氧化还原生物。2016年12月；10: 233–242.
羟基酪醇通过不稳定的铁螯合作用抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡信号传导
希腊Ioannina大学医学院健康科学学院生物化学实验室，451 10
2016年9月9日收到；2016年10月3日修订；2016年10月11日接受。
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摘要
尽管众所周知，地中海饮食在维持人类健康方面发挥着重要作用，但其潜在的分子机制在很大程度上仍然未知。本研究的目的是阐明含邻二羟基的天然化合物在H中的潜在作用2O（运行）2-诱导DNA损伤和凋亡。为此，研究了橄榄油中的主要酚醇，即羟基酪醇和酪醇，在氧化应激条件下对培养细胞的保护能力。羟基酪醇缓解细胞内不稳定铁水平的能力与对H的保护作用之间有很强的相关性2O（运行）2-诱导DNA损伤和凋亡。另一方面，缺乏邻二羟基的酪醇是无效的。此外，羟基酪醇（但不是酪醇）能够减少H的晚期持续期2O（运行）2-诱导JNK和p38磷酸化。细胞暴露于H后细胞内铁稳态的紊乱2O（运行）2，在DNA损伤的诱导和凋亡信号的启动中都发挥了关键作用。上述结果表明，含有邻二羟基的膳食化合物对氧化应激诱导的细胞损伤的保护作用与其影响细胞内不稳定铁稳态变化的能力有关。
缩写：ERK，细胞外信号调节激酶；胎牛血清；HTy，羟基酪醇；JNK，c-Jun NH公司2-末端激酶；丝裂原活化蛋白激酶；PI，碘化丙啶；PARP-1，聚ADP-核糖聚合酶1；SIH，水杨醛异烟酰胺肼；Ty，酪醇
关键词：细胞凋亡、羟乙基溶胶、活性铁、有丝分裂原活化蛋白激酶、氧化还原信号、酪氨醇
1.简介
越来越多的证据表明，地中海饮食中大量存在的许多天然化合物通过预防氧化应激相关疾病有助于维护人类健康[1],[2],[3]经常食用橄榄油以及水果和蔬菜被认为与这些健康促进作用有关，并且对其成分的作用方式进行了广泛调查[4],[5].
除了单不饱和脂肪酸的独特来源外，橄榄油还含有不同的酚类化合物，如酚酸、酚醇、黄酮、裂环烯醚和木脂素[5],[6]羟乙基醇（3,4-二羟苯乙醇，HTy）和酪醇（3-羟基苯乙醇，Ty）被认为是橄榄油中最丰富和最具代表性的酚醇[7],[8]这些是具有类似分子结构的相当亲水的化合物，仅在酚环的位置3上有所不同，其中Ty的氢原子被HTy中的羟基取代，从而产生邻二羟基部分().
本研究考察了橄榄油酚类组分（A）羟基酪醇（HTy）和（B）酪醇（Ty）的主要成分的化学结构。HTy中的邻二羟基部分用虚线椭圆高亮显示。
有人认为HTy可以作为活性自由基的清除剂，从而在氧化应激条件下保护细胞[9],[10],[11],[12]此外，它可以通过Nrf2活化诱导抗氧化酶的表达[13],[14],[15],[16]，减少细胞粘附分子的表达[17]，抑制大鼠血小板聚集[18]发挥抗炎和抗癌作用[2],[7],[19].
