氧化还原生物。2016年12月；10: 221–232.
表没食子儿茶素-3-没食子酸酯增强硒优化小鼠肝脏硫氧还蛋白和谷胱甘肽系统的关键酶活性，但激活硒缺乏小鼠的肝脏Nrf2反应
，a、，c（c） ，a、，d日 ，一 ，一 ，一 ，b中，d日和a、，日期：，⁎
董瑞霞
一安徽农业大学茶叶与食品科学学院茶树生物学与利用国家重点实验室，安徽合肥
c（c）中国浙江省丽水市丽水职业技术学院林业与技术系
王东旭
一安徽农业大学茶叶与食品科学学院茶树生物学与利用国家重点实验室，安徽合肥
d日安徽农业大学茶叶化学与健康效应国际联合研究实验室，安徽合肥
王晓晓
一安徽农业大学茶叶与食品科学学院茶树生物学与利用国家重点实验室，安徽合肥
张科
一安徽农业大学茶叶与食品科学学院茶树生物学与利用国家重点实验室，安徽合肥
陈萍萍
一安徽农业大学茶叶与食品科学学院茶树生物学与利用国家重点实验室，安徽合肥
钟S.杨
b美国新泽西州皮斯卡塔韦新泽西州立大学罗格斯欧内斯特·马里奥药学学院化学生物学系
d日安徽农业大学茶叶化学与健康效应国际联合研究实验室，安徽合肥
张劲松
一安徽农业大学茶叶与食品科学学院茶树生物学与利用国家重点实验室，安徽合肥
d日安徽农业大学茶叶化学与健康效应国际联合研究实验室，安徽合肥
一安徽农业大学茶叶与食品科学学院茶树生物学与利用国家重点实验室，安徽合肥
b美国新泽西州皮斯卡塔韦新泽西州立大学罗格斯欧内斯特·马里奥药学学院化学生物学系
c（c）中国浙江省丽水市丽水职业技术学院林业与技术系
d日安徽农业大学茶叶化学与健康效应国际联合研究实验室，安徽合肥
⁎通讯作者：中国安徽省合肥市长江西路130号安徽农业大学茶叶与食品学院茶树生物学与利用国家重点实验室，邮编：230036。nc.ude.uaha@sjz 2016年9月25日收到；2016年10月16日修订；2016年10月21日接受。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
- 补充资料
补充材料
GUID:AA28F893-4248-4A96-9311-B2FD20F4A4C4
摘要
硒主要通过一类硒蛋白（包括硫氧还蛋白还原酶）参与抗氧化防御。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）是绿茶中含量最丰富、生物活性最强的儿茶素。根据剂量和生物系统，EGCG可能通过其促氧化作用或其他未知机制发挥抗氧化剂或抗氧化防御诱导剂的作用。通过调控硒的状态，本研究研究了EGCG与抗氧化防御系统的相互作用，包括由硫氧还蛋白和硫氧还苷还原酶组成的硫氧还原型系统、由谷胱甘肽和谷胱甘蛋白还原酶与谷胱甘素酶偶联的谷胱甘苷系统以及Nrf2系统。在硒优化小鼠中，EGCG增加了硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘苷还原酶的肝脏活性。EGCG的这些作用似乎不是由于明显的促氧化作用，因为褪黑激素是一种强大的抗氧化剂，不影响这种增加。然而，在硫氧还蛋白还原酶1基础水平较低的缺硒小鼠中，相同剂量的EGCG并没有升高上述酶；有趣的是，EGCG反过来激活了肝脏Nrf2反应，导致血红素氧化酶1和NAD（P）H：醌氧化还原酶1蛋白水平和硫氧还蛋白活性增加。总的来说，本研究揭示了EGCG仅在缺硒条件下是Nrf2系统的强效诱导剂。在正常生理条件下，在硒优化小鼠中，硫氧还蛋白和谷胱甘肽系统是对抗高剂量EGCG诱导的应激的一线防御系统，不激活Nrf2系统。
缩写：ALT、丙氨酸氨基转移酶；天冬氨酸转氨酶；BSO，丁硫氨酸亚砜胺；CDNB，1-氯-2，4-二硝基苯；ECL，增强化学发光；乙二胺四乙酸；表没食子儿茶素-3-没食子酸酯；FoxO，O级叉头箱；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；谷胱甘肽过氧化物酶；GR，谷胱甘肽还原酶；Grx，谷胱甘肽；谷胱甘肽；GSSG，氧化谷胱甘肽；谷胱甘肽S-转移酶；γ-H2AX，磷酸化组蛋白2AX；4-氢萘，4-羟基壬醛；血红素加氧酶1；H（H）2哦2，过氧化氢；IL-2、IL-2；IL-6、IL-6；IL-10、IL-10；Keap1，kelch-like ECH-associated protein 1；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NQO1，NAD（P）H：醌氧化还原酶1；核因子红细胞2相关因子2；PBS，磷酸盐缓冲液；Prx，过氧化物酶原；聚偏氟乙烯；定量聚合酶链反应；QQQ-MS/MS，三重四极质谱仪；RIPA，快速热解组织液；RNS，活性氮物种；活性氧；核糖体蛋白S6；RT，室温；逆转录聚合酶链反应；十二烷基硫酸钠；硒，硒；Sec，硒代半胱氨酸；硒蛋白P；SOD、超氧化物歧化酶；Sp1/Sp3，特异性蛋白1/3；TBS-T，含0.05%吐温20的三缓冲盐水；Trx，硫氧还蛋白；TrxR，硫氧还蛋白还原酶；超高效液相色谱法
关键词：表没食子儿茶素-3-没食子酸盐、硒、硫氧还蛋白系统、谷胱甘肽系统、Nrf2反应
1.简介
绿茶是由中华山茶是一种全球消费的饮料。其特点是含有大量儿茶素。在这些儿茶素中，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）约占重量的50-75%，被认为是最具生物活性的儿茶素[1]据报道，EGCG对心脏病、糖尿病和癌症具有预防作用[1]EGCG根据剂量和细胞氧化还原状态发挥抗氧化剂或前氧化剂的作用[2]EGCG的抗氧化功能与其对活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的猝灭作用有关[3]或者，由于高活性羟基的自氧化以及伴随的超氧阴离子和过氧化氢的形成[4]，EGCG可能通过激活核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）进一步调节抗氧化防御，该因子启动一系列细胞保护基因的转录[5]，[6].
