谢方面的差异[29]与非转化细胞相比，大多数癌症细胞类型中抗氧化酶的固有水平较低[28],[29],[30]研究表明，除了一种人类癌症细胞类型，即人类肾腺癌外，其他所有癌症细胞都具有低水平的过氧化氢酶和GPx[29]这表明绝大多数癌细胞可能缺乏解毒更高流量H所需的生化机制2O（运行）2高效。虽然一般来说，癌细胞中过氧化氢酶的水平较低，但过氧化氢酶的活性似乎在不同的癌细胞系中差异很大[28]这可能对应于去除H的不同容量2O（运行）2和对H的差动灵敏度2O（运行）2-生产代理(即。P-上升−). 我们假设肿瘤细胞对P-AscH的敏感性−与正常细胞相比，这是因为它们清除细胞外H的能力较低2O（运行）2; 不同肿瘤细胞类型对P-AscH的敏感性也不同−这与它们清除细胞外H的能力有关2O（运行）2，如所反映的k个细胞第页，共页2O（运行）2去除和过氧化氢酶活性。
2.方法
2.1. 细胞系
MIA PaCa-2、PANC-1、AsPC-1、MB231、A549、FHs74int和HepG2细胞购自弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养物收藏中心。从威斯康星医学院外科肿瘤组织库（威斯康星州密尔沃基）获得两个患者源性细胞系339和403[31],[32]A375、Cal27、FaDu、H292、H1299、U87、U118、H6c7、黑素细胞、正常人成纤维细胞（NHF；12岁和46岁）、正常人星形胶质细胞（NHA）和HBePC细胞是从附近的实验室捐赠的，仅用于实验，以确定其H的速率常数2O（运行）2拆卸。将MIA PaCa-2、PANC-1、MB231、A549和HepG2细胞培养在Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中，该培养基含有来自Invitrogen（Grand Island，NY）的高糖，补充10%胎牛血清（FBS）和青霉素（80单位mL）−1)/链霉素（80μg mL−1)37°C时，5%CO2AsPC-1细胞在Invitrogen（Grand Island，NY）的RPMI 1640培养基中培养，补充10%FBS和青霉素（80单位mL−1)/链霉素（80μg mL−1)37°C时，5%CO2.339和403细胞在来自Invitrogen（Grand Island，NY）的DMEM营养混合物F-12（Ham）培养基中培养，补充6%FBS、青霉素（80单位mL）−1)/链霉素（80μg mL−1)、0.1%表皮生长因子（EGF）人重组物、0.4%牛垂体提取物、4%氢化可的松、0.014%人重组胰岛素和37°C、5%CO时的谷氨酸MAX™2准备足够的培养基以完成实验，包括所有重复的培养基，并含有相同批号的FBS，以最小化实验之间的差异。
2.2. 克拉克电极氧监测仪测定细胞培养液中抗坏血酸的氧化
耗氧率（OCR，-d[O2]/天t吨)在DMEM细胞培养基中加入抗坏血酸，并加入10%FBS和青霉素（80单位mL−1)/链霉素（80μg mL−1)使用连接至ESA Biostat微电极系统（ESA Products，Dionex Corp.）的克拉克电极氧气监测仪（YSI Inc.）进行测定。OCR代表H的速率2O（运行）2生产。H的积累2O（运行）2通过添加过氧化氢酶（500单位毫升−1)（牛肝，Sigma C-1345）。
2.3. H（H）2O（运行）2去除试验：测定细胞去除H的速率常数2O（运行）2
速率常数(k个细胞)用于清除细胞外H2O（运行）2使用96 well平板阅读器测定每个不同细胞系的by细胞[33]细胞以每孔15000个细胞的密度接种在96 well板的E-G行中。然后在37°C、5%CO的条件下对细胞进行48小时的培养，然后进行检测2恢复到健康的指数增长状态。简而言之，细胞外H2O（运行）2在不同时间将（10µM）添加到孔中；验证了暴露时微孔中的细胞数量。细胞去除了这种细胞外H2O（运行）2随着时间的推移。然后在预定的时间和细胞外H的浓度下对系统进行淬火2O（运行）2井内剩余物已确定。淬火溶液含有与剩余H反应的辣根过氧化物酶（HRP）2O（运行）2在井里。活化的HRP随后氧化对位-羟基苯乙酸(第页HPA）导致形成荧光第页HPA二聚体，提供H量的读数2O（运行）2留在井里。用这种方法观察到k个细胞第页，共页2O（运行）2以每个细胞为基础确定去除率，即.细胞清除细胞外H的能力2O（运行）2(k个细胞).
