氧化还原生物。2016年12月；10: 266–273.
老年鼠脑组织和衰老的人成纤维细胞中的大自噬受损
,一 ,一 ,a、，b条 ,a、，c（c）和a、，b、，c、，⁎
克里斯蒂安·奥特
一德国波茨坦-雷布鲁克德国人类营养研究所分子毒理学系
珍妮特·科尼
一德国波茨坦-雷布鲁克德国人类营养研究所分子毒理学系
安妮卡·赫恩
一德国波茨坦-雷布鲁克德国人类营养研究所分子毒理学系
b条德国糖尿病研究中心（DZD），德国慕尼黑Neuherberg 85764
托拜厄斯·荣格
一德国波茨坦-雷布鲁克德国人类营养研究所分子毒理学系
c（c）德国心血管研究中心（DZHK），10117 Berlin，Germany
蒂尔曼·格伦
一德国波茨坦-雷布鲁克德国人类营养研究所分子毒理学系
b条德国糖尿病研究中心（DZD），德国慕尼黑Neuherberg 85764
c（c）德国心血管研究中心（DZHK），10117 Berlin，Germany
一德国波茨坦-雷布鲁克德国人类营养研究所分子毒理学系
b条德国糖尿病研究中心（DZD），德国慕尼黑Neuherberg 85764
c（c）德国心血管研究中心（DZHK），德国柏林10117
2016年9月25日收到；2016年10月7日修订；2016年10月12日接受。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
摘要
衰老过程中蛋白水解活性的整体下降可以促进和加速蛋白质积累和代谢紊乱。为了具体分析宏观自噬（MA）的变化，我们量化了年轻、成年和老年小鼠组织以及年轻和衰老的人类成纤维细胞中的不同自噬相关蛋白（ATG）。因此，我们发现老年脑组织和衰老的人类成纤维细胞中ATG5-ATG12、LC3-II/LC3-I比率、Beclin-1和p62的水平显著降低。为了研究mTOR的作用，对蛋白本身及其靶蛋白p70S6激酶和4E-BP1进行了定量。在旧组织和细胞中检测到mTOR蛋白水平显著增加。这两种蛋白的磷酸化量和基础量的测定表明，在老年小鼠组织和衰老的人成纤维细胞中，mTOR活性较高。除了ATG水平降低外，mTOR还可以降低MA，促进蛋白质积累和衰老过程中的代谢紊乱的进一步加速。
缩写：ConA、霉素A（溶酶体抑制剂）；LC3，微管相关蛋白1A/1B轻链3；mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点；自噬相关蛋白；自噬-溶酶体途径；MA，巨自噬
关键词：自噬溶酶体途径，衰老，ATG，衰老，成纤维细胞，MTOR
1.简介
老化过程中正常蛋白质周转的功能障碍会促进氧化、交联和修饰蛋白质的积累，导致蛋白质聚集，而蛋白质聚集与许多与年龄相关的疾病有关[1],[2],[3]除泛素蛋白酶体系统（UPS）外，细胞还具有自噬-溶酶体途径（ALP）（参见[4])负责降解长寿命蛋白质、细胞器以及专门隔离的细胞质货物[5],[6]为了维持细胞成分向溶酶体的自噬传递，有三种不同类型的自吞噬：伴侣介导自噬（CMA）[7]提供可溶性细胞溶质蛋白、微自噬和大自噬（MA）。MA的起始是通过形成从头开始-膜进一步成熟成为一个双膜囊泡，即自噬体。在选择性MA期间，泛素化货物（与K-63多泛素链相连）通过p62等蛋白质传递到自噬体膜[5]自噬体形成的启动是一个调控良好的连接，除其他外，由Beclin-1-VPS34和雷帕霉素复合物I（mTORC1）的哺乳动物靶点进行[8]特别是MA被mTORC1（从此称为mTOR）抑制[9]除了抑制自噬体的启动外，也有人认为mTOR通过调节磷酸酶PP2A直接作用于ATG[10]因此，不同的ATG标记物可用于监测自噬（参见[11]). 一种重要的蛋白质是Beclin-1，主要负责自噬体组装和其他ATG的募集[12]例如，ATG5-ATG12/ATG16属于早期自噬体形成所必需的ATG。此外，配合物对LC3-II转换也很重要[13],[14]是一种常用的自噬蛋白标记物。为了估计自噬通量，可以确定未结合LC3-I在膜结合LC3-II中的形成。通过自噬实现蛋白质传递的另一个重要蛋白质是p62/SQSTM1（p62）。一般来说，因为自噬是一个高度动态的过程；必须明确区分降解受损和自噬流量减少。