我们之前已经证明HTy（但不是Ty）能够保护培养细胞免受H2O（运行）2-诱导核DNA单链断裂的形成[20]研究还表明，包括酚酸和黄酮类化合物在内的几种酚类化合物能够保护细胞免受H2O（运行）2-诱导的DNA损伤与它们螯合细胞内不稳定铁的能力密切相关[21]特定化合物有效作用的先决条件是其穿透质膜的能力，以便在细胞内部发挥作用。因此，酚酸，如咖啡酸，在中性pH值下带负电，即使在相对较高的浓度下，也基本无效，尽管能够螯合铁[22]另一方面，当带负电荷的羧基被酯化时，它们的保护能力增加，从而促进它们穿透质膜。
在最近的一篇文章中，我们还描述了细胞内活性铁在氧化还原信号过程中的关键作用[23]因此，可以合理地想象，能够调节细胞内不稳定铁稳态的饮食成分也应该影响氧化还原诱导的信号转导途径。
在本研究中，我们选择了两种酚醇，原因有两个：（a）它们不带电，（b）它们的区别仅在于一种酚醇含有铁结合的邻二羟基部分（HTy），而另一种酚醇类（Ty）不含该基团。我们检测了它们在氧化应激（暴露于H2O（运行）2). 观察到，用HTy（但不是Ty）预培养细胞可以明确地消除H2O（运行）2-诱导细胞内活性铁水平升高，抑制JNK和p38 MAP激酶的晚期和持续磷酸化阶段，但不影响ERK的磷酸化。这些结果强调了含有邻二羟基部分的饮食成分调节细胞内铁稳态并以此方式影响氧化还原介导的信号转导的潜在能力。
2.材料和方法
2.1. 材料
RPMI-1640生长培养基，葡萄糖氧化酶（G.O.）（来自黑曲霉18000单位/克）和酪醇（79058）从Sigma-Aldrich Corporation（美国密苏里州圣路易斯）获得。胎牛血清（FBS）、低熔点琼脂糖和青霉素/链霉素抗生素从Gibco GRL（美国纽约州大岛）获得。正常熔点琼脂糖来自Serva GmbH（德国海德堡）。鸡尾酒蛋白酶抑制剂来自罗氏公司（德国曼海姆）。羟基热溶胶购自Extra-Synthesis（法国Genay Cedex），而钙黄绿素AM和碘化丙啶（PI）购自Molecular Probes（美国俄勒冈州尤金）。本研究中使用的抗体包括：来自Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）的抗铁蛋白（ab75973）和抗细胞色素c（ab133504）、抗PARP-1（sc-8035）、抗a-Tubulin（TU-02）（sc-7150）和辣根过氧化物酶结合二级抗体，购自Santa Cruz Biotechnology（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）、抗裂解半胱天冬酶-3（#9664）、，抗磷酸JNK（#9251S）、抗磷酸p38（#9211）、抗磷酸ERK（#9101）和抗p38（#9213）来自细胞信号传导（Danvers，MA，USA），膜联蛋白V–异硫氰酸荧光素（FITC）购自BD Pharmigen（San Diego，CA，USA）。抗actin-β（A5441）从Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）获得。二级抗体抗兔（111-035-144）和抗鼠（115-035-062）购自Jackson Immunoresearch（Baltimore Pike，West Grove，USA）。特异性铁螯合剂水杨醛异烟酸酰腙（SIH）是Prem Ponka教授（加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学）的捐赠。使用的所有其他化学品均为分析级化学品。
2.2. 细胞培养
Jurkat细胞（ATCC，克隆E6-1）在含有10%热灭活FBS、100 U/ml青霉素和100 ng/ml链霉素的RPMI-1640中生长，37°C，95%空气，5%CO2对数期的Jurkat细胞通过离心（250克，10分钟），以1.5×10的密度重新悬浮6每毫升细胞数，并在治疗前在标准条件下停留1小时。
2.3. 单细胞凝胶电泳（彗星试验）
