靶向硝化应激减轻顺铂诱导的耳蜗LIM结构域4下调和耳毒性

摘要

图形摘要

硝化应激和LMO4下调在顺铂诱导耳毒性中的作用示意图。众所周知，顺铂通过激活NOX3诱导耳蜗氧化应激。顺铂诱导的活性氧生成最终导致LMO4硝化并降低其在耳蜗中的水平。一般来说，LMO4充当蛋白质复合物的支架并调节细胞凋亡。顺铂诱导的LMO4减少可能会破坏LMO4相关的抗凋亡机制，从而促进耳蜗凋亡和耳毒性。

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集锦

1.简介

顺铂是第一代以铂为基础的抗肿瘤药物，用于治疗膀胱癌、宫颈癌、肺癌（非小细胞）、卵巢癌、头颈癌（鳞状细胞）、睾丸癌和恶性间皮瘤。据美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）统计，所有癌症患者中有10-20%的人服用顺铂或其类似物。顺铂阻止细胞分裂以阻止肿瘤生长，并诱导程序性细胞死亡以减小肿瘤大小。然而，顺铂诱导的凋亡并不局限于肿瘤细胞，而是延伸到敏感细胞，如耳蜗的外毛细胞。因此，耳毒性是顺铂的主要副作用，它严重影响癌症幸存者的生活质量，并对儿童造成毁灭性后果，因为它影响他们的言语和语言发展、教育和社会融合[1],[2]虽然在描述顺铂诱导耳毒性的机制方面取得了进展[3],[4],[5],[6],[7]，促进耳蜗凋亡的信号通路尚未完全确定。因此，我们尚未全面解决这一重要问题。

在迄今为止报道的耳蜗细胞死亡机制中，氧化应激被认为在顺铂耳毒性中起着因果作用[3],[8]顺铂激活NOX3酶，增加内耳中超氧自由基的产生[9]此外，在顺铂耳毒性中检测到iNOS通路的激活和一氧化氮的生成[10],[11]虽然抗氧化剂被用来防止顺铂的耳毒性，但它们并不能提供全面的解决方案，因为其中许多抗氧化剂会干扰顺铂的抗癌活性。因此，有必要确定其他下游干预目标。我们报道了顺铂诱导的耳蜗感觉上皮蛋白质硝化增加[12]并检测到耳蜗蛋白硝化与顺铂诱导的听力损失之间有很强的相关性。硝化应激是后天性听力损失的一个重要因素，因为在一些内耳病变中检测到硝基酪氨酸水平增加，并且与耳蜗应激反应相关的通路有关[13],[14],[15],[16],[17],[18]靶向硝化应激似乎是预防顺铂诱导耳毒性的可行策略，因为与PNDC联合治疗不会干扰紫杉醇的抗癌活性[19].

我们的研究确定了顺铂耳毒性中耳蜗LMO4的硝化作用[4]作为蛋白质相互作用的分子适配器，LMO4形成转录复合物，从而调节细胞存活和细胞死亡[20],[21],[22],[23].LMO4在内耳发育中起着重要作用[24]其下游靶STAT3也与顺铂耳毒性有关[25],[26],[27].我们在外毛细胞共同定位LMO4和硝基酪氨酸，这是顺铂诱导耳毒性的主要靶点[4]蛋白质硝化可以调节磷酸化级联，改变蛋白质功能，并促进硝化蛋白质的蛋白水解降解[28],[29],[30],[31],[32],[33],[34]与这些报告一致，顺铂诱导的LMO4硝化与LMO4蛋白水平的显著降低有关，不仅在听觉细胞中，而且在肾细胞和神经细胞中，这些细胞也容易受到顺铂的毒性副作用的影响[35]据报道，LMO4的抑制可促进其他模型中的细胞凋亡[36],[37].