必需的微量元素硒（Se）主要通过一类硒蛋白参与抗氧化防御，硒蛋白中含有硒代半胱氨酸（Sec），该半胱氨酸与Sec-tRNA生成的多肽共翻译[Ser]秒前提是终止密码子UGA后面跟着Sec插入序列（SECIS）元素[7]在人类中，已发现25种硒蛋白，其中谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和硫氧还蛋白还原酶（TrxR）已得到很好的研究。GPx通过使用谷胱甘肽（GSH）作为还原剂还原过氧化氢和过氧化氢而起到抗氧化酶的作用[8]TrxR催化硫氧还蛋白（Trx）活性部位二硫的还原，以维持细胞氧化还原平衡。Trx具有多种功能，包括ROS中和和激活某些氧化还原敏感转录因子[9]世界许多地区硒摄入量不足会降低硒蛋白的生物合成并扰乱氧化还原平衡[10]，[11]值得注意的是，在喂食无硒饮食16或22周的小鼠中，硒蛋白生物合成明显受损。在这种条件下，Nrf2防御途径被激活，导致血红素氧化酶1（HO1）和NAD（P）H:醌氧化还原酶1（NQO1）的表达增加[12]不同的硒蛋白对缺硒的反应遵循严格的层次结构，一些硒蛋白的合成是以牺牲其他硒蛋白为代价的。例如，低级GPx1和硒蛋白P（SelP）对缺硒敏感，而高级TrxR1对缺硒更难反应[13]有趣的是，敲除GPx1或SelP并没有诱导小鼠肝脏HO1活性，而金葡糖或1-氯-2，4-二硝基苯对TrxR的抑制则上调了小鼠的肝HO1活性[14]，[15]，[16]这些结果表明TrxR1在调节Nrf2系统中的重要性。TrxR1减少Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）中游离半胱氨酸残基的二硫键，并使其保持还原状态，从而阻止Nrf2进入细胞质[17]TrxR1失活导致Keap1中形成二硫键，因此Nrf2被释放并进入细胞核以驱动许多细胞保护基因的转录[17]另一方面，TrxR1也是一个Nrf2靶基因。TrxR1和Nrf2之间如此复杂的相互作用表明TrxR1s是Nrf2活化的重要调节器[17]此外，作为一种高度保守的持家基因，TrxR1的核心启动子也可以被其他与Nrf2无关的转录因子调节，如八聚体结合蛋白或特异性蛋白1和3（Sp1/Sp3）[18].
