骨髓增生性肿瘤中谷氨酰胺代谢的靶向性

2.2. 细胞系

这个JAK2号机组^V617F型-突变型人类红白血病（HEL）细胞系由Ronald Hoffman博士（纽约西奈山医学院）提供，并保存在添加10%FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基（Cellgro®）中。表达人类EPOR和野生型或突变型的白细胞介素-3（IL-3）依赖性小鼠前淋巴细胞系BaF3JAK2号机组（BaF3-hEPOR-JAK2^重量和BaF3-hEPOR-JAK2^V617F型)由Ian Hitchcock博士（纽约石溪大学）编制[20]. 所有BaF3细胞（BaF3亲本，BaF3-hEPOR-JAK2^重量和BaF3-hEPOR-JAK2^V617F型)在所有实验过程中，维持在补充有10%FBS、1%青霉素-链霉素和IL-3（来自产生IL-3的仓鼠幼肾细胞的2μl/mL条件培养基）的RPMI1640培养基中[20,21].

2.3. 海马XF^{e（电子）}96细胞外通量分析

BaF3-hEPOR-JAK2的线粒体呼吸（以耗氧速率OCR表示）和糖酵解（以细胞外酸化速率ECAR表示）^重量和BaF3-hEPOR-JAK2^V617F型使用XF测量细胞^{e（电子）}96细胞生物分析仪（Seahorse Biosciences®）。简单地说，每孔40000个细胞接种在Cell-Tak（Corning®）涂层XF的非缓冲分析介质中^{e（电子）}96细胞培养微板。然后在37°C非CO2培养箱中培养细胞30分钟。1小时内测量基础OCR和ECAR。

2.4. 气相色谱-质谱分析

5 × 10⁵表达野生型或突变型的BaF3细胞JAK2号机组（BaF3-hEPOR-JAK2^重量和BaF3-hEPOR-JAK2^V617F型)生长于¹³C类₅-谷氨酰胺（4 mM）培养基（Sigma®）培养24小时。在培养期结束时，收集细胞，并将代谢物与2-氧代丁酸钠（Sigma-®）（每个样品100 nmol）一起提取，并在GC-MS分析之前用Tri-Sil HTP试剂（Thermo Scientific®）（每样品100μl）衍生。使用MassHunter软件（安捷伦科技®）分析数据。

2.5. 细胞增殖试验

对于细胞系，用二甲基亚砜、谷氨酰胺酶抑制剂BPTES（Sigma®）和JAK2抑制剂Ruxolitinib（Selleckchem®）处理HEL和BaF3细胞72–96小时，通过使用台盼蓝染料计数血细胞仪中明亮的活细胞来评估细胞增殖，以排除死细胞。每项实验均以一式三份样品进行，并至少重复两次。

CD34+细胞体外增殖，1×10⁵MPN患者的外周血CD34+细胞在无血清培养基中培养，培养液中含有细胞因子干细胞因子（100 ng/mL）、Flt3-配体（100 ng/mL）和血小板生成素（20 ng/mL，DMSO、BPTES（2μM）和/或Ruxolitinib（250 nM）。在第8天采集细胞，并使用台盼蓝染料排除法计算相应的细胞数。每项实验一式三份。

2.6. 造血祖细胞检测

如前所述，使用Methocult H4230半固体培养基（StemCell Technologies®）和生长因子培养MPN患者的外周血CD34+细胞[19]. 简单地说，在添加SCF（50 ng/mL）、IL-3（50 ng/mL）、GM-SCF（50 ng/mL）和促红细胞生成素（2 U/mL）的重复培养基中，每皿培养1000个CD34+细胞。培养14天后，采集单个菌落（爆发形成单位红细胞（BFUe）和菌落形成单位粒细胞-巨噬细胞（CFU-GM）衍生菌落），并对其进行基因分型JAK2号机组^V617F型状态。

在药物治疗实验中，使用Methocult H4230在DMSO、BPTES（2μM）和/或Ruxolitinib（250 nM）存在下培养细胞。每个实验重复进行。培养14天后，用倒置光学显微镜测定菌落的形态和数量。

2.7. JAK2的嵌套等位基因特异PCR^V617F型

使用Extract-N-Amp Blood PCR Kits（Sigma-Aldrich®）从采集的菌落中分离基因组DNA。JAK2号机组^V617F型如前所述，使用嵌套等位基因特异PCR检测[22,23]. 在2.0%琼脂糖凝胶上分析最终PCR产物。巢式PCR产物的大小为453 bp。279-bp的产品显示等位基因特异JAK2号机组^V617F型-阳性，而229-bp产物表示等位基因特异的野生型产物。