为了监测MA在衰老过程中的变化，本研究将通过分析年轻、成年和老年小鼠脑组织以及衰老的人成纤维细胞中的不同ATG来比较MA。为了验证MA的功能性，还将对作为ALP底物的铁蛋白H进行定量。最后，我们将研究mTOR在两种“衰老模型”中对MA的作用，量化mTOR并分析其靶蛋白p70S6K（Thr389）和4E-BP1（Thr37/Tr46）。
2.材料和方法
2.1. 细胞培养
细胞培养材料来自Biochrom，所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich。人类皮肤成纤维细胞取自德国乌尔姆大学Scharffetter-Kochanek教授善意提供的一名1岁捐赠者的包皮组织。细胞在DMEM（10%胎牛血清（FBS）和1%胎牛血清）中生长L（左）-谷氨酰胺）并保存在5%CO中2温度37°C，湿度95%。细胞每周传代一次或达到85%融合率时传代。具有60个群体加倍（PD）的成纤维细胞被定义为“老的、衰老的”细胞，多达20个为“年轻细胞”。使用最终浓度为250 nM的Conanamycin A（ConA，Sigma-Aldrich，C9705）抑制溶酶体活性。
2.2. 老鼠
C57/BL/6 J雄性小鼠被安置在聚碳酸酯笼中，接受标准饮食，并保持在标准的光-暗循环下。小鼠在不同年龄段（8–10周龄（幼鼠）、6个月龄（成人）和18–25月龄（大鼠）通过颈椎脱位处死。立即将大脑置于液氮中，随后将其储存在−80°C下进行进一步分析。为了进行免疫印迹分析，使用pH 6.8的60 mM咪唑/盐酸溶解缓冲液，通过Potter-Elvehjem均质法对脑组织进行均质化。蛋白质浓度通过Bradford分析（BioRad，5000006）测定，免疫印迹分析如下所述。
2.3. 免疫印迹分析
为了进行蛋白质定量，采集对照组和处理过的细胞，进行裂解，并通过Lowry分析测定蛋白质浓度（BioRad，5000111）。此外，将20µg蛋白裂解物添加到Laemmli缓冲液（0.25 M Tris（pH 6.8）、40%甘油、8%十二烷基硫酸钠、0.03%橙g（Carl Roth，0318.2）中，并加载到12%或15%丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE上（德国慕尼黑BioRad）。然后，将蛋白质转移到硝化纤维素（VWR，10600002）中，然后在RT时在Odyssey©阻断缓冲液（LI-COR Biosciences，927-40003）中阻断1 h。用一级抗体孵育1 h，并使用以下抗体：兔单克隆铁蛋白h抗体（Cell signaling，3998 S），兔和鼠单克隆GAPDH抗体（Abcam，ab8245，ab37168）、鼠单克隆p62抗体（Abcam，ab56416）、兔单克隆Beclin-1抗体（细胞信号，3738 S）、鼠单克隆ATG5-7C6抗体（特异性识别55 kDa的ATG5-ATG12蛋白复合物，NanoTools 0262-100）和LC3抗体（特别识别18 kDa下的LC3-I和16 kDa上的LC3-II（NanoTools，0231-100）。为了确定mTOR途径，我们使用了mTOR底物抗体采样器试剂盒（细胞信号，#9862）和针对基础底物蛋白p70S6激酶（细胞信号传递，2708 P）和4E-BP1（细胞信号传导，5492 S）的抗体。根据制造商的规范使用二级抗体（所有LI-COR生物科学），并使用奥德赛红外成像系统（LI-COR Biosciences）对膜进行定量。使用Image Studio™软件（LI-COR Biosciences）进行斑点定量。
2.4. 年轻和老年小鼠脑组织铁蛋白H的免疫组织化学染色
使用兔单克隆铁蛋白H抗体（Cell signaling，3998 S）、EnVision+System-HRP（DAB）（Dako，K4010）以及苏木精-伊红对石蜡包埋脑切片（4µm）进行染色并分析铁蛋白H，以评估组织学。使用蔡司公司的MIRAX数字幻灯片扫描仪生成代表性图像，并使用MIRAX Viewer 1.2进行拍照。
3.结果
3.1. 青年、成年和老年小鼠脑组织中MA的研究