2.4. 过氧化氢酶活性的测定
使用分光光度法测定MB231、A549、HepG2、MIA PaCa-2、AsPC-1、PANC-1、403和339细胞裂解液中的过氧化氢酶活性[34]简单地说，单元格（1.0–5.0×106)在200µL磷酸盐缓冲盐（PBS）中收获。用血细胞仪对细胞进行计数，因此在分析中使用了明确数量的细胞。细胞溶解后通过超声处理后，将细胞裂解液稀释在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）和30 mM H中2O（运行）2将其添加到比色皿中的细胞裂解物中以产生10mM H的最终浓度2O（运行）2H的分解2O（运行）2随后，每隔10秒测量一次240 nm处的吸光度，持续2分钟。每个细胞中活性过氧化氢酶单体的有效数量由实验斜率确定，k个‘ln曲线的’（H引起的吸光度2O（运行）2)与。时间。这个实验k个'，用于分析的细胞数量，所有溶液体积和稀释的信息，以及速率常数k个=1.1×107M（M）−1秒−1过氧化氢酶单体与H反应的催化速率常数2O（运行）2
[35],[36],[37],[38]用于测定每个细胞中过氧化氢酶单体的数量。
2.5. 3-氨基-1,2,4-三唑对过氧化氢酶的抑制作用
使用3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）抑制过氧化氢酶。细胞用20mM 3-AT在37°C、5%CO下处理1小时2在用于本文所述的实验之前，用PBS清洗细胞3次，以去除细胞外的3-AT。
2.6. 腺病毒过氧化氢酶转导
转导前48小时将MIA PaCa-2细胞接种。取下完整的DMEM培养基，用无血清DMEM介质清洗细胞2次。然后用腺病毒过氧化氢酶（1×10）转导细胞10pfu毫升−1)在所需的MOI下持续24小时(即。1、5、10、25、50和100用于本文的实验）。24小时后，去除腺病毒过氧化氢酶，用完整的DMEM培养基清洗细胞，然后用完整的DMAM培养基替换细胞进行24小时培养，然后用于本文所述的实验。
2.7. 暴露于抗坏血酸
将MIA PaCa-2、AsPC-1、PANC-1、339和403细胞接种到多个60mm2每个培养皿培养250000个细胞，并在37°C、5%CO下培养48小时2.严格使用一个皿来计算初始剂量，单位为摩尔电池−1为了达到这一目的，在接触抗坏血酸之前，用血细胞仪对培养皿中的细胞进行计数；暴露前立即出现的总细胞数用于计算初始剂量，单位为mol细胞−1将生长培养基与含有10%FBS和青霉素（80单位mL）的DMEM高糖培养基交换−1)/链霉素（80μg mL−1)所有接触抗坏血酸的情况。暴露介质的细微变化会导致抗坏血酸的氧化速率不同，从而导致H的通量不同2O（运行）2在这些研究中，所有细胞都暴露在含有10%FBS和青霉素（80单位mL）的DMEM高糖培养基中−1)/链霉素（80μg mL−1). 在用新鲜DMEM高糖完全培养基（3.0 mL）替换后，向培养基中添加抗坏血酸，以实现0-150皮摩尔细胞的暴露−1（微微=10–12; 缩写=pmol cell−1),即。0-8毫微米。在对照实验中，培养基被新鲜的DMEM高糖培养基取代，但细胞未经处理。然后在37°C、5%CO下培养细胞1小时2.
2.8. 克隆原性细胞存活
评估P-抗坏血酸暴露的细胞毒性−，细胞在抗坏血酸暴露1h后进行克隆形成试验。取下暴露培养基，用血细胞仪对细胞进行胰蛋白酶化和计数，并在3.0 mL培养基中以500个细胞的细胞密度在60 mm内进行电镀2菜。将平板在37°C、5%CO的温度下培养11–14天2生长期结束后，用70%乙醇固定细胞，并用考马斯蓝染色。菌落被视为一组50个或更多的细胞。测定了电镀效率和存活率；接种效率（PE）=（计数菌落/接种细胞）×100；存活分数=（处理样品的PE/对照样品的PE）×100。从克隆存活分数图与抗坏血酸剂量，50%克隆存活率的有效剂量（ED50)已确定。
2.9. 细胞内ATP浓度的测量
将细胞悬浮液（100µL，50000个细胞）添加到乳白色96 well板中的每个孔中。为此，添加来自ATP试剂盒（Promega，CellTiterGlo）的100µL试剂以溶解细胞并启动发光反应。10分钟后，在微孔板阅读器上测量发光。每次实验均生成浓度在0至1000µM之间的ATP标准曲线。根据相应的标准曲线确定ATP浓度，并使用血细胞仪上计算的细胞数将其转换为细胞内浓度；使用Moxi自动细胞计数器（ORFLO™）测量的细胞体积。
2.10. 基因组DNA分离和定量PCR（QPCR）
按照制造商的说明，使用血液和细胞培养DNA迷你试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚，齐亚根）分离基因组DNA。通过该技术分离基因组DNA已被证明适用于基于QPCR的核DNA（nDNA）和线粒体DNA（mtDNA）损伤测量，无需单独的线粒体DNA纯化步骤[39]DNA损伤的QPCR分析基于不同类型的DNA损伤可以减缓或阻碍DNA聚合酶的进展这一原理。如果在相同的PCR条件下从不同的生物样品中扩增出相同数量的DNA，那么损伤较大的DNA将比损伤较小的DNA扩增得更少。因此，PCR扩增量与给定DNA样本中的损伤频率成反比。