碱性彗星实验如前所述进行，只是做了一些小修改[24]简而言之，将细胞悬浮在PBS中1%（w/v）的低熔点琼脂糖中，pH值为7.4，并用移液管移到超霜玻璃显微镜载玻片上，预涂一层1%（w/v）的正常熔点琼脂（使用前加热至37°C）。允许琼脂糖在4℃下放置10 min，然后将载玻片在4℃的裂解溶液（2.5 M NaCl，100 mM EDTA，10 mM Tris，pH 10，1%Triton X-100）中浸泡1 h，以溶解细胞蛋白质和脂质。将载玻片单行放置在一个30 cm宽的水平电泳槽中，该电泳槽含有0.3 M NaOH和1 mM EDTA，pH:~13（解旋溶液），并在4°C下保持40 min，以允许DNA链分离（碱性解旋）。在30 V（1 V/cm）和300 mA的解卷溶液中进行30 min电泳。最后，将载玻片在0.4 M Tris（pH 7.5，4°C）中洗涤3×5分钟，并用Hoechst 33342（10 mg/ml）染色。
Hoechst染色的核仁在带有490nm激发滤光片的紫外显微镜下以400倍放大率进行检查。DNA损伤不均匀，视觉评分基于100个随机选择的核仁的特征。彗星状DNA的形成被分为五类（0、1、2、3和4），代表着DNA损伤程度的增加，被视为“尾巴”。每个彗星都根据其类别分配了一个值。因此，100颗彗星的总分从0（0类100颗彗）到400（4类100颗慧星）不等。这样，细胞群的整体DNA损伤可以用任意单位表示[25]。以这种方式表示的评分与其他参数线性相关，例如使用特定软件包（彗星成像仪；MetaSystems）进行计算机图像分析后估计的尾部DNA百分比（结果未显示）。
2.4. 细胞内活性铁的估算
如Tenopoulou等人所述，对细胞内活性铁水平进行了估算，并进行了微小修改[26]简单地说，在指定的处理后，将细胞洗涤并与0.15µm钙黄绿素AM在含有1 mg/ml BSA和20 mM Hepes（pH 7.3）的PBS中在37°C下孵育15分钟。加载钙黄绿素后，清洗细胞，将其重新悬浮在不含钙黄绿素AM的2.2 ml相同缓冲液中，置于荧光分光光度计（F-2500；日立）试管中搅拌，并监测荧光（激发488 nm；发射517 nm）。钙调素负载细胞显示出一种荧光成分（ΔF），在与细胞内铁结合后被猝灭，并且可以通过添加90.9µm SIH（一种高度特异性和膜透性的铁螯合剂）来揭示。荧光的增加类似于钙黄绿素螯合铁。细胞存活率（通过台盼蓝排除法）>95%，在试验期间保持不变。
2.5. 流式细胞术
Jurkat细胞以3×10的密度接种到6孔板中6每个孔的电池数（1.5×106细胞/ml），并在培养箱中放置1小时。然后用指定浓度（0.05 mM和0.1 mM）的羟基酪醇或酪醇溶液处理细胞30分钟，并将其暴露于0.25 mμH的团注中2O（运行）27 h后，收集细胞，离心并将细胞颗粒悬浮在1×（10 mM Hepes，pH=7.4，140 mM NaCl，2.5 mM CaCl的钙缓冲液中2)以10的速度5细胞/100μl。用5μl Annexin V-荧光素异硫氰酸盐（FITC）和5μl PI（50μg/ml）对细胞进行染色，每个样品在室温黑暗中培养30分钟。在荧光激活的细胞分选流式细胞仪（Partec ML，Partec GmbH，德国）上测定DNA含量。
2.6. 总提取物和细胞溶质提取物的制备
总细胞蛋白提取物通过赖氨酸3×10制备6电池（1.5×106细胞/ml），1×蛋白酶和磷酸盐抑制剂的混合抑制剂（2mM原钒酸钠、20mMβ-甘油磷酸盐和10mM NaF）。将混合物在冰上培养30分钟，并以14.000×克在4°C下保持30分钟。将上清液作为总细胞分数保存以供分析。
为了制备细胞质提取物，Jurkat细胞（80×106细胞/样品）在冰镇PBS中洗涤，再悬浮在缓冲液中（20 mM Hepes，10 mM KCl，1 mM EDTA，1 mM-EGTA，250 mM蔗糖，1.5 mM MgCl2)并使用细胞破碎器设备进行裂解（HGM，德国海德堡）。裂解后，细胞碎片、细胞核和线粒体以14.000×克在4°C下保持10分钟。上清液以100.000×克在4°C下保存1 h，新上清液（S-100）在−80°C下储存，并作为细胞细胞质部分用于分析。