为了分析MA在衰老过程中的潜在差异，我们分析了年轻、成年和老年小鼠脑组织中的不同ATG，如p62、ATG5-ATG12和Beclin-1(A-C）。总的来说，定量显示所有分析的蛋白质随着年龄的增加而总体减少，特别是对于ATG5-ATG12和Beclin-1，这些值显著降低。为了研究mTOR的潜在影响，我们还量化了基础mTOR水平，获得了老鼠脑样本中显著增加的蛋白质水平(). 为了评估mTOR的活性，我们计算了磷酸化与p70S6K和4E-BP1的基础形式的比率(A-F），表明老年小鼠组织中存在较强的mTOR活性。此外，我们还分析了所有三种老化条件下的铁蛋白H蛋白水平，因为该蛋白的降解在很大程度上取决于功能性MA。我们进行了免疫组织学分析（IHC）(A） 以及幼年、成年和老年小鼠脑组织中蛋白质的免疫印迹分析(B） ●●●●。正如我们所见，在这两种情况下，老鼠脑样本中的铁蛋白H值都显著较高。
年轻、成年和老年C57BL/6J雄性小鼠自噬相关蛋白的检测。小组描述了C57BL/6J雄性小鼠年轻、成年和老年脑组织中（A）p62、（B）ATG5-ATG12和（C）Beclin-1的免疫印迹分析。四条车道代表每个年龄组四只单独的老鼠。所有数据均与GAPDH相关，年轻对照组被设置为100%。使用单向方差分析计算年轻组织、成年组织和老年组织之间的统计显著性差异，然后进行Tukey的事后检验，结果显示*p<0.05，**p<0.01，均与年轻对照组相比。
年轻、成年和老年C57BL/6J小鼠脑组织中mTOR蛋白水平的相对定量。为了量化mTOR蛋白水平，按照上述方法制备样品（见方法），并分析所有与GAPDH相关的数据，将年轻对照组设置为100%。使用单向方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验（post-hoc test）获得年轻、成年和老年小鼠脑组织样本之间的统计显著性差异，结果显示**p<0.01，均与年轻对照组相比。
用p70S6K和4E-BP1测定年轻、成年和老年C57BL/6J小鼠脑组织中的mTOR活性。面板（A）显示了p-p70S6K的含量，而面板（B）显示了C57BL/6J雄性小鼠幼年、成年和老年小鼠脑组织中蛋白质的基本含量。免疫印迹显示每个年龄组有四只小鼠。在面板（C）中，给出了p-p70S6K与基础p70S6K的比值。面板（D-F）显示4E-BP1的分析。面板（D）显示p-4E-BP1的量，然后是面板（E），表示基础4E-BPl蛋白的量。p-4E-BP1与4E-BP1的比例在面板（F）中给出。所有数据均根据GAPDH进行分析，数据显示为与年轻对照组相关的百分比。使用单向方差分析计算年轻、成年和老年小鼠脑样本之间的统计显著性差异，然后进行Tukey的事后检验，结果显示*p<0.05和**p<0.01，均与年轻对照组相比。。
年轻、成年和老年C57BL/6J小鼠脑组织中铁蛋白H的稳态水平。小组（A）显示了年轻和老年小鼠脑切片中铁蛋白H分布的代表性免疫组织化学。面板（B）显示了C57BL/6J雄性小鼠幼年、成年和老年小鼠脑组织中铁蛋白H的蛋白表达。免疫印迹显示每个年龄组有四只小鼠。所有数据均为与GAPDH相关的蛋白质水平，将年轻对照组设为100%，使用单向方差分析计算年轻、成年和老年小鼠脑组织之间的统计显著性差异，然后进行Tukey的事后检验，结果显示**p<0.01，均与年轻对照组相比。
3.2. 自噬相关蛋白标记物在青年和老年成纤维细胞中的蛋白表达
为了监测MA在细胞中的年龄相关性变化，我们分析了成纤维细胞中ATGs p62、ATG5-ATG12和Beclin-1的相对蛋白表达(B-D）。为了进一步估计自噬通量，我们通过LC3-II/LC3-I与溶酶体抑制剂ConA（ConA）的比值来量化LC3-II的转化(A） ●●●●。我们观察到，年轻对照组（无ConA）的LC3-II/LC3-I比率比接受ConA治疗的24小时年轻对照组显著增加，这比老年细胞的LC3-II比率高4倍。为了分析蛋白质向溶酶体的传递，我们量化了p62(B） 与老细胞相比，年轻细胞中的蛋白质浓度明显较高。将对照细胞p62与用ConA处理的细胞进行比较，检测到p62的值更高，在年轻细胞中与老年细胞相比高达25%。此外，ATG5-ATG12的量化(C） 和Beclin-1(D） 与年轻细胞相比，老年细胞中这两种蛋白的水平显著降低。ConA培养对这两种蛋白质水平没有进一步影响。
年轻和老年细胞中自噬相关蛋白的检测。在年轻和年老的成纤维细胞中进行ATG的相对定量，包括和不包括24小时内接种Conanamycin A（24小时ConA）。通过细胞裂解物中的免疫印迹进行分析（见方法），始终比较未经处理和经24小时ConA处理的样品。面板显示：（A）LC3-II/LC3-I比率的量化，（B）p62的量，（C）ATG5-ATG12的蛋白水平，（D）Beclin-1的量。所有数据均与GAPDH相关，将相应的对照组设定为100%。与相应的对照组相比，对照组和处理细胞之间的统计显著性差异显示为#p<0.05，**p<0.01。