QPCR之前，在260 nm处使用Implen纳米光度计P-330对细胞总DNA的浓度进行量化。QPCR在2720热循环（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）中使用2.1版LA PCR试剂盒（加利福尼亚州山景城Clontech实验室）进行。反应总体积为50µL，包含15 ng（nDNA分析）或5 ng（mtDNA分析）总基因组DNA，1X LA PCR缓冲液II（Mg2+加上）、400µM dNTP混合物、0.4µM底漆和2.5单位Takara LA Taq。本研究中使用的寡核苷酸引物由Integrated DNA Technologies（Coralville，IA）制备。引物核苷酸序列如[39]DNA聚合酶β基因的12.2kb区域用于研究nDNA损伤。PCR条件为：94℃初始变性2 min，然后在94.5℃变性26个周期25 s，引物在68℃延伸13 min（nDNA）或20个周期在94℃变性25 s，在68℃引物延伸10 min 30 s（mtDNA）。在PCR循环结束时，在72°C下进行最终延长10分钟。含有一半未受损DNA的百分之五十对照品被用作每个PCR的质量控制，以验证PCR反应已在指数阶段终止。根据制造商的说法，使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）通过荧光测量对PCR扩增产物进行量化。琼脂糖凝胶电泳证实了PCR反应的特异性。通过标准化小线粒体片段（220 bp）的扩增，用相对线粒体DNA拷贝数对每个样本的线粒体DNA扩增进行标准化。如前所述计算DNA损伤频率[39],[40],[41]，公式λ=−ln（AD类/A类计算机断层扫描)，式中λ=每个片段的损伤频率，AD类=治疗放大，A计算机断层扫描=控制放大。
2.11. 动物实验
从Harlan Sprague-Dawley（印第安纳州印第安纳波利斯）获得30天大的无胸腺裸鼠。爱荷华大学动物护理和使用委员会审查并批准了裸鼠实验方案。这些动物四人一笼，喂食无菌商业饲料和自来水，随意在进行任何操作之前，允许动物在单元中适应一周。每个实验组由4只小鼠组成，每只小鼠有2个肿瘤。MIA PaCa-2或PANC-1人胰腺癌细胞（2×106)用配备25号针头的1mL结核菌素注射器皮下注射裸鼠腹部。允许肿瘤生长到最大尺寸（2周）在3 mm到4 mm之间，然后随机对小鼠进行治疗。这被定义为实验的第一天。小鼠每天两次服用IP抗坏血酸（4 g/kg），持续两周。在第一次使用抗坏血酸治疗后的第3、7、10和14天测量肿瘤。用数字卡尺测量肿瘤大小，根据肿瘤体积=½×L×W估算肿瘤体积2，其中L是肿瘤的最大尺寸，W是肿瘤在垂直方向上的尺寸[42].用一氧化碳对动物实施安乐死2肿瘤达到预定尺寸1000毫米时窒息三或在第15天。
2.12. 肿瘤组织过氧化氢酶的免疫荧光染色
肿瘤样本在4°C下用4%多聚甲醛固定过夜。肿瘤干OCT切片用PBS清洗，然后用5%山羊血清在20°C下封闭30分钟。将肿瘤样本与过氧化氢酶抗体（1:50，abcam，ab16731）在4°C下孵育20 h。使用Alexa Fluor 488 nm山羊抗兔抗体（1:200）作为二级抗体。DAPI染色细胞核。用共聚焦显微镜（Zeiss LSM 710）检查肿瘤组织样本。使用ImageJ定量免疫荧光强度。
2.13. 统计
使用GraphPad Prism 6.04软件（GraphPad software，San Diego，CA）进行统计分析。使用双尾非配对确定统计显著性t吨-测试()以及Tukey后验的单向方差分析(). 误差条表示平均值的标准误差。
正常细胞具有更强大的清除细胞外H的能力2O（运行）2而不是肿瘤细胞。速率常数，k个细胞其中10个正常细胞系和15个癌细胞系去除H2O（运行）2已测量（列于). 去除H的能力范围很广2O（运行）2跨所有单元格类型。平均而言，正常细胞去除H的速率常数高出2倍2O（运行）2比肿瘤细胞(第页<0.05).
H（H）2O（运行）2由抗坏血酸盐产生的线粒体DNA和nDNA在MIA-PaCa-2细胞中诱导损伤并耗尽细胞内ATP。（A）用抗坏血酸（3.5–28 pmol细胞）处理MIA PaCa-2细胞−1)1h后，用QPCR定量DNA损伤的频率。抗坏血酸治疗对nDNA和mtDNA造成剂量依赖性损伤（对于nDNA：n个=4，平均值±SEM*第页<0.05与。3.5 pmol电池−1; 对于mtDNA：n个=8，平均值±SEM**第页<0.001与。3.5 pmol电池−1).（B）MIA PaCa-2细胞与抗坏血酸（14pmol细胞−1)，或抗坏血酸（14pmol电池−1)和牛过氧化氢酶（200单位mL−1)或牛过氧化氢酶（200单位mL−1)单独1小时。QPCR分析显示，当培养基中存在过氧化氢酶时，抗坏血酸没有引起DNA损伤，表明DNA损伤是由H引起的2O（运行）2（nDNA:n个=4; 平均值±SEM*第页<0.01与。抗坏血酸；线粒体DNA：n个=4; 平均值±SEM**第页<0.001与。抗坏血酸）。（C）用抗坏血酸（14pmol细胞）处理MIA PaCa-2细胞−1)，抗坏血酸的组合（14pmol细胞−1)和牛过氧化氢酶（200单位mL−1)或牛过氧化氢酶（200单位mL−1)持续1h，然后测定细胞内ATP。用抗坏血酸处理后，ATP耗尽，但当培养基中存在过氧化氢酶时，ATP保持不变(n个=4；平均值±SEM*第页<0.001与。P-抗坏血酸−).
3.结果
3.1. 抗坏血酸在细胞培养基中被氧化
P-AscH的氧化−在两者中在体外和体内设置产生H通量2O（运行）2
[2],[3],[4].H的通量2O（运行）2被提议介导P-AscH的细胞毒性−癌细胞。耗氧率（OCR，-d[O2]/d日t吨)添加P-AscH后−DMEM细胞培养基提供H的通量信息2O（运行）2
[3],[4](补充图S1). 添加P-AscH−（6.0 mM）到DMEM细胞培养基中添加10%FBS，导致耗氧率的背景速率增加约50 nmol L−1秒−1，表示H的速率2O（运行）2抗坏血酸氧化产物。添加过氧化氢酶表明积累了18µM H2O（运行）2在实验过程中(补充图S1). 在一个典型的实验环境中，125000个细胞被6.0 mM P-AscH处理−在3.0 mL DMEM培养基中，这将导致细胞暴露于1.2 fmol细胞−1秒−1H通量2O（运行）2低代MIA PaCa-2细胞的耗氧代谢率约为40个阿莫尔细胞−1秒−1
[43]。如果我们假设代谢耗氧量的1%会转化为H2O（运行）2
[44]，然后是H生成的代谢率2O（运行）2将为0.4 amol电池−1秒−1，实验中抗坏血酸氧化产生的通量的很小部分（1%）。我们之前已经证明H的细胞外流量2O（运行）2由P-AscH生成-在培养基中会增加H的细胞内稳态水平2O（运行）2
[45].