在本研究中，我们的目的是通过阐明顺铂诱导的硝化应激、LMO4下调和耳毒性之间的关键联系，验证和扩展先前的相关观察。根据我们的研究和其他报告，我们假设顺铂诱导的硝化应激降低LMO4的表达，从而损害抗凋亡机制，促进耳毒性。我们通过两种方法客观地验证了我们的假设：1）使用PNDC选择性地抑制硝化应激；2）通过基因调控内耳感觉上皮细胞中LMO4的表达。

2.材料和方法

3.结果

3.1. PNDC处理可抑制顺铂诱导的蛋白质硝化

我们报道了顺铂治疗增加了大鼠耳蜗和UBOC1细胞培养物中蛋白质的硝化作用[4],[35]为了确定PNDC治疗是否能阻止顺铂诱导的蛋白质硝化，在10µm顺铂治疗前1 h用50µm SRI110处理UBOC1细胞。24小时后，用抗硝基酪氨酸对细胞进行探测，并用共焦显微镜观察硝基酪氨酸的免疫反应。与我们之前的研究一致，顺铂显著增加了硝基酪氨酸的水平并诱导了细胞凋亡，这在浓缩细胞核中很明显。SRI110联合治疗可减轻顺铂诱导的硝基酪氨酸增加以及细胞核内观察到的凋亡变化(图1). 这表明PNDCs可以抑制顺铂诱导的内耳细胞硝化应激。

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图1

SRI110减弱顺铂诱导的硝基酪氨酸增加。A） 在用10µm顺铂处理的UBOC1细胞中检测到硝基酪氨酸水平增加以及浓缩细胞核（白色箭头）。与50µm SRI110共同处理可减弱顺铂诱导的硝基酪氨酸增加。红色染色表示抗硝基酪氨酸的免疫反应，蓝色表示DAPI核染色，绿色表示阳萎素肌动蛋白染色。这些图像代表了四种生物复制。比例尺，20µm。（B） 在顺铂处理的细胞中，硝基酪氨酸免疫染色的平均像素强度显著升高（***P<0.0001），而SRI110联合处理使其减弱（***P<0.001）。结果表示为平均值±标准偏差，n=4。（C） 抗肌球蛋白VIIa免疫染色（紫色）显示UBOC1细胞的分化状态。该图像代表了三个生物复制品。比例尺，20µm。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

3.2. 硝化应激的抑制以剂量依赖的方式减弱了顺铂诱导的LMO4的下调

我们以前的研究表明，除了增加耳蜗蛋白的硝化作用外，顺铂治疗还降低了耳蜗中LMO4的水平。我们假设顺铂诱导的硝化应激导致LMO4蛋白水平下降，因为硝化蛋白是蛋白酶体降解的潜在候选蛋白[28],[31]为了测试清除过氧亚硝酸盐是否能够减弱顺铂诱导的LMO4下调，我们在10µm顺铂治疗前1 h用两种不同剂量的SRI110（25或50µm）处理UBOC1细胞。24小时后，从细胞中提取蛋白质，在凝胶上分离，转移到聚偏氟乙烯膜上，并用抗LMO4进行探测。检测到的LMO4蛋白带通过与肌动蛋白带的归一化进行量化。与对照组相比，顺铂治疗降低了LMO4的水平，为58%，而与25或50µm SRI110联合治疗后，LMO4水平分别为70%和88%(图2). 通过免疫细胞化学分析生成的散点图支持了这些观察结果，这表明SRI110联合治疗（50µm）不仅减弱了顺铂诱导的硝基酪氨酸水平的增加，而且也减弱了LMO4水平的降低。这些发现表明，清除过氧亚硝酸盐以剂量依赖的方式减弱了顺铂诱导的LMO4下调，并表明顺铂诱导硝化应激是LMO4水平下降的部分原因。

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图2

SRI110以剂量依赖的方式减弱顺铂诱导的LMO4下调。A） 抗LMO4的免疫印迹表明，顺铂治疗显著降低了LMO4蛋白水平。25µm SRI110的联合治疗并没有改变顺铂诱导的LMO4水平下降。然而，与50µm SRI110联合治疗显著减弱了顺铂诱导的LMO4减少，表明SRI110治疗具有剂量依赖性。结果表示为平均值±标准偏差，n=4.**与对照组相比，P<0.01。B） 散点图显示，对照细胞中LMO4（橙色）大量表达，而顺铂治疗诱导硝基酪氨酸（红色）水平增加。SRI110联合治疗减弱了顺铂诱导的LMO4水平下降。这些地块是生物复制的代表。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