3.3. 使用p70S6K和4E-BP1对年轻和衰老成纤维细胞中的mTOR进行定量并测定其活性
为了阐明mTOR在细胞衰老过程中下调MA的潜在作用，并确认老鼠组织中mTOR、p70S6K和4E-BP1的相对蛋白水平的数据(在年轻和衰老的成纤维细胞中定量A-G）。mTOR的免疫印迹分析显示，与年轻细胞相比，老年细胞的蛋白质水平显著升高。通过测定磷酸化(A/D）和基本形式(B/E）和4E-BP1的比值也表明老细胞中mTOR活性较高。
用p70S6K和4E-BP1测定年轻和老年人成纤维细胞中的mTOR量及其活性。面板显示了年轻和老年人成纤维细胞中（A）磷酸化p-p70S6K和（B）基础p70S6K的水平。面板（C）显示了p-p70S6K与基础p70S6K的计算比率。在面板（D-F）中，显示了第二个目标蛋白4E-BP1的分析，而面板（D）显示了p-4E-BPl的量，面板（E）显示了基础4E-BPI蛋白的量。面板（F）中给出了p-4E-BP1与4E-BPl的计算比率。mTOR分析如图G所示。所有数据都与GAPDH有关，数据以百分比显示，将年轻细胞设置为100%。对照组和治疗组细胞之间的统计显著性差异采用土耳其的事后检验，然后采用Tukey的事后检验进行计算，结果显示***p<0.001，均与年轻人相比。
4.讨论
为了确保细胞蛋白维持，真核细胞采用两种蛋白水解质量控制系统：UPS和ALP。在衰老过程中，细胞功能的逐渐丧失以及周转和修复系统的减少会导致修饰和交联蛋白质聚集体的增加，如脂褐素[15],[16]或高级糖基化终产物[17],[18],[19]在细胞衰老中，我们小组已经报告了20S活性的下降[1],[20],[21]和其他[22],[23]在不同的模型中。为了获得关于MA在衰老过程中变化的更多信息，我们分析了年轻、成年和老年小鼠脑组织中不同的MA相关蛋白(A-C）。特别是对于复杂的ATG5-ATG12和Beclin-1，旧组织中的蛋白质水平会大大降低。这两种蛋白质都负责早期自噬体的形成。先前的研究已经表明，ATG5基因敲除导致自噬底物不可避免地减少向溶酶体的转移[16],[24]此外，先前已经描述过ATG5与ATG12复合物对自噬体的形成至关重要[13],[25]由于ATG5能够与自噬体膜结合，因此它也能将ATG12转移到膜附近。ATG12的栓系活性进一步使LC3-I接近形成LC3-II所必需的自噬膜中的磷脂酰乙醇胺[14]。ATG5-ATG12复合物的结果显示，与幼鼠脑组织相比，老年鼠脑组织中的蛋白质水平显著下降(B） ●●●●。由于ATG12和Beclin-1被认为是被蛋白酶体循环的，溶酶体抑制剂ConA对其蛋白质表达水平没有进一步的影响（如C/D）。因此，这两种蛋白在没有溶酶体抑制剂控制的组织样品中都是良好的MA标记物[26],[27]Beclin-1也是磷脂酰肌醇3-激酶III类（PtdIns3KC3）复合物的关键成分，该复合物调节自噬体的启动并使其他自噬相关蛋白能够募集[12],[28],[29]通过免疫印迹分析，我们能够显示老组织中Beclin-1的稳态水平显著降低。为了进一步验证自噬递送，我们还分析了p62，它在这个过程中起着重要作用（参见[30],[31]). 根据其作为泛素化蛋白和LC3-I之间的连接物的能力，它是一种重要的“传递”酶，用于特异性自溶体降解[32]通过分析p62，我们发现与老细胞相比，年轻细胞中蛋白质的形成率更高。较低的基础p62水平可能是由于蛋白质表达减少或自噬流量增加，这是基于其并入完整的自溶体。因此，有必要对对照细胞和ConA处理的细胞进行比较，以判断自噬流量。老细胞中较低水平的p62会减少蛋白质向自噬膜的转移，从而减缓降解速度。不同的研究报告了溶酶体活性对铁蛋白H的降解。除了蛋白酶体的铁蛋白H周转[33],[34]，ALP似乎主要负责蛋白质的降解[35],[36],[37]假设溶酶体活性被抑制时铁蛋白H水平较高。最近的研究表明，尤其是宏观自噬参与了铁蛋白H的去除[38],[39]。除了ATG水平降低外，铁蛋白H水平升高还可能进一步表明衰老组织中MA的下降。