2.7. 蛋白质印迹
对于免疫印迹分析，将30–50μg的蛋白质用带有DTT的莱姆利缓冲液加载，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上。在用5%的非脂肪乳封闭后，用特异性抗体培养膜，然后用辣根过氧化物酶结合二级抗体培养膜。使用ECL试剂开发膜。光带强度定量由Quantity One（Bio-Read Laboratories）进行。
2.8. 过氧化氢生成的测量
在含有5.0 mM葡萄糖的PBS中，葡萄糖氧化酶作用产生的过氧化氢量可以通过240 nm处吸光度的增加来估算（摩尔消光系数=43.6 M−1厘米−1)或使用氧电极极谱法（英国诺福克汉斯泰克仪器公司）检测O的释放2添加过量过氧化氢酶后。
2.9. 蛋白质测定
使用牛血清白蛋白作为标准，通过Bradford法测定样品中的蛋白质浓度。
2.10. 统计分析
结果表示为平均值±SEM。通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验确定各组之间的显著差异（P≤0.05）。用Spearman秩相关系数评估两个变量之间的关系。
3.结果
3.1. 羟基酪醇降低细胞内活性铁的能力与其抑制H的能力相关2O（运行）2-诱发DNA损伤
我们之前已经证明HTy和Ty是橄榄油极性提取物的主要成分[20]然而，只有HTy能够预防H2O（运行）2-诱导DNA损伤，而Ty完全无效[20],[27]由于这两种化合物化学结构的唯一差异是用HTy中的羟基取代Ty中位置3处的氢[]，我们假设HTy可以通过其邻二羟基部分螯合细胞内活性铁发挥其保护作用，其方式与咖啡酸及其类似物相同[22]的确，在本研究中观察到HTy对H的保护程度2O（运行）2-诱导的DNA损伤与其降低细胞内不稳定铁池水平的能力密切相关，这是通过钙黄绿素法进行荧光测量估计的（r=0.959，p<0.001）(A–C）。Ty和其他一些缺乏邻二羟基部分的酚类化合物一样，不能调节细胞内不稳定铁的水平，也不能对H提供任何明显的保护2O（运行）2-诱发DNA损伤。
羟基酪醇的保护作用与其铁结合能力的相关性。（A） Jurkat电池（1.5×106细胞/ml）与指示浓度的HTy孵育30分钟(
)或（Ty）（-■-），然后暴露10分钟至0.6μg/ml葡萄糖氧化酶，能够产生10μμm H2O（运行）2每分钟。如“材料和方法”所述，通过单细胞凝胶电泳（彗星试验）评估核DNA中单链断裂的形成。结果表示为接触H的对照细胞DNA损伤的%2O（运行）2在没有酚类化合物的情况下。（B） Jurkat细胞与HTy孵育()或Ty（-■-）持续30分钟，细胞内不稳定铁的水平通过钙黄绿素法进行荧光测定，如“材料和方法”中所述。在不进行任何处理的情况下，结果以对照细胞活性铁水平的%表示。（C） HTy提供的H防护之间的相关性2O（运行）2-诱导的DNA损伤及其降低细胞内活性铁的能力（r=0.959，p<0.001）。
3.2. 羟乙基溶胶减弱H2O（运行）2-诱导细胞内活性铁水平升高
此前有报道称，Jurkat细胞暴露于H2O（运行）2引起钙素螯合细胞内铁的快速增加，并持续升高数小时[26],[28]。如所示A、 用50µm HTy预处理细胞30 min，可降低细胞活性铁的基础水平，并降低其H2O（运行）2-诱导升高。另一方面，Ty完全无效(B） 。令人惊讶的是，H的快速增长2O（运行）2-诱导不稳定铁的升高伴随着快速而有力地诱导储存铁蛋白的重链铁蛋白(C和D）。在这种情况下，HTy预处理减弱了铁蛋白表达的诱导，而Ty未能做到这一点(C和D）。目前尚不清楚检测到的细胞内活性铁的来源。它可能是细胞外的或从细胞内来源动员而来的，而钙黄绿素法无法检测到[26],[29]然而，从细胞培养基中去除铁不会影响H诱导的细胞内铁变化2O（运行）2（结果未显示），表明潜在的细胞内来源，如溶酶体、铁硫蛋白或铁蛋白。