3.3. LMO4的下调加剧了顺铂诱导的细胞毒性

为了确定LMO4的下调是否可以促进顺铂的耳毒性作用，我们使用SiRNAs沉默了UBOC1细胞中LMO4表达，并使用细胞计数评估了顺铂诱导的细胞毒性作用。用4种不同的LMO4 SiRNAs转染UBOC1细胞，并用抗LMO4免疫印迹法分析LMO4蛋白水平的降低。使用肌动蛋白使LMO4的表达正常化。用SiRNAs抑制LMO4导致LMO4蛋白水平降低40%。用顺铂治疗野生型细胞仅导致细胞活力下降18%。然而，用5µm顺铂治疗LMO4缺陷细胞加剧了顺铂诱导的细胞毒性，细胞计数下降了46%(图3). 与顺铂治疗的野生型细胞相比，LMO4缺陷细胞中浓缩核的数量增加也支持这一点。这些发现表明，在缺乏LMO4的情况下，内耳细胞对顺铂诱导毒性的敏感性显著增强，这与其他报告一致，这表明LMO4抑制促进细胞凋亡[37]用干扰RNA处理的UBOC1细胞的存活率与对照细胞相似。

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图3

LMO4沉默会加剧顺铂诱导的细胞死亡。（A） 使用siRNA抑制UBOC1细胞中的LMO4。与顺铂处理的野生型UBOC1细胞相比，用5µm顺铂处理LMO4缺陷细胞显著减少了存活细胞的数量。结果表示为平均值±标准偏差，n=3****P<0.0001。（B） 用抗LMO4免疫印迹法定量siRNAs对LMO4的抑制，并用肌动蛋白标准化。SiRNAs治疗导致LMO4水平下降40%（n=3，*P<0.05）。（C） DAPI核染色显示，顺铂治疗后，LMO4缺陷细胞中的浓缩核（白色箭头）数量远高于野生型细胞。这些图像代表了四个生物复制品。比例尺，20µm。

3.4. LMO4的过表达减弱了顺铂诱导的细胞毒性

由于LMO4调节细胞凋亡，并且下调LMO4促进顺铂诱导的细胞毒性，我们假设LMO4的过度表达将阻止顺铂引起的细胞毒性作用。为了验证这一假设，我们在UBOC1细胞中瞬时过表达LMO4，并使用MTT法评估顺铂的细胞毒性作用。顺铂治疗（5µm）使野生型UBOC1细胞的细胞活力显著降低25%，而LMO4的过度表达不仅可以防止顺铂诱导的细胞死亡，而且可以显著提高细胞活力38%(图4). 这表明，在正常或更高水平下，LMO4发挥保护作用，并防止顺铂诱导的细胞死亡。用抗LMO4免疫印迹法验证LMO4的过度表达，用抗肌动蛋白免疫印迹归一化LMO4。

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图4

LMO4的过度表达可防止顺铂诱导的细胞活力下降。（A） MTT分析表明，顺铂处理降低了UBOC1细胞的活性。LMO4的过度表达减弱了顺铂诱导的细胞活力下降。结果表示为平均值±标准偏差，n=3***P<0.001，****P<0.0001。（B） 免疫印迹显示转染效率高，LMO4在过度表达细胞中的表达增加了117%，但在对照细胞中没有增加。LMO4的表达与肌动蛋白的表达一致（n=3，*P<0.05）。

3.5. 硝化应激抑制减轻顺铂诱导的细胞凋亡

我们的结果表明，LMO4的表达水平是顺铂诱导细胞毒性的关键决定因素，硝化应激的抑制减弱了顺铂诱导的LMO4下调。因此，清除过氧亚硝酸盐也有望减弱顺铂诱导的细胞毒性，这种毒性主要通过细胞凋亡发生。为了验证这一假设，我们用50µm的SRI110处理UBOC1细胞，并通过流式细胞术评估活性caspase 3（凋亡的生物标志物）的表达。与对照组相比，顺铂治疗（10µm）诱导UBOC1细胞中活性caspase 3水平显著增加（p>0.001）。SRI110联合治疗可减弱顺铂诱导的caspase水平升高（p>0.001）。在仅用SRI110处理的细胞中，caspase活性与对照组相似(图5). 这表明抑制硝化应激可以阻止顺铂诱导的内耳细胞凋亡。