由于大脑中的铁蛋白H水平较高，并且已经描述了衰老过程中大脑铁蛋白水平的增加[40],[41]我们假设MA可能受损是老化过程中铁蛋白H水平升高的原因。为了明确显示MA的损伤，我们额外量化了铁蛋白H，已知铁蛋白H被MA去除[38],[39]。通过IHC和免疫印迹分析分析的铁蛋白H水平清楚地表明，随着年龄的增长，蛋白质水平持续上升，导致老年小鼠脑匀浆中铁蛋白H的水平显著高于年轻小鼠(). 为了证实我们在小鼠组织中的实验结果不是脑细胞组成变化或其他因素导致衰老的结果，我们还对年轻和衰老的成纤维细胞重复了实验，这是Jung等人已经描述和发表的衰老模型。[42]使用这些成纤维细胞还可以将MA相关蛋白与溶酶体抑制剂对照进行比较，从而更好地监测自噬流量。为了抑制溶酶体活性，我们使用了溶酶体抑制剂ConA，它能够通过抑制膜结合的V-ATP酶来阻止溶酶体的酸化[16],[43]因此，我们分析了年轻和老年成纤维细胞中的p62、ATG5-ATG12和Beclin-1(与相应的ConA对照组相比，B-D）和能够证实旧细胞中所有MA相关标记蛋白的显著减少。此外，我们还检查了LC3-I到LC3-II的转换。关于LC3，人们普遍认为，考虑到某些参数（参见[11],[27]). 由于LC3-II也可以被碱性磷酸酶降解，因此需要与溶酶体抑制剂（如ConA）处理过的样品进行比较，以解释为什么我们无法量化小鼠组织样品中的蛋白质。如果不与溶酶体抑制剂进行比较，就不可能得出结论，即LC3-II的含量是由于蛋白质本身的表达增加还是积累增加所致[44]。由于进一步的途径受损，老细胞也可能具有较高的LC3-II基础水平。但我们的结果清楚地表明，与年轻的成纤维细胞相比，老年细胞中LC3-II的形成率显著降低(A） ●●●●。为了进一步研究mTOR是否在MA的年龄相关减少中起作用，我们还分析了其蛋白质和活性水平。mTOR的免疫印迹分析清楚地显示，两个老鼠脑组织中的蛋白质水平显著增加()和老成纤维细胞(G） ●●●●。为了证明该酶是否也更活跃，我们额外分析了p70S6K和4E-BP1，这两种酶都被雷帕霉素影响的mTORC1磷酸化，特别是已知其会削弱自噬[45],[46]这些蛋白质磷酸化程度越高，mTOR活性越高。为了正确估计结果，必须计算磷酸化与各个蛋白质的基础形式的比率，因为目标磷酸化的降低似乎不会伴随着mTOR活性的降低。可能，结果也会受到蛋白质本身基础水平较低的影响。通过测定两种底物的磷酸化量和基础量，我们能够显示出更高的磷酸化率(,)表明老组织和老成纤维细胞中的mTOR活性仍然很高。结合mTOR数量的结果，我们得出结论，mTOR也可能在与年龄相关的自噬失调中发挥决定性作用，同时所有分析的ATG都明显减少，导致旧组织中铁蛋白H水平升高。
总之，我们的结果强调，MA在老年小鼠脑组织和衰老的人成纤维细胞中减少。年轻和老年组织和细胞之间的ATG差异证实了我们的假设，即MA过程可能会下降。MA的损害也可以通过老组织中较高的基础铁蛋白H水平来推测，已知主要通过ALP清除。此外，mTOR的蛋白表达和活性分析显示该酶仍具有较高的活性，这可以进一步促进旧组织和细胞中MA的损伤。进一步阐明MA的途径，以显示mTOR如何影响自噬体的启动，或者转录因子（如STAT3）的变化是否可能是衰老过程中ATG表达减少的原因，对于进一步研究衰老和年龄相关疾病中受损的蛋白质水解和蛋白质积累，这将是一个有趣的方法。
竞争性利益
没有一位作者与这份手稿有任何实际或潜在的利益冲突。
工具书类
1Hohn A.、Konig J.、Grune T.老化中的蛋白质氧化和氧化蛋白质的去除。《保护学杂志》。2013;92:132–159.[公共医学][谷歌学者] 2Friguet B.氧化蛋白质在老化和氧化应激中的降解和修复。FEBS信函。2006;580:2910–2916.[公共医学][谷歌学者] 3Ott C.，Grune T.衰老中的蛋白质氧化和蛋白水解信号。货币。药物设计。2014;20:3040–3051.[公共医学][谷歌学者] 4Klinsky D.J.、Abdelmohsen K.、Abe A.、Abedin M.J.、Abeliovich H.、Acevedo Arozena A.、Zughaier S.M.监测自噬分析的使用和解释指南（第三版）自噬。2016;12(1-222)[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Korolchuk V.I.