2.8. 定量实时聚合酶链反应

TaqMan®基因表达测定（Applied Biosystems）用于定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR），以验证GLS的差异表达（人类GLS的Hs00248163_m1和小鼠GLS的Mm01257297_m1）、谷氨酸脱氢酶（Mm00492353_m1，在ABI ViiA™7实时PCR机器（Applied Biosystems）上。GLS表达水平归一化为18S（人类）或转铁蛋白受体（小鼠）表达（应用生物系统），相对折叠变化由2^ΔΔCT方法。所有分析均一式三份。

3.2. JAK2号机组^V617F型突变与谷氨酰胺代谢增加有关

此前，研究表明JAK2号机组^V617F型-突变细胞增加了与关键糖酵解酶诱导相关的葡萄糖摄取和糖酵化乳酸生成[18]. 据报道，糖酵解癌细胞增加了谷氨酰胺的消耗，以补充TCA循环并产生生物能量和生物合成底物[15,24]. 我们使用¹³C稳定同位素分析以确定谷氨酰胺利用率的差异JAK2号机组^V617F型-突变体和JAK2号机组野生型细胞。简言之，BaF3-hEPOR-JAK2的数量相等^重量细胞和BaF3-hEPOR-JAK2^V617F型细胞在[U5]中生长-¹³提取24小时C谷氨酰胺和代谢物。我们发现，谷氨酸（1.9倍）、柠檬酸（4.2倍）和乳酸（4.4倍）的丰度在JAK2号机组^V617F型-突变细胞与JAK2号机组^重量细胞，表明JAK2号机组^V617F型-突变与谷氨酰胺在TCA循环中的使用和流量增加有关(图1C).

3.3. JAK2号机组^V617F型突变与谷氨酰胺酶表达增加有关

谷氨酰胺代谢在癌细胞生长中的核心作用使谷氨酰胺酶成为肿瘤治疗的重要靶点。谷氨酰胺可以通过谷氨酰胺酶（GLS）转化为谷氨酸。谷氨酸可以通过谷氨酸脱氢酶或转氨酶转化为α-酮戊二酸[25]. 使用定量实时PCR，我们发现GLS上调（2倍），谷氨酸脱氢酶下调（3.3倍）JAK2号机组^V617F型-突变BaF3细胞与JAK2号机组^重量BaF3细胞。谷氨酸丙酮酸转氨酶在JAK2号机组^V617F型-突变体和JAK2号机组^重量细胞。(图2A)

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图2

谷氨酰胺酶表达上调JAK2号机组^V617F型-突变细胞与JAK2号机组^重量细胞。（A） BaF3-hEPOR-JAK2中谷氨酰胺酶（GLS）、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸丙酮酸转氨酶mRNA的表达^重量和BaF3-hEPOR-JAK2^V617F型细胞。它们在JAK2中的表达^V617F型-与设置为“1”的JAK2野生型细胞相比，突变细胞表现为折叠变化。（B） GLS在健康献血者（n=2）和MPN患者（n=6）外周血CD34+细胞中的表达。与设定为“1”的平均健康对照表达相比，单个样本miRNA表达表现为fold-change。（C） GLS在来自五个JAK2外周血CD34+细胞的突发形成单位-类囊体（BFUe）菌落中的表达^V617F型-MPN阳性患者。JAK2中的GLS表达式^V617F型-与来自同一患者的JAK2野生型BFUe菌落相比，突变BFUe集落显示为折叠变化，设置为“1”。（D） 两名原发性骨髓纤维化患者在早期随访期间（“早期疾病”）和疾病进展时（“晚期疾病”）的系列外周血CD34+细胞样本中GLS的表达。与来自同一患者的“早期疾病”样本（设为“1”）相比，晚期疾病样本中GLS的表达表现为折叠变化。