3.2. 正常细胞具有较高的清除H的能力2O（运行）2与肿瘤细胞相比
速率常数(k个细胞,[33])用于去除细胞外H2O（运行）2测量了多种癌细胞和正常细胞，代表了各种组织类型(即。皮肤、乳房、胰腺、肺、舌、咽、肝和肠）。结果表明，癌细胞和正常细胞都具有广泛的清除细胞外H的能力2O（运行）2(,).总的来说k个细胞用于去除H2O（运行）2将细胞系与最低细胞系进行比较时k个细胞（A375；0.65×10–12秒−1细胞−1L） 到最高的细胞系k个细胞（正常人星形胶质细胞；7.3×10–12秒−1细胞−1五十） ●●●●。平均而言，正常细胞清除细胞外H的速率常数较高2O（运行）2与癌细胞相比，k个细胞=5.5×10–12秒−1细胞−1L和3.1×10–12秒−1细胞−1五十、 分别().即使在同一解剖位置的癌细胞中k个细胞用于去除细胞外H2O（运行）2().例如，MIA PaCa-2细胞有一个小的k个细胞(1.1×10–12秒−1细胞−1五十） 而PANC-1和339细胞对于k个细胞, 5.1×10–12秒−1细胞−1L和5.4×10–12秒−1细胞−1五十、 分别().
表1
速率常数(k个细胞)对于H2O（运行）2通过肿瘤和正常细胞去除。
| 细胞系 | 单元格类型 | k个细胞(10−12秒−1细胞−1五十） （扫描电镜） |
|---|
| 肿瘤 |
| MIA PaCa−2 | 胰腺癌 | 1.1 (0.1) |
| 作为PC−1 | 2.6 (0.9) |
| PANC−1 | 5.1（1.1） |
| 339 | 5.4 (0.7) |
| 403 | 3.5 (0.3) |
| A375飞机 | 黑色素瘤 | 0.65 (0.21) |
| 加利福尼亚州27 | 头颈癌 | 2.3 (0.6) |
| FaDu公司 | 2.3 |
| HepG2型 | 肝癌 | 4.2 (0.6) |
| MB231型 | 乳腺癌 | 1 |
| H292型 | 肺癌 | 3.0 (0.4) |
| H1299型 | 3.7 (0.4) |
| A549型 | 2.1 (0.3) |
| U87型 | 胶质母细胞瘤 | 4.8 (0.6) |
| U118型 | 4.6 (0.3) |
|
| 正常 |
| H6c7型 | 胰腺 | 3.7 (0.4) |
| 黑素细胞 | 皮肤 | 6.3 (1.3) |
| 正常人成纤维细胞（12-y） | 5.9 |
| 正常人成纤维细胞（46-y） | 4.7 (0.8) |
| 正常人星形胶质细胞（#1） | 大脑 | 6.8 (0.7) |
| 正常人星形胶质细胞（#2） | 4.4 (0.3) |
| 正常人星形胶质细胞（#3） | 7.3 (0.2) |
| HBePC公司 | 肺 | 6.7（0.6） |
| 红细胞 | 血液 | 4 |
| FHs74磅 | 肠道 | 4.9 |
3.3. 过氧化氢酶活性在不同的肿瘤细胞系中不同，在清除细胞外H中起主要作用2O（运行）2
鉴于不同的癌细胞株清除H的能力差异很大2O（运行）2，预计抗氧化酶的活性参与H的代谢2O（运行）2也会有很大变化。动力学模型表明过氧化氢酶是参与H去除的主要抗氧化酶2O（运行）2浓度大于10µM时，导致我们研究肿瘤细胞系中的过氧化氢酶活性[21],[22],[24]与观察到的变化类似k个细胞用于去除H2O（运行）2，我们观察到不同组织来源的癌细胞表现出广泛的过氧化氢酶活性(A） ●●●●。在相同组织类型的细胞系中也观察到每个细胞的活性过氧化氢酶单体的这种变化，并在所研究的胰腺癌细胞系中进行了例证(A）.正如预期的那样，每个细胞中活性过氧化氢酶单体的数量与这些细胞株清除细胞外H的速率常数相关2O（运行）2(B） ●●●●。因为过氧化氢酶是去除高浓度H的主要贡献酶2O（运行）2,例如.细胞外H2O（运行）2，这并不奇怪，有一个很强的相关性（R2=0.88）。
过氧化氢酶活性随癌细胞系的不同而变化，并与H的去除速率常数相关2O（运行）2(k个细胞). （A）不同组织来源细胞系的过氧化氢酶活性(即。测定胰腺（紫色）、胸脯（绿色）、肺（红色）和肝（蓝色），并用于计算每个细胞中全活性过氧化氢酶单体的有效数量。这一数字在不同的癌细胞系中变化了5倍：从每细胞101000个单体（MIA-PaCa-2）到每细胞538000个单体(n个=3–9，误差条是平均值的标准误差）。（B）这些细胞株去除细胞外H的速率常数之间有很强的相关性2O（运行）2以及每个细胞中全活性过氧化氢酶分子的有效数量（R2=0.88). （有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）
中显示的数据B显示饱和行为。这是意料之中的事；如果细胞中过氧化氢酶水平较高，那么添加更多过氧化氢酶只会导致细胞清除H的能力略有增加2O（运行）2; 但如果过氧化氢酶水平较低，相同的添加量将导致细胞清除H的能力相对较大的增加2O（运行）2，如中所示k个细胞.超氧化物线粒体通量和H形成速率的类似饱和行为2O（运行）2随着细胞中MnSOD水平的变化[46].k个细胞还包括过氧化氢酶活性潜伏期的影响，而过氧化氢酶的标准检测结果可能会高估完整细胞中可能存在的有效活性[47].
当使用3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）在过氧化氢酶基础活性较高的HepG2细胞中抑制过氧化氢酶时，这些细胞清除细胞外H的速率常数降低了4.6倍2O（运行）2(A） ●●●●。这些结果表明并支持过氧化氢酶在去除高浓度细胞外H中的重要作用2O（运行）2在3-AT抑制过氧化氢酶后，通过测量HepG2细胞中的过氧化氢酶活性来评估每个细胞的活性过氧化氢酶分子的数量减少了4.6倍(补充图S2).过氧化氢酶活性的降低反映了速率常数的降低，k个细胞，对于细胞外H2O（运行）2移除(A和补充图S2).