，Menzies F.M.，Rubinstein D.C.泛素蛋白酶体和自噬溶酶体系统之间的串扰机制。FEBS信函。2010;584:1393–1398.[公共医学][谷歌学者] 6Hohn A.，Grune T.脂褐素：巨自噬的形成、作用和作用。氧化还原生物。2013;1:140–144. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Cuervo A.M.，Wong E.伴侣介导的自噬：在疾病和衰老中的作用。细胞研究。2014;24:92–104. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Moller A.P.、Chabi Y.、Cuervo J.J.、De Lope F.、Kilpimaa J.、Kose M.、von Hirschheydt J.雀形目鸟类性选择的大陆模式分析。进化。2006;60:856–868.[公共医学][谷歌学者] 9Cao Y.、Espinola J.A.、Fossale E.、Massey A.C.、Cuervo A.M.、MacDonald M.E.、Cotman S.L.在幼年神经元类蜡样脂褐质沉积敲除小鼠模型中，自噬被破坏。生物学杂志。化学。2006;281:20483–20493.[公共医学][谷歌学者] 10Reid C.、Rush M.、Jarpe M.、van Vlijmen H.、Dolinski B.、Qian F.、Boriack-Sjodin P.A.单核细胞趋化蛋白与阻断抗体复合物的结构-活性关系。蛋白质工程设计。选择。2006;19:317–324.[公共医学][谷歌学者] 11Massey A.C.、Kaushik S.、Sovak G.、Kiffin R.、Cuervo A.M.伴侣介导的自噬选择性阻断的后果。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2006;103:5805–5810. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12神经元中的Cuervo A.M.自噬：这不全是关于食物的。趋势分子医学。2006;12：461–464。[公共医学][谷歌学者] 13Romanov J.、Walczak M.、Ibiricu I.、Schuchner S.、Ogris E.、Kraft C.、Martens S.自噬体形成期间Atg5-Atg12/Atg16复合物结合膜的机制和功能。EMBO J。2012;31：4304–4317。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Kaushik S.、Massey A.C.、Cuervo A.M.溶酶体膜脂质微域：伴侣介导自噬的新调节器。EMBO J。2006;25:3921–3933. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Hohn A.、Jung T.、Grimm S.、Grune T.脂褐素结合铁是氧化剂的主要细胞内来源：在衰老细胞中的作用。自由基。生物医学。2010;48:1100–1108.[公共医学][谷歌学者] 16Hohn A.、Sittig A.、Jung T.、Grimm S.、Grune T.脂褐素是在应激诱导的过早衰老的人类成纤维细胞中独立于宏观自噬和溶酶体活性形成的。自由基。生物医学。2012;53:1760–1769.[公共医学][谷歌学者] 17Grimm S.、Ott C.、Horlacher M.、Weber D.、Hohn A.、Grune T.高级糖基化产物诱导免疫蛋白酶体的形成：RAGE和Jak2/STAT1的参与。生物化学杂志。2012;448:127–139.[公共医学][谷歌学者] 18Ott C.、Jacobs K.、Haucke E.、Navarrete Santos A.、Grune T.、Simm A.高级糖基化终产物在细胞信号传导中的作用。氧化还原生物。2014;2:411–429. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Simm A.、Casselmann C.