羟基甲酚抑制细胞暴露于H后细胞内活性铁的升高2O（运行）2Jurkat电池（1.5×106细胞/ml）与50µm HTy或Ty预孵育30分钟，然后加入250µm H2O（运行）2（A，B）在指定的时间点，按照“材料和方法”中的描述，使用钙黄绿素-AM方法通过荧光分析监测细胞内的活性铁水平。使用识别蛋白质重链的抗体，通过western blot分析（C，D）铁蛋白的表达。波段强度的量化如下图所示（下面板：黑线=H2O（运行）2，蓝线=仅HTy或Ty，红线=H2O（运行）2加上HTy或Ty）作为三个独立实验的平均值±SEM，表示为相对于未处理对照细胞的折叠变化。
3.3. 羟乙基溶胶（但非酪醇）抑制H2O（运行）2-诱导和线粒体介导的细胞凋亡
接下来，我们测试了HTy和Ty保护细胞免受H2O（运行）2-诱导细胞凋亡。将Jurkat细胞暴露于250µm H的药丸中2O（运行）2Annexin-V结合显示，7 h后凋亡细胞的百分比从未经治疗的对照组的7.52±1.73%增加到38.06±1.33%(). PI染色阴性，大多数凋亡细胞处于早期凋亡期（32.54±0.96%）。用HTy（50和100µm）预处理细胞后，凋亡细胞的数量分别显著减少至19.30±0.96%和21.25±1.65%（*p<0.01 vs H2O（运行）2-处理过的细胞）(A） ●●●●。另一方面，Ty预处理无效(B） ，揭示了HTy邻二羟基部分的潜在作用。需要注意的是，细胞暴露于100µm HTy（但不是100µmTy）会增加在缺乏H的情况下凋亡细胞的数量2O（运行）2（7.52±1.73%对15.78±3.34%，#p<0.01）(A和B）。
羟乙基溶胶抑制H2O（运行）2-诱导细胞凋亡。Jurkat电池（1.5×106在添加H之前，用50或100μμm HTy（A）或Ty（B）培养30分钟2O（运行）2（最终浓度250μm）。7小时后，通过膜联蛋白-V结合细胞的流式细胞术分析（横轴）和PI染色（纵轴）评估凋亡细胞死亡。通过将Q4（早期凋亡细胞）和Q2（晚期凋亡细胞）中的Annexin V结合细胞计数相加，对凋亡细胞进行量化（右侧图）。条形代表三个独立实验中Annexin-V阳性细胞±SEM的平均百分比（*p<0.01 vs H2O（运行）2-处理过的细胞和#与对照组未经处理的细胞相比p<0.01）。
为了进一步阐明HTy作用的潜在分子机制，我们检测了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的激活和酶聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP-1）的裂解，PARP-1是活性半胱氨酸蛋白酶-3的底物之一。用50µm HTy处理细胞，在细胞暴露于H之前30分钟2O（运行）2，减少caspase-3和PARP-1的裂解(A） 而Ty没有表现出任何明显的抑制作用(B） 。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3被H激活2O（运行）2通过测量总细胞提取物中特定荧光底物（肽Ac-DEVD-AMC）的水解速率，也证实了HTy（而非Ty）对其的预防作用（结果未显示）。
羟基酪醇和酪醇处理对H的影响2O（运行）2-caspase-3的诱导激活和聚ADP-核糖聚合酶（PARP-1）的裂解Jurkat细胞（1.5×106细胞/ml）与50µm HTy（A）或Ty（B）预培养30分钟，然后添加250µm H2O（运行）2在指定的时间点（1、3、4和7 h），制备细胞提取物，并通过western blot分析评估裂解caspase-3及其底物PARP-1的检测。右边的箭头表示PARP-1的未分离113 kDa和裂解81 kDa部分的分子量，以及裂解半胱天冬酶-3的17–19 kDa的分子量。图（下面板）中显示了（A）和（B）的带强度量化，作为三个独立实验的平均值±SEM，表示为相对于未处理对照细胞的折叠变化（线：黑色=H2O（运行）2; 红色=H2O（运行）2加上HTy或Ty；蓝色=仅HTy或Ty）。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的激活需要功能性“凋亡小体”的存在，其形成是由线粒体通透性转变后细胞色素C从线粒体释放到胞浆触发的。暴露于250µm H的Jurkat细胞胞液组分的Western blot分析2O（运行）27小时后，细胞色素C从线粒体大量释放到胞浆(A和B）。同样，当细胞在H前30分钟用HTy预处理时，细胞色素C的释放显著减少2O（运行）2添加(A） ，而Ty预处理未能阻止此释放(B） ●●●●。