过氧化氢酶在H的去除中起主要作用2O（运行）2.（A）在HepG2细胞生长前24小时，用100µM丁硫氨酸亚砜胺（BSO）处理Hep G2细胞2O（运行）2-抑制谷胱甘肽合成的清除试验并未导致这些细胞清除H的速率常数发生任何变化2O（运行）2然而，用20 mM 3-AT处理HepG2细胞1小时以抑制过氧化氢酶导致HepG2-细胞清除细胞外h的速率常数降低四倍2O（运行）2(n个=4，误差条是平均值的标准误差）。（B）每个细胞中活性过氧化氢酶分子的数量与H的去除速率常数直接相关2O（运行）2用腺病毒过氧化氢酶（0–25 MOI）转导MIA-PaCa-2细胞（R2=0.91).
相反，MIA PaCa-2细胞，其清除H的基本能力很低2O（运行）2(k个细胞)和明显较低的过氧化氢酶活性，与不同数量的腺病毒过氧化氢酶（感染多重性；MOI）一起转导，以产生具有一系列过氧化氢酶活性增加的细胞集。转导后，这些MIA-PaCa-2细胞清除H的速率常数2O（运行）2增加1.5至80倍(补充图S3A）.H去除的速率常数2O（运行）2与每个细胞产生的活性过氧化氢酶单体直接相关(B）.
3.4. 药理学抗坏血酸的剂量最好按细胞规定
我们之前已经证明，指定外源性药物的应用剂量(即。1,4-苯醌、寡霉素A和H2O（运行）2)在细胞培养研究中，作为每个细胞的外源物质摩尔数，而不是培养基中的初始浓度，可以产生更一致的结果，并减少不同物理实验设置之间的模糊性[48].P-AscH的氧化−在两者中在体外(即。细胞培养基中）和体内设置产生H通量2O（运行）2
[1],[2],[3],[4]H的毒性2O（运行）2导致生物分子发生不可逆和可逆的变化，并已被证明是细胞密度依赖性的[49],[50],[51].P-AscH的剂量−目前，在细胞培养研究中使用的是其在培养基中的初始浓度。数据显示于证明将剂量指定为摩尔P-AscH−每暴露一个单元格，结果就会更加一致，并减少歧义。当P-AscH−指定为每个细胞的摩尔数，观察到明确的剂量反应(B） 然而，当不同的物理设置时，将剂量表示为介质中的初始浓度会产生模糊的结果(例如不同数量的电池暴露）(A） ●●●●。
抗坏血酸盐的剂量最好在每个细胞的基础上指定（pmol细胞−1)大于介质中的初始浓度（mM）。用5 mM抗坏血酸处理不同细胞密度（45000–543000个细胞/3.0 mL培养基）的MIA PaCa-2细胞1 h；之后立即测量ATP。抗坏血酸的剂量表示为：（A）培养基中抗坏血酸的初始浓度；和（B）每个细胞抗坏血酸（pmol）的绝对量。
3.5. 胰腺癌细胞系对抗坏血酸的不同敏感性与其清除H的能力相关2O（运行）2
先前的研究表明，癌细胞对P-AscH的敏感性存在一定范围−
在体外跨不同组织类型[1],[3],[6]这也在同一来源的组织中表现出来。五种不同的胰腺癌细胞系MIA-PaCa-2、AsPC-1、403、339和PANC-1对P-AscH的敏感性不同−根据杀死50%细胞的有效剂量来衡量在体外（教育部）50) (A和补充图S4). PANC-1细胞出现ED50P-AscH的−这是MIA-PaCa-2细胞的两倍，表明MIA-PaCa-2细胞对P-AscH的敏感性明显更高−比PANC-1电池(A和补充图S4).
不同胰腺癌细胞株对抗坏血酸的敏感性不同，并与清除细胞外H的能力相关2O（运行）2(k个1个单元格). （A）ED公司50抗坏血酸在MIA-PaCa-2、AsPC-1、403、339和PANC-1细胞系中使用克隆形成存活试验测定。抗坏血酸的剂量需要降低50%的克隆形成存活率，这在胰腺癌细胞系中是不同的。当去除细胞外H的速率常数2O（运行）2通过一个单元格(k个1个单元格)针对这5种不同的胰腺癌细胞系绘制ED曲线50P-AscH的−对P-AscH的敏感性之间存在直接相关性−以及细胞去除H的速率2O（运行）2（右2=0.69). 速率常数k个1个单元格表示单个细胞清除细胞外H的能力2O（运行）2。由以下因素决定：k个1个单元格（个）−1) =k个细胞（个）−1细胞−1五十） x 1（单元格L−1).（B）ED显示，腺病毒过氧化氢酶在MOI增加时对MIA-PaCa-2细胞的转导增加了对抗坏血酸的抗性50用腺病毒过氧化氢酶在0–25 MOI条件下转导MIA PaCa-2细胞，然后暴露于抗坏血酸（0–50 pmol细胞−1). 在每次腺病毒过氧化氢酶（0–25 MOI）的转导-MOI时，测定克隆存活率降低50%的剂量。用腺病毒过氧化氢酶转导后测定过氧化氢酶活性。最终ED50与腺病毒过氧化氢酶（R2=0.94).