、Schubert A.、Hofmann S.、Reimann A.、Silber R.E.年龄相关的年龄受体表达变化：愤怒上调与人类心脏功能障碍相关。老年病学扩展。2004年；39:407–413.[公共医学][谷歌学者] 20Sitte N.、Huber M.、Grune T.、Ladhoff A.、Doecke W.D.、Von Zglinicki T.、Davies K.J.成纤维细胞有丝分裂后衰老过程中脂褐素/类胡萝卜素对蛋白酶体的抑制。美国财务会计准则委员会J。2000;14:1490–1498.[公共医学][谷歌学者] 21Grune T.、Jung T.、Merker K.、Davies K.J.在氧化应激、衰老和疾病期间，减少由蛋白质聚集体、包涵体、斑块、脂褐素、类胡萝卜素和“攻击性蛋白”引起的蛋白水解。国际生物化学与细胞生物学杂志。2004年；36:2519–2530.[公共医学][谷歌学者] 22Chondrogianni N.，Gonos E.S.哺乳动物衰老中的蛋白酶体功能障碍：步骤和相关因素。老年病学扩展。2005;40:931–938.[公共医学][谷歌学者] 23Petropoulos I.、Conconi M.、Wang X.、Hoenel B.、Bregegere F.、Milner Y.、Friguet B.氧化修饰蛋白的增加与老化表皮细胞中蛋白酶体活性和含量的降低有关。杰伦托尔。生物科学。医学科学。2000;55：B220–B227。 [谷歌学者] 24Tashiro K.、Shishido M.、Fujimoto K.、Hirota Y.、Yo K.、Gomi T.、Tanaka Y.皮肤成纤维细胞中与年龄相关的自噬破坏调节细胞外基质成分。生物化学。生物物理学。Res Commun公司。2013;443:162–172.[公共医学][谷歌学者] 25Hanada T.、Noda N.N.、Satomi Y.、Ichimura Y.、Fujioka Y.、Takao T.、Ohsumi Y.。Atg12-Atg5结合物在自噬中具有新型的类E3蛋白脂质氧化活性。生物学杂志。化学。2007;282:37298–37302.[公共医学][谷歌学者] 26Cortez M.R.、Pinho A.P.、Cuervo P.、Alfaro F.、Solano M.、Xavier S.C.、Jansen A.M.Trypanosoma cruzi（Kinetoplastida Trypanomatidae）：玻利维亚科恰班巴安第斯山谷野生环境中传播循环的生态学。实验寄生虫。2006;114：305–313。[公共医学][谷歌学者] 27Klinsky D.J.、Abdalla F.C.、Abeliovich H.、Abraham R.T.、Acevedo-Arozena A.、Adeli K.、Zuckerbraun B.监测自噬分析的使用和解释指南。自噬。2012;8:445–544. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Massey A.C.、Zhang C.、Cuervo A.M.伴侣介导的衰老和疾病中的自噬。货币。顶部。开发生物。2006;73:205–235.[公共医学][谷歌学者] 29Ratcliff S.L.、Brown A.、Rosenberg L.、Rosenberg M.、Robert R.S.、Cuervo L.J.、Meyer W.J.，第3版《疼痛和焦虑治疗方案对急性小儿烧伤患者的疗效》。伯恩斯。2006;32:554–562.[公共医学][谷歌学者] 30Ichimura Y.，Komatsu M.通过自噬选择性降解p62。精液免疫病理学。2010;32:431–436.[公共医学][谷歌学者] 31Klinsky D.J.、Abdelmohsen K.、Abe A.、Abedin M.J.、Abeliovich H.、Acevedo Arozena A.、Zughaier S.M.监测自噬分析的使用和解释指南（第三版）自噬。2016;12（1-222）[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32小松M.，一村Y.自噬选择性降解p62的生理意义。FEBS信函。2010;584：1374–1378。