羟基酪醇和酪醇对H的影响2O（运行）2-诱导细胞色素C从线粒体释放到胞浆。Jurkat电池（1.5×106细胞/ml）与50µm HTy（A）和Ty（B）预培养30分钟，然后添加250µm H2O（运行）2对于指示的时间点。然后，按照“材料和方法”中的描述制备细胞溶质部分，并通过免疫印迹法分析细胞色素C的存在。谱带强度的量化如右侧的图表所示。数值表示三个独立实验的平均值±SEM，表示为相对于未处理对照细胞的折叠变化（线：黑色=H2O（运行）2; 红色=H2O（运行）2加上HTy或Ty；蓝色＝单独的HTy或Ty）。
综上所述，上述结果表明HTy抑制H2O（运行）2-通过作用于线粒体的某一点或其上游诱导凋亡细胞死亡。此外，在同样的情况下，Ty未能阻止凋亡，这一事实强调了邻二羟基在这一过程中的强制性作用。
3.4。羟基热溶胶降低H2O（运行）2-诱导JNK和p38 MAPK的持续激活
以前有人提出JNK和p38 MAP激酶的持续磷酸化决定细胞在氧化应激条件下的最终命运[30]为了进一步研究HTy在H中的作用2O（运行）2-诱导凋亡信号，我们对主要MAP激酶，即JNK、p38和ERK的磷酸化进行了详细的动力学分析，细胞暴露于H2O（运行）2对MAP激酶的磷酸化具有特异性作用。它激发了JNK的强大且持续的磷酸化，在添加h后3-4小时达到峰值2O（运行）2而p38的磷酸化表现出两个特征性阶段，一个是早期的，大约5-10分钟是短暂的，另一个是延长的，这显然与JNK磷酸化相一致。另一方面，ERK的磷酸化速度很快，在30分钟达到最高水平，之后逐渐降低(A和B）。用HTy预培养细胞30分钟可抑制JNK磷酸化，但对ERK磷酸化没有显著影响(A、 下部面板红线）。有趣的是，相同的处理只减少了p38的第二阶段，但没有影响最初的短磷酸化阶段(A、 下部面板红线）。当细胞与Ty预孵育时，三种MAP激酶中的任何一种都不影响磷酸化模式(B） 。综上所述，这些观察结果证实了JNK/p38轴在H途径中的参与2O（运行）2-诱导凋亡细胞死亡，并证明邻二羟基的存在对于HTy分子发挥其调节作用至关重要。
羟乙基溶胶（而非酪醇）抑制H2O（运行）2-诱导JNK和p38 MAPK的持续磷酸化和活化。Jurkat电池（1.5×106细胞/ml）暴露于250µm H2O（运行）2对于指示的时间点，在添加H之前30分钟，在没有或存在50µm HTy（A）或Ty（B）的情况下，添加到生长培养基中2O（运行）2在指定的时间点，使用特异性抗体通过western blot分析评估总细胞提取物中MAP激酶JNK、p38和ERK的磷酸化水平。每个MAPK的带强度量化以图表（下面板）表示，作为三个独立实验的平均值±SEM，表示为相对于未处理细胞的折叠变化（线：黑色=H2O（运行）2; 红色=H2O（运行）2加上HTy或Ty；蓝色=仅HTy或Ty）。。
4.讨论
本研究的主要目的是研究人类饮食中含有大量化合物的邻二羟基结构在保护细胞免受氧化应激条件下诱导的DNA损伤和凋亡方面的潜在作用。此外，我们测试了以下假设：提供的保护可能是由于邻二羟基螯合细胞内不稳定铁的能力。
为此，使用了橄榄油中大量存在的两种酚醇HTy和Ty，以及它们对接触H的细胞的保护作用2O（运行）2进行了调查。我们选择这些特殊的化合物有三个主要原因。首先，它们代表特级初榨橄榄油中的主要酚类化合物；其次，与酚酸相比，酚醇不带电，更容易通过细胞膜扩散；第三，它们具有相似的分子结构，只是在Ty中酚环的位置3不同，在那里氢被HTy中的羟基取代[]. 这两种醇之间的分子相似性使我们能够得出关于邻二羟基的作用的结论，邻二羟基在人类饮食的许多其他天然成分中也大量存在，尤其是在地中海式饮食中。此外，我们测试了邻二羟基结构的铁结合能力是否能够调节H2O（运行）2-诱导氧化还原信号通路，因为我们研究小组先前的工作表明，细胞内活性铁是H2O（运行）2-诱导凋亡信号[23],[31],[32].