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图5

对硝化应激的抑制减弱了顺铂诱导的细胞凋亡。插图显示了通过流式细胞术分析检测到的UBOC1细胞中活性caspase 3表达的变化。顺铂治疗诱导活性caspase 3水平升高，而SRI110联合治疗使其减弱。这些图像代表了三种生物复制。结果表示为平均值±标准偏差，n=3***P<0.001。

3.6. 抑制硝化应激减轻顺铂所致听力损失

尽管顺铂在内耳细胞培养模型中的细胞毒性作用通过PNDC治疗得以缓解，但除非在小鼠模型中验证其疗效，否则这种干预方法可能与顺铂诱导的耳毒性无关。因此，我们使用了CBAJ小鼠，这是研究顺铂耳毒性的良好模型[41]连续5天每日给予3mg/kg剂量顺铂治疗。听力在第八天通过ABR测试进行评估(图6A和B）。顺铂治疗导致听阈移动10-15dB，而SRI110每日10 mg/kg剂量的联合治疗通过连续五天口服，减轻了顺铂引起的听力损失（8 kHz时p>0.05）。此外，SRI110联合治疗显著减轻了顺铂诱导的体重减轻(图6C） ●●●●。这表明PNDC可能成为预防顺铂耳毒性的一种有希望的干预方法。

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图6

抑制硝化应激可减轻顺铂诱导的听力损失。（A） 用3 mg/kg剂量的顺铂治疗5天的CBAJ小鼠在第8天引起了听力阈值的10-20 dB的变化。SRI110联合治疗可减轻顺铂引起的听力损失（8 kHz时P<0.05）。图示了从4只小鼠的左耳记录的ABR。结果表示为平均值±标准偏差。（B） 图示了响应点击刺激的典型ABR波形。（C） SRI110联合治疗可防止顺铂诱导的体重减轻。结果表示为平均值±标准偏差，n=5。

4.讨论

硝化蛋白在介导细胞死亡反应中起着重要作用，在几个实验模型中，其信号传导已被有效地靶向抑制细胞死亡[42],[43],[44]然而，顺铂诱导耳毒性的硝化应激机制仍只有部分了解。在以前的研究中，我们报道了顺铂治疗导致耳蜗LMO4硝化和下调[4],[35]在这里，我们提供了证据，证明SRI110选择性抑制硝化应激可以减弱顺铂诱导的LMO4下调和听觉感觉上皮细胞培养中的凋亡。此外，SRI110联合治疗减轻了顺铂诱导的CBA/J小鼠听力损失，表明硝化应激在顺铂耳毒性中的功能意义。此外，细胞培养中LMO4的短暂过表达可阻止顺铂诱导的细胞毒性，而LMO4抑制则会加重顺铂的毒性作用。总之，这些发现表明顺铂诱导的硝化应激和LMO4的下调在促进顺铂诱导耳毒性中起着关键作用。

在本研究中，使用UBOC1细胞培养物和CBA/J小鼠来确定LMO4和硝化应激对顺铂耳毒性的贡献。这些是研究耳毒性的良好实验模型，并已被其他研究人员用于研究顺铂诱导耳毒性的分子机制[5],[41]我们在所有实验中使用了完全分化的UBOC1细胞，通过测试毛细胞生物标记物肌球蛋白VIIa的表达进行了验证。在动物研究中，只使用雄性小鼠，以避免性激素，特别是雌激素的任何变化对LMO4信号的潜在干扰，因为已知LMO4与雌激素受体结合并抑制其反式激活活性[45]CBA/J小鼠按照5天的治疗方案服用顺铂，以模拟顺铂的临床应用，并通过记录顺铂治疗前后的听觉脑干反应来评估其听力损失。药物级顺铂用于体内研究，而SRI110则由内部合成[19]通过免疫印迹和免疫细胞化学分析药物治疗的效果，并按照以前的出版物所述验证了硝基酪氨酸和LMO4抗体免疫反应的特异性[4],[35]用抗LMO4的免疫印迹法验证了LMO4在UBOC1细胞培养中的瞬时过表达和抑制的效率。