这些胰腺癌细胞株具有非常不同的清除细胞外H的能力2O（运行）2，定量表示为k个细胞以及细胞系的过氧化氢酶活性(和). ED公司50P-AscH的−与…直接相关k个细胞（右2=0.69,A） ●●●●。MIA PaCa-2细胞对P-AscH最敏感−而且是最小的k个细胞而PANC-1细胞对P-AscH的敏感性最低-拥有最大的k个细胞(A） ●●●●。这些结果表明，细胞清除细胞外H2O（运行）2和ED50P-AscH的−支持H的重要作用2O（运行）2-从P-AscH中观察到的毒性去除系统−.P-抗坏血酸−可能对清除H能力较低的细胞更有效2O（运行）2过氧化氢酶活性与对P-AscH的敏感性之间的强相关性−以及3-AT抑制过氧化氢酶对k个细胞强调过氧化氢酶在去除H中的作用2O（运行）2高浓度，如P-AscH可以达到的浓度−.
在不同的胰腺癌细胞系中，我们观察到k个细胞以及它们对P-AscH的敏感性−因此，我们在不同MOI（0–25 MOI）下用腺病毒过氧化氢酶转导后，在MIA PaCa-2细胞中进一步探讨了这一点(B和补充图S5). 我们发现P-AscH治疗后的剂量-反应曲线发生了变化−依赖于MOI(补充图S5).P-AscH的剂量−使克隆形成存活率降低50%（ED50)与腺病毒过氧化氢酶（R2=0.94）(B） ●●●●。
3.6. 过氧化氢酶抑制使PANC-1细胞对抗坏血酸药物敏感
过氧化氢酶在不同的肿瘤细胞系中存在差异，在H的清除中起主要作用2O（运行）2浓度与P-AscH产生的浓度相当−(,). 不同胰腺癌细胞株清除H的能力2O（运行）2，量化通过k细胞，与ED相关50用于P-AscH−在细胞培养中，PANC-1细胞对P-AscH的抗性最强−具有最强大的清除细胞外H的能力2O（运行）2(A）.在用P-AscH处理PANC-1细胞之前，3-AT抑制过氧化氢酶−，细胞对P-抗坏血酸敏感−(). P-AscH的剂量-用3-AT预处理细胞时，使克隆形成存活率降低50%所需的时间减少了1.5倍(). 3-AT预处理导致PANC-1细胞去除H的速率常数降低40%2O（运行）2(补充图S6A） 过氧化氢酶活性降低60%(补充图S6B） ●●●●。
3-氨基-1,2,4-三唑对过氧化氢酶的抑制使PANC-1细胞对抗坏血酸的敏感性与k个细胞在用0–17 pmol细胞处理PANC-1细胞之前，用20 mM 3-AT处理1 h−1抗坏血酸（350000个细胞；0–2 mM）1小时。然后对细胞进行克隆存活试验。3-AT使PANC-1细胞对抗坏血酸敏感。ED公司503-AT处理的抗坏血酸的含量比不处理的少1.5倍(n个=3，误差条是平均值的标准误差）。
3.7、。P-抗坏血酸−通过H诱导DNA损伤和ATP耗竭2O（运行）2
DNA作为一种大分子，易受P-AscH诱导的氧化损伤−
[52]用P-AscH处理MIA-PaCa-2细胞−以剂量依赖的方式导致核DNA（nDNA）和线粒体DNA（mtDNA）的DNA损伤(A） ●●●●。在P-AscH剂量下，mtDNA的损伤频率大约是nDNA的3倍−14和28 pmol电池−1(A）.这一观察结果表明，线粒体DNA更容易受到P-抗坏血酸引起的氧化损伤−与nDNA相比。调查H2O（运行）2调节暴露于P-抗坏血酸后观察到的DNA损伤−，MIA PaCa-2与P-AscH联合治疗−（14 pmol细胞−1)和细胞外过氧化氢酶（200单位毫升−1). 过氧化氢酶改善了P-AscH的有害作用−在nDNA和mtDNA上，与H的参与一致2O（运行）2P-AscH介导的DNA损伤−(A和B）。
DNA损伤的反应与ATP的耗竭密切相关[53],[54]以前曾观察到P-抗坏血酸−会导致细胞内ATP的丢失[1],[3],[10],[55],[56].P-抗坏血酸−以剂量依赖性方式降低细胞内ATP浓度(). 过氧化氢酶阻止了ATP的消耗(C）.这些结果清楚地表明H2O（运行）2在抗坏血酸介导的ATP耗竭中起重要作用。DNA损伤与ATP水平受损相结合2O（运行）2由P-AscH生产−对癌细胞有害-抑制生长或诱导细胞死亡，取决于挑战的严重程度。
3.8. 与体内PANC-1肿瘤相比，抗坏血酸药物在治疗MIA PaCa-2肿瘤方面的疗效更高
确定对P-AscH的差异敏感性−在细胞培养中观察到MIA PaCa-2和PANC-1细胞也发生体内，采用小鼠模型。MIA-PaCa-2小鼠异种移植物(k个细胞=1.1×10–12秒−1细胞−1L；每个细胞101000个活性过氧化氢酶单体）和PANC-1(k个细胞=5.1×10–12秒−1细胞−1L；建立了459000个活性过氧化氢酶单体/细胞）细胞；然后，用P-抗坏血酸处理小鼠−IP每天两次，持续2周(). P-抗坏血酸−与未经治疗的对照组相比，这两种细胞类型的肿瘤生长均降低。然而，P-AscH−与PANC-1异种移植相比，MIA-PaCa-2异种移植对肿瘤生长的抑制作用更强，这与我们的研究结果一致在体外观察(). 未治疗对照组中MIA-PaCa-2肿瘤的生长速度导致肿瘤大小每天增加30%，而用P-AscH治疗的MIA-PaCa-2肿瘤的大小每天仅增加2.7%−未经治疗的对照组PANC-1肿瘤的生长速度使肿瘤大小每天增加50%，而经P-AscH治疗的PANC-1瘤每天增加21%−(). 因此，P-AscH−导致由MIA-PaCa-2细胞形成的肿瘤的生长速度降低10倍，而P-AscH−对于来自PANC-1细胞的肿瘤，只能使肿瘤生长速度降低60%。PANC-1的荧光强度与。MIA PaCA-2约为50:1，表明PANC-1衍生组织样品中的过氧化氢酶更多(). 这些数据表明，肿瘤组织清除H的能力降低2O（运行）2