事实上，在这项研究中观察到，HTy芳香环中邻位二羟基的存在为该分子提供了对H的特殊保护性能2O（运行）2-诱导DNA损伤和凋亡。保护作用与H的抑制作用密切相关2O（运行）2-诱导细胞内不稳定铁稳态的变化，表明铁明显参与促进JNK和p38 MAP激酶的持续磷酸化和活化。虽然，我们最近发现去铁胺，一种特殊的铁螯合药物，对H2O（运行）2-诱导MAP激酶磷酸化模式[23]据我们所知，MAPK磷酸化模式首次通过地中海饮食中大量存在的特定化合物的作用与细胞内不稳定铁的调节联系起来。
4.1. 羟基酪醇抑制H2O（运行）2-诱导细胞内铁稳态的变化
细胞内氧化还原活性铁催化产生剧毒的羟基自由基，这些羟基自由基能够以扩散控制的速率不加区别地氧化所有基本细胞成分[33],[34],[35]在正常条件下，这种铁的氧化还原活性部分仅包含细胞铁总量的一小部分，通常称为“活性铁”。然而，这种铁代表着一个动态的池，其浓度可以以这样一种方式波动，使细胞能够根据当前条件以最佳方式执行不同的细胞功能。因此，在正常条件下，活性铁的水平足以满足新合成蛋白质中结合的需要，而在氧化应激条件下，如创伤、感染或炎症，生物体已开发出复杂的机制来将其可用性降至最低，以防止细胞毒性。
本研究中观察到细胞暴露于H后，急性期蛋白铁蛋白迅速升高2O（运行）2(C和D），应被视为一种保护机制。它反映了细胞的快速反应，以抵消由于活性铁和氢浓度增加而产生的潜在毒性作用2O（运行）2.两个H2O（运行）2-HTy（而非Ty）预处理细胞中诱导的不稳定铁升高和铁蛋白表达减少(A和C），表明正二氢基团对有效作用的绝对要求。铁蛋白的显著快速表达可能表明该反应是在mRNA稳定或mRNA翻译水平上产生的。
上述结果引起的另一个问题是，在细胞暴露于H后，为观察到的活性铁升高提供铁的原始来源2O（运行）2潜在的细胞内来源是细胞器，如溶酶体和内质网，以及蛋白质，如铁蛋白和铁硫蛋白，其中含有钙黄绿素无法检测到的铁。从理论上讲，所有这些来源都可能代表H的目标2O（运行）2攻击和铁释放。显然，为了阐明这一点，还需要进一步调查。
4.2. 铁在H中的作用2O（运行）2-介导信号
除了有害影响，H2O（运行）2最近被确定为特定信号转导途径的不可或缺的组成部分，统称为“氧化还原信号”[36],[37]虽然我们的小组最近提出了有力的证据支持这一观点，但铁是否也参与了这些过程还没有得到很好的研究[23],[32].解释铁在H中作用的主要障碍2O（运行）2-介导信号传递是描述基础化学的难点。已经确定H2O（运行）2-信号传导是通过敏感半胱氨酸残基氧化为硫酸进行的，这是一个双电子氧化步骤[38]而H相互作用后产生的羟基自由基2O（运行）2亚铁是单电子氧化剂。为了调和这一矛盾，我们最近提出，Fenton反应中作为中间体形成的铁酰或全铁酰物种可能是H中的实际氧化剂2O（运行）2-诱导和铁介导的半胱氨酸氧化[23].