顺铂的耳毒性副作用主要由氧化应激介导[3],[9]蛋白质硝化是氧化应激的一个重要后遗症。同样，顺铂治疗增加了UBOC1细胞中硝基酪氨酸的水平。此外，它还增加了活性caspase 3的表达，表明顺铂在这些细胞培养物中诱导了凋亡。由于蛋白质硝化可以根据硝化蛋白质的功能特性引起生物功能的重大变化，因此鉴定硝化蛋白质对理解其功能意义至关重要。我们之前通过免疫沉淀法和基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱法在Wistar大鼠中确定了顺铂诱导的耳蜗LMO4硝化作用[4]验证了硝基酪氨酸和LMO4在UBOC1细胞中的共定位[35]除LMO4硝化外，顺铂治疗还降低了LMO4的水平，这与有关硝化蛋白是蛋白酶体降解的潜在靶点的报告一致[31],[43],[46]然而，耳蜗LMO4水平降低在顺铂诱导的耳毒性中的功能意义尚不完全清楚。

LMO4具有介导细胞毒性的潜力，因为它通过调节抑制或促进相关基因转录的转录复合物的形成来控制调节细胞存活和细胞死亡的途径[20],[22],[23],[45],[47]我们最近的研究表明，顺铂诱导的LMO4硝化和下调不仅发生在听觉细胞（UBOC1）中，也发生在肾脏（HK2）和神经元（SH-SY5Y）细胞中[35]为了阐明LMO4在顺铂诱导的细胞毒性中下调的功能意义，我们使用pRK5载体在UBOC1细胞中过度表达LMO4。LMO4的短暂过表达不仅阻止了顺铂在该剂量下诱导的细胞毒性，而且显著提高了细胞活力，表明LMO4具有潜在的抗凋亡作用。此外，用siRNAs沉默LMO4加剧了顺铂诱导的UBOC1细胞的细胞毒性，这与其他表明LMO4抑制促进凋亡的报告一致[37]总之，这些结果表明，在顺铂介导的细胞毒性中，LMO4蛋白水平和细胞凋亡之间存在直接联系。

为了解释硝化应激对顺铂诱导的LMO4水平下降以及由此引起的耳毒性的贡献，我们使用SRI110清除顺铂诱导产生的过氧亚硝酸盐。SRI110是一种基于锰（III）双羟基苯基二吡咯亚甲基的过氧亚硝酸盐分解催化剂，设计用于选择性靶向过氧亚硝酸盐[19]靶向促进顺铂毒性副作用的硝化应激途径似乎是一种有吸引力的干预策略，因为它最大限度地减少了顺铂抗癌活性的潜在干扰，而顺铂的抗癌活性主要由DNA加合物的形成介导。据报道，相关的金属卟啉可以防止顺铂诱导的蛋白质硝化和肾毒性[48]SRI110作为一种潜在的耳科保护化合物具有几个优点，原因如下。首先，它不干扰紫杉醇的抗癌活性。其次，它保留了超氧自由基，超氧自由基可发挥其他信号作用，尤其是在学习和记忆方面。第三，它的口服生物利用度使其能够在整个癌症治疗过程中方便、持续地使用。在本研究中，SRI110对硝化应激的抑制降低了顺铂诱导的硝基酪氨酸和caspase 3水平的增加，以剂量依赖性的方式减弱了顺铂导致的UBOC1细胞LMO4下调，并减轻了顺铂引起的CBA/J小鼠听力损失和体重减轻。

5.结论

我们的结果提供了令人信服的证据，表明PNDCs可以有效地用于缓解硝化应激诱导的耳病，并且可以口服以选择性地靶向过氧亚硝酸盐，但目前尚不清楚其有任何有益作用。这些发现意义重大，可能具有更广泛的意义，因为硝化应激不仅是顺铂所致听力损失的一个重要因素，而且也是其他类型后天性听力损失的重要因素，如噪声所致和年龄相关性听力损失[13],[17]此外，通过定义顺铂诱导的听力损失、硝化应激和LMO4下调之间的关键联系，LMO4也在顺铂诱导肾细胞和神经细胞损伤中检测到[35]本研究为确定和开发新的治疗干预靶点提供了坚实的基础。反过来，这些结果将增加这种至关重要的救生药物的临床效用，并改善接受顺铂治疗的癌症幸存者的生活质量。

基金

本研究得到了韦恩州立大学向SJ提供的启动资金以及NIEHS向城市应对环境压力中心（CURES）提供的P30赠款（P30 ES020957）的支持。NIH中心P30 CA022453拨款部分支持显微镜、成像和细胞测定资源核心。

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