谷氨酰胺酶（GLS）是谷氨酰胺代谢的关键酶，在多种人类癌症中经常上调[16,26–28]. GLS抑制降低细胞增殖并阻止致癌转化[15,25,29,30]. 我们研究了MPN患者GLS表达是否发生改变。在外周血CD34+细胞中，我们未检测到健康献血者（n=2）和MPN患者（n=6）之间GLS mRNA水平的任何显著差异(图2B)。众所周知，MPN中的干细胞室是异质的，两者都存在JAK2号机组野生型克隆和JAK2号机组^V617F型-突变克隆在大多数MPN患者中共存，在从不同MPN患者获得的样本中，野生型和突变克隆的比例差异很大。这个JAK2号机组^V617F型克隆有能力随着时间的推移而扩展，并在普通克隆中占据主导地位[31–34]. 因为癌细胞的增殖依赖于谷氨酰胺的持续供应[12–14]我们假设MPN克隆扩张和疾病进展与GLS水平的诱导相关，以支持所需的代谢转化。为了验证这一假设，我们首先研究了GLS在克隆衍生的红系祖细胞（Burst Forming Unit Erythoid，BFUe）中的表达JAK2号机组^V617F型-MPN阳性患者（3名PV、1名ET和1名PMF）。我们发现GLS表达在JAK2号机组^V617F型-突变BFUe集落细胞与JAK2号机组来自同一患者的野生型BFUe集落细胞(图2C)。其次，在两名PMF患者（其中一名患者）的连续外周血CD34+细胞样本中JAK2号机组^V617F型-突变体和一个JAK2号机组^重量)患者在随访期间病情进展（即体质症状恶化和/或外周血细胞计数增加），与早期时间点相比，GLS mRNA水平在病情进展时平均增加1.7倍(图2D)。尽管由于样本量较小，我们的研究无法对谷氨酰胺酶在MPN克隆扩张和疾病进展中的作用提供明确答案，但这些发现促使我们进一步探索GLS抑制剂在MPN治疗中的潜力。

3.4. 谷氨酰胺酶抑制剂增加JAK2抑制剂在JAK2中的生长抑制作用^V617F型-突变细胞系

之前的研究表明JAK2号机组^V617F型-突变细胞的葡萄糖摄取和糖酵解增加，可被JAK抑制剂部分抑制[18]. 我们当前的研究表明JAK2号机组^V617F型突变与谷氨酰胺使用增加有关，关键的谷氨酰胺代谢酶谷氨酰胺酶在JAK2号机组^V617F型-突变细胞。由于葡萄糖和谷氨酰胺都是癌细胞生长和增殖的必需营养素，我们假设JAK抑制剂和GLS抑制剂联合治疗通过抑制葡萄糖和谷氨酸代谢而对MPN细胞的生长具有比单独JAK抑制剂更大的抑制作用。我们测试了Ruxolutinib（Selleckchem®），这是FDA批准的第一种用于MPN治疗的JAK2抑制剂[35,36]和小分子GLS抑制剂BPTES（双-2-[5-苯基乙酰氨基-1,3,4-噻二唑-2-基]乙基硫醚）（Sigma®），由于其独特的化学结构，它是一种具有最小离靶效应的特定GLS抑制剂[25,29,37,38]. 我们观察到BPTES抑制HEL细胞生长的剂量依赖性效应(图3A)。虽然低剂量BPTES（5μM）对HEL细胞生长几乎没有影响，但联合使用BPTES和Ruxolitinib（1.5μM）显著抑制HEL细胞增长66%，而单独使用Ruxolinib仅抑制细胞生长35%（p=0.04）(图3B)。BaF3-hEPOR-JAK2也获得了类似的结果^V617F型单元格（未显示数据）。

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图3

谷氨酰胺酶（GLS）抑制剂BPTES增加了Ruxolitinib在JAK2中的生长抑制^V617F型-突变细胞系。（A） BPTES诱导的生长抑制呈剂量依赖性JAK2号机组^V617F型-突变型人类红白血病（HEL）细胞系。（B） BPTES增强了HEL细胞中Ruxolitinib的生长抑制。

我们感谢Geoffrey Girnun博士及其实验室（纽约州立石溪大学）对Seahorse XF的技术援助和科学投入^{e（电子）}96分析和GC-MS分析。我们感谢Chi V.Dang博士（宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心）就GLS抑制剂的使用提供了有见地的建议，并对代谢数据提出了有用的意见。我们感谢Ronald Hoffman博士及其实验室（纽约西奈山医学院）在JAK2号机组^V617F型巢式等位基因特异PCR分析。我们感谢Kenneth Kaushansky博士和Yupo Ma（纽约石溪医学院）对数据分析和手稿准备的有益讨论。我们感谢侯赛因·福达博士在这项工作中的持续支持。这项工作由退伍军人事务职业发展奖（CDA210959632，H.Z.）资助。