[公共医学][谷歌学者] 33De Domenico I.、Vaughn M.B.、Li L.、Bagley D.、Musci G.、Ward D.M.、Kaplan J.Ferroportin介导的铁蛋白铁动员先于蛋白酶体降解铁蛋白。EMBO J。2006;25:5396–5404. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Voss P.、Horakova L.、Jakstadt M.、Kiekebusch D.、Grune T.铁蛋白氧化和蛋白酶体降解：抗氧化剂的保护。自由基。物件。2006;40:673–683.[公共医学][谷歌学者] 35Kidane T.Z.、Sauble E.和Linder M.C.从铁蛋白中释放铁需要溶酶体活性。美国生理学杂志。细胞生理学。2006;291（C445-455）[公共医学][谷歌学者] 36Asano T.、Komatsu M.、Yamaguchi-Iwai Y.、Ishikawa F.、Mizushima N.、Iwai K.铁蛋白传递到缺铁细胞和缺铁细胞溶酶体的不同机制。分子细胞生物学。2011年；31:2040–2052. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Radisky D.C.，Kaplan J.细胞溶质铁蛋白中的铁可以通过人类成纤维细胞中的溶酶体降解进行回收。生物化学杂志。1998年；336:201–205.（第1部分）[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38侯伟、谢毅、宋旭、孙旭、洛泽M.T.、泽海杰、3rd、唐D.自噬通过铁蛋白降解促进铁下垂。自噬。2016;12:1425–1428. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Mancias J.D.、Wang X.、Gygi S.P.、Harper J.W.、Kimmelman A.C.定量蛋白质组学将NCOA4确定为介导铁蛋白噬的货物受体。自然。2014;509:105–109. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Connor J.R.、Menzies S.L.、Martin S.M.、St、Mufson E.J.正常和老年人脑中转铁蛋白、铁蛋白和铁的细胞分布。《神经科学杂志》。物件。1990;27:595–611.[公共医学][谷歌学者] 41Connor J.R.、Snyder B.S.、Arosio P.、Loefler D.A.、LeWitt P.对老年人、帕金森病患者和阿尔茨海默病患者大脑中特定区域的异铁蛋白进行定量分析。神经化学杂志。1995;65:717–724.[公共医学][谷歌学者] 42Jung T.、Hohn A.、Catalgol B.和Grune T.年轻和衰老成纤维细胞中氧化蛋白损伤的年龄相关差异。架构（architecture）。生物化学与生物物理学。2009;483:127–135.[公共医学][谷歌学者] 43Sobota J.A.、Back N.、Eipper B.A.、Mains R.E.。液泡H+-ATPase V0亚单位抑制剂可防止溶酶体和分泌途径蛋白质的分离。细胞科学杂志。2009;122:3542–3553. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Diaz J.A.、Cuervo C.、Valderrama A.M.、Kohles J.Valdecoxib可有效缓解急性踝关节扭伤后的疼痛。国际医学研究杂志。2006;34:456–467.[公共医学][谷歌学者] 45Massey A.C.、Kiffin R.、Cuervo A.M.衰老中的自噬缺陷：寻找“紧急出口”？细胞周期。2006;5:1292–1296.[公共医学][谷歌学者] 46Giordano S.、Darley-Usmar V.、Zhang J.自噬是神经退行性疾病中一种重要的细胞抗氧化途径。氧化还原生物。2014;2:82–90. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