体内是P-AscH机制的一个基本方面−减缓肿瘤生长。
与PANC-1肿瘤相比，抗坏血酸药物可减缓MIA-PaCa-2肿瘤的生长体内试验。（A）MIA帕卡-2(k个细胞=1.1×10−12秒−1细胞−1L；每个细胞101000个活性过氧化氢酶单体）细胞和（B）PANC-1型(k个细胞=5.1×10−12秒−1细胞−1L；每细胞459000个活性过氧化氢酶单体）细胞被注射到小鼠体内并形成肿瘤。小鼠每天两次服用IP抗坏血酸（4 g/kg），持续两周。在第一次使用抗坏血酸治疗后的第3、7、10和14天测量肿瘤。P-抗坏血酸−将PANC-1异种移植瘤的生长速度降至对照组的42%；MIA-PaCa-2肿瘤异种移植P-AscH−将增长放缓至仅为对照组的9%。比率k个细胞（PANC-1）/k个细胞（MIA-PaCa-2）=4.6；与对照组相比，相对增长率的比率基本相同，42%/9%=4.7，这是一个显著的定量比较。（C）MIA-PaCa-2肿瘤过氧化氢酶免疫荧光，以及（D）PANC-1肿瘤过氧化氢酶免疫荧光。肿瘤标本在4℃用4%多聚甲醛固定，在20℃用5%山羊血清封闭30分钟。样品在4°C下与过氧化氢酶抗体（1:50）孵育20小时。使用Alexa Fluor 488 nm山羊抗兔抗体（1:200）作为二级抗体。DAPI染色细胞核。使用蔡司共焦显微镜检查样品。比例尺，20µm。由于过氧化氢酶的存在，PANC-1衍生肿瘤的组织样本显示出比MIA-PaCa-2肿瘤组织样本更多的免疫荧光。（PANC-1的归一化荧光强度与。MIA PaCA-2为100±27与. 2.0±0.5.).
4.讨论
这里给出的数据定量地确定了H的中心作用2O（运行）2，P-AscH氧化生成−，在P-AscH的细胞毒性作用中−癌细胞在体外我们的数据在数量上支持了许多观察结果，这些观察结果表明P-AscH的细胞毒性−观察到的癌细胞在体外主要是因为它产生了H2O（运行）2在介质中(补充图S1)[1],[2],[3],[4],[5],[9]以药理浓度输送的抗坏血酸对几种不同类型的肿瘤细胞具有选择性毒性。虽然观察到这种选择性细胞毒性依赖于H的生成2O（运行）2，发生这种情况的机制仍在调查中。H2O（运行）2由P-AscH生成−引发其对肿瘤细胞的细胞毒性已经被假设和检验，例如：DNA损伤[3],[13],[52],[55],[56],[57]; ATP的消耗导致肿瘤细胞死亡[1],[3],[10],[58],[59].H型2O（运行）2在该机制中起着不可或缺的作用。然而，许多其他因素可以调节P-抗坏血酸的毒性−,例如KRAS地位[3]，催化金属的水平[60],[61]细胞内GSSG的氧化还原状态，2 H+/2GSH氧化还原偶[45],[62]以及NAD的地位[58]Yun等人最近扩展了抗坏血酸选择性杀伤的观察结果克拉斯和BRAF公司突变细胞[59]; 他们建议P-AscH−以GAPDH的氧化还原状态为目标。然而，作者提出的机制没有考虑清楚证明P-AscH的重要公开数据−诱导癌细胞选择性氧化应激和细胞毒性与。正常细胞通过产生H的机制2O（运行）2.一些用于探索可能机制的生化试剂直接与H反应2O（运行）2从而将其移除并保护细胞；看见补充讨论.
不同组织类型有多种能力去除H2O（运行）2。我们定量测定了10种不同正常组织细胞类型和15种不同癌细胞系的这种能力(). 平均而言，测得的正常细胞去除了H2O（运行）2速率常数比测试的癌细胞系高2倍(和). 我们观察到H的去除速率常数范围很大2O（运行）2跨不同组织类型和同一组织来源的不同细胞系().
特别是，有广泛的k个细胞用于去除H2O（运行）2跨越不同胰腺癌细胞系（5倍）(和A） ●●●●。P-抗坏血酸−在胰腺癌模型中进行了广泛研究在体外,体内和临床试验中[3],[4],[8],[63],[64].使用定量给药指标（mol cell−1)我们之前建立的直接作用化合物与目标分子形成共价和紧密结合的复合物，我们能够比较50%细胞致死的绝对剂量（ED50)在五种不同的胰腺癌细胞系中进行实验，没有因实验的物理条件而产生歧义()[48]。我们观察到k个细胞用于去除H2O（运行）2胰腺癌细胞系对P-抗坏血酸的敏感性直接相关−（由ED测量50) (A） ●●●●。我们的数据支持先前研究的结果，即过氧化氢酶是去除高通量H的主要贡献者2O（运行）2在肿瘤细胞中。我们观察到，过氧化氢酶活性的增加和减少都对H的速率常数有显著影响2O（运行）2去除并进一步研究基础过氧化氢酶活性的类似操作是否会影响细胞对P-AscH的敏感性−.