有趣的是，观察到的H的调制2O（运行）2-HTy诱导的MAPK磷酸化模式具有高度的特异性。它减少了JNK和p38磷酸化的晚期和持续阶段，但不影响快速诱导的ERK磷酸化和p38磷酸化的早期阶段(A） ●●●●。这些结果表明HTy具有明显的作用，这显然与防止细胞暴露于H后胞浆中活性铁升高相一致2O（运行）2由于MAPK磷酸化的实际水平是由上游MAP2K和MAP3K的协同作用和各自的MAPK磷酸酶的协同作用决定的，因此可以假设HTy从蛋白质的某些位置去除铁会使这些位置对氧化不敏感，导致上游激酶活性降低或在氧化应激条件下保持各自MAPK磷酸酶的活性。在没有HTy（或存在无效Ty）的情况下，升高的铁水平允许铁离子附着在这些特定位置，导致相反的效果。铁介导的上游MAPK活化或MAP磷酸酶失活是否是JNK和p38 MAPK持续磷酸化的真正罪魁祸首，目前尚不清楚，需要进一步研究来阐明这一机制。
4.3. 细胞暴露于H后发生的事件总结2O（运行）2
培养细胞暴露于H后，建议进行的连续步骤2O（运行）2和HTy的作用模式如图所示.（1）H的梯度2O（运行）2细胞外和细胞内空间之间形成浓度[39].（2）单元格内，H2O（运行）2减至H2O主要由过氧化物酶类（Prx）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）组成。作为添加H的量2O（运行）2增加后，细胞对其的清除持续更长时间，使其能够与细胞内不太敏感的目标相互作用。（3） H的存在2O（运行）2细胞内钙黄绿素螯合不稳定铁的大量增加(). （4） 细胞内活性铁的升高与细胞暴露于H2O（运行）2（5）ERK磷酸化的诱导和p38磷酸化的第一阶段是铁依赖的过程。（6） 在HTy存在的情况下，细胞内不稳定铁的性质受到调节，因为它通过该化合物的邻位二羟基的螯合作用从不同的位置去除，抑制JNK和p38 MAPKs的不稳定铁依赖性激活。（7） JNK和p38 MAPK的强烈和长时间激活导致线粒体通透性改变，最终导致细胞凋亡。
细胞暴露于H后发生事件的示意图2O（运行）2.在HTy在场的情况下。外源H2O（运行）2能轻易穿透质膜到达细胞溶质室（点1）。在胞浆中，H2O（运行）2减至H2酶GPx和Prx产生O（第2点）。然而，当细胞内H浓度2O（运行）2升高，它引起胞质不稳定铁水平的增加（第3点），这一事实促进了MAP激酶JNK和p38的持续磷酸化（第4点）。H（H）2O（运行）2还诱导ERK的磷酸化，但此事件与铁无关（第5点）。在存在铁相关化合物（如HTy）的情况下，活性铁水平降低（第6点），从而降低H2O（运行）2-诱导和不稳定的铁介导JNK和p38的长时间磷酸化。JNK和p38的持续磷酸化最终导致线粒体不稳定（第7点），随后是细胞色素C释放、caspase 3激活和细胞凋亡。。
根据这项研究的结果，提出人类饮食中含有的任何能够穿透生物膜并且能够螯合细胞内不稳定铁的化合物都可能会消除H2O（运行）2-诱导DNA损伤和凋亡氧化还原信号。尽管，在体内由于生物分布过程和外源性代谢，不太可能达到本研究中使用的HTy细胞内水平，可以假设，富含酚类的饮食中存在的过多的铁结合化合物的联合作用可以在调节细胞内不稳定铁稳态方面起到额外作用，从而在氧化应激条件下保护细胞。
由于氧化还原信号涉及多种病理条件，因此，铁在这些机制中的作用的阐明是氧化还原生物学领域的主要挑战。更好地理解潜在的分子机制应该为制定新的策略以预防或治疗与氧化应激相关的严重疾病提供基础[40].
致谢
这项研究没有从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何具体资助。
工具书类
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