我们和其他人先前表明，硒和膳食植物化学物质萝卜硫烷可以通过Nrf2途径在体外协同诱导TrxR1[19]，[20]，[21]这表明膳食成分的相互作用可以显著改变细胞氧化还原特性。目前，三种主要的抗氧化防御系统已经得到了很好的表征：Trx系统由NADPH、Trx和TrxR与过氧氧化还原素（Prx）偶联组成；GSH系统，包括NADPH、GSH和谷胱甘肽还原酶（GR）与谷胱甘苷氧还蛋白（Grx）偶联；以及Nrf2系统。在本研究中，我们利用硒营养状况作为干扰因素，研究了小鼠服用无毒、高剂量EGCG后，这些抗氧化防御系统之间的相互作用。我们证明，在生理条件下，在Nrf2系统激活之前，色氨酸和谷胱甘肽系统在Se-optimal小鼠中充当对抗EGCG诱导的应激的第一道防线，而EGCG是Se-deficient小鼠中Nrf2系统的有效诱导剂。
2.材料和方法
2.1、。化学品和药物
从绿茶中提纯的EGCG（>99%）来自Ebeikar tea&Extracts Co.，Ltd.（中国杭州）。褪黑素（>98%），GR（来自大肠杆菌)，大鼠TrxR1，β-天-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶均来自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。白细胞介素-2、6和10（IL-2、IL-6和IL-10）和4-羟基壬醛（4-HNE）的ELISA试剂盒分别购自BD Biosciences（美国加利福尼亚州圣何塞）和CUSABIO（中国武汉）。ECL Plus试剂和PVDF膜购自Bio-Read Laboratories，Inc.（美国）。抗GPx1/2、Nrf2、HO1、NQO1、磷酸化组蛋白2AX（γ-H2AX）的一级抗体和抗小鼠二级抗体以及抗兔二级抗体均来自圣克鲁斯（美国德克萨斯州达拉斯）。抗组蛋白H3和β-肌动蛋白的主要抗体购自Sigma。抗p38和P-p38的主要抗体购自Cell Signal Technology，Inc.（美国）。TrxR1一级抗体由Gary F.Merrill博士（俄勒冈州立大学生物化学和生物物理系）善意提供。其他化学品是可用的最高等级化学品。
2.2. 动物和治疗
所有涉及动物实验的方案均符合安徽农业大学实验动物护理和使用委员会的指南。雄性昆明小鼠（17–19 g）购自上海SLAC实验动物有限公司（中国）。小鼠被关在温度（25±1ºC）、湿度（50±10%）可控、光/暗循环12h的塑料笼中。老鼠可以随意获得食物和水。营养动物饲料高科技有限公司（中国南通）提供了配对的硒优化饮食（0.18 mg Se/kg）和硒缺乏饮食（<0.01 mg Se/kg.）。在给小鼠喂食5周后，从Se-optimal或Se-deficiency组中随机选择6只小鼠，腹腔注射70 mg/kg EGCG，每日一次，连续3天，然后再观察12天。6周后剩下的喂食小鼠腹腔注射生理盐水或45 mg/kg EGCG，每天一次，连续7天，然后在最后一次治疗后24小时处死所有小鼠。
设计了额外的动物实验来研究褪黑素对Se-optimal小鼠EGCG介导的抗氧化反应的影响。雄性昆明种小鼠（20–22 g）喂以Se-optimal饮食，并以生理盐水为对照，腹腔注射45 mg/kg EGCG、50 mg/kg褪黑素或EGCG与褪黑素的组合，每日一次，连续5天，最后一次治疗后24 h处死所有小鼠。
为了测定单剂量服用EGCG后的EGCG浓度，将喂食Se-optimal饮食的雄性昆明小鼠（20–22 g）腹腔注射45 mg/kg剂量的EGCG1次，分别于0.5、1、3和24 h处死。对照组小鼠于3小时后处死。
2.3. 生物标记物评估
血清在9000℃下离心克在4°C下保持10分钟。使用商用试剂盒（中国南京建成生物工程研究所）测量血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶的水平。使用上述ELISA试剂盒测定血清IL-2、IL-6、IL-10和4-HNE水平。
肝组织被切除，并在含有1 mM EDTA的0.15 mM冰镇pH 7.2磷酸盐缓冲液（PBS）中均质。通过离心（15000）获得匀浆克在4°C下保持15分钟）。以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford染色法测定蛋白质水平。
GPx和TrxR活性均使用Smith和Levander方法测定，但有一些修改[22]，[23]为了测量GPx活性，由6.5mM EDTA Na组成的储备混合物2，1.3 mM NaN三，新鲜制备在65 mM PBS（pH 7.4）中的2.5 mM GSH、0.5 mM NADPH和1.7 U/mL GR，并保持在37°C。将样品（47μL）与储备混合物（250μL）和3μL过氧化氢（H2哦2)作为GPx基质，最终浓度为250μM。在37°C下，用微孔板阅读器监测340 nm处吸光度随时间的变化。GPx活性以NADPH氧化的μmols/min/mL血清或mg蛋白计算。为了测量TrxR活性，由10 mM EDTA-Na组成的储备混合物2在100 mM PBS（pH 7.0）中新鲜制备5 mM二硫代双硝基苯甲酸、240μM NADPH和0.2 mg/mL牛血清白蛋白，并保存在37℃。然后将TrxR活性被金诺芬激活或抑制的成对样品制备如下：54μL样品分别与6μL 5%乙醇或6μL含1.47 mM金诺芬的5%乙醇在37℃下混合10分钟。将250μL储备溶液与50μL样品混合，开始反应，并在37°C下用微孔板阅读器监测412 nm处吸光度随时间的变化。TrxR活性是通过从没有金诺芬的反应斜率中减去金诺芬存在时反应的斜率来计算的。消耗一分子NADPH可减少一分子二硫代双硝基苯甲酸，并生成两个硫代双硝基苯甲酸阴离子，其消光系数为13600 M−1厘米−1412 nm。因此，TrxR活性表示为NADPH氧化的微摩尔/分钟/毫克蛋白质。
使用基于2,3-二氨基萘的荧光法评估硒含量[24]，[25]使用1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）评估谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性，并将GST活性计算为nmol CDNB结合物形成/min/mg蛋白质[26]用Holmgren和Björnstedt方法测定Trx活性，以大鼠TrxR1作为Trx还原酶，以NADPH氧化的μmol