在同一细胞系（MIA-PaCa-2）内增加过氧化氢酶活性增加了对P-AscH的抗性−(B） ●●●●。同一组织来源和不同组织来源的细胞系之间存在许多差异；这一结果支持过氧化氢酶活性在保护细胞免受P-抗坏血酸损伤中的作用-并限制不同细胞系中可能存在的其他混杂因素。
降低过氧化氢酶活性增加了对P-AscH的敏感性−(). 这表明过氧化氢酶可能是一种治疗靶点；肿瘤细胞中过氧化氢酶活性的药物抑制剂可能是提高P-AscH疗效的有效联合疗法−在这些研究中，我们使用3-AT抑制过氧化氢酶。虽然3-AT目前未用于诊所或体内由于它对肿瘤细胞没有特异性，目前正在研究其他潜在的过氧化氢酶抑制剂天然产物。这些包括：水杨酸、花青素、甲基多巴和中和抗体[65],[66]因此，针对这些类型试剂的进展可能会提高基于氧化还原的治疗的疗效，并改善患者生存率。
氧化物种有几个靶点，例如H（H）2O（运行）2其中一个目标是DNA。我们的研究结果支持DNA是P-AscH的主要靶点−P-抗坏血酸对细胞核和线粒体DNA的损伤−由H介导2O（运行）2(B） ●●●●。mtDNA似乎比nDNA更容易受到氧化损伤。这与之前的报告类似，与nDNA相比，mtDNA对氧化损伤的敏感性更高[67]这些研究特别关注H2O（运行）2作为氧化剂。有人认为，这可能是由于nDNA修复系统的效率不同所致与。线粒体DNA[68].
总之，我们的数据提供了定量证据，证明H2O（运行）2参与P-AscH的机制−对癌细胞的毒性在体外.的数据支持H的类似角色2O（运行）2
体内.P-抗坏血酸−在两种不同胰腺癌细胞类型的小鼠异种移植物中，对减缓肿瘤生长具有不同的疗效，而这两种细胞清除H的能力截然不同2O（运行）2：MIA PaCa-2(k个细胞=1.1×10–12秒−1细胞−1五十） ；和PANC-1(k个细胞=5.1×10–12秒−1细胞−1五十） ●●●●。P-抗坏血酸-将PANC-1异种移植物肿瘤的生长速度减慢到对照的42%；MIA-PaCa-2肿瘤异种移植P-AscH−将增长放缓至仅9%的控制水平。比率k个细胞（PANC-1）/k个细胞（MIA-PaCa-2）=4.6；与对照组相比，相对增长率的比率基本相同，42%/9%=4.7。这种定量比较有力地支持了H的作用2O（运行）2和过氧化氢酶在P-AscH可诱导的毒性中−不同胰腺癌细胞清除H的能力之间有很强的相关性2O（运行）2以及对P-AscH的敏感性——表明体内肿瘤中过氧化氢酶活性的测定可以预测哪些癌症对P-AscH反应最佳−治疗。
这些信息还可以用于寻找联合疗法，以提高过氧化氢酶活性较高的肿瘤的治疗效果。例如，锰卟啉增加了H的通量2O（运行）2由P-AscH生成−组合使用时[4]。已证明它们与P-抗坏血酸协同作用−在里面在体外和体内动物研究[4]对于清除H的能力增强的肿瘤细胞2O（运行）2，与增加H通量的药剂组合2O（运行）2(例如锰卟啉）可能有益。
因为P-AscH−它可以降低细胞内ATP水平并诱导DNA氧化损伤，对于那些DNA损伤作为其作用机制的一部分的抗癌治疗，它可以作为协同佐剂。P-抗坏血酸−已证明与电离辐射具有协同作用[52]这是一种生物物理疗法，可导致DNA损伤，以及吉西他滨[8]，一种阻碍DNA合成并对抗其修复的物质[69].
5.结论
在本研究中，我们观察到对P-抗坏血酸的不同敏感性−跨胰腺癌细胞与其清除H的能力密切相关2O（运行）2我们的结论是：
1
在高剂量下，抗坏血酸在细胞培养基中被氧化，生成H通量2O（运行）2.
2
去除细胞外H的速率常数2O（运行）2正常细胞平均比癌细胞高2倍。
3
不同组织来源的肿瘤细胞系的过氧化氢酶活性显示，细胞清除H的能力存在很大差异2O（运行）2.
4
ED公司50P-AscH的−与肿瘤细胞清除细胞外H的能力相关2O（运行）2.
5
对P-AscH的反应−在小鼠胰腺癌模型中在体外当这些细胞暴露于P-AscH时的结果−.
这项工作提供了确凿的证据，证明H2O（运行）2参与P-AscH的机制−对癌细胞的毒性和过氧化氢酶活性对清除这种H至关重要2O（运行）2这些结果表明体内肿瘤中过氧化氢酶活性的测定可以预测哪些癌症会对抗坏血酸药物治疗产生反应。这些信息还可以用于寻找联合疗法，以提高过氧化氢酶活性较高的肿瘤的治疗效果。
作者贡献
GRB、CMD、VB、JGW和BAW设计并执行了实验；CMD、VB、BAW、JGW、JJC和GRB对数据进行了分析；CMD和GRB用VB编写手稿，BAW提供具体文本和编辑建议；所有作者都参与了这部作品的编辑工作。
致谢
提交人声明，没有相互竞争的利益。本出版物得到了美国国立卫生研究院（NIH）的支持，授予R01 CA169046、R01 GM073929、T32 CA148062、P42 ES013661、P30 ES005605、R01 CA184051和癌症研究门户。爱荷华大学的ESR设施提供了宝贵的支持。核心设施部分由霍尔顿综合癌症中心（P30 CA086862）提供支持。我们感谢威斯康星州医学院医学博士Susan Tsai提供的339和403细胞系。内容完全由作者负责，并不代表国家卫生研究院的观点。
脚注
1缩写3-氨基-1,2,4-三唑；AscH公司−，抗坏血酸单阴离子，即。维生素C；预计起飞时间50，有效剂量50%生存率；谷胱甘肽过氧化物酶；H（H）2O（运行）2，过氧化氢；P-抗坏血酸−，抗坏血酸药理学；Prx，过氧化物酶原。
附录A与本文相关的补充数据可以在在线版本中找到，网址为doi:10.1016/j.redox.2016.10.010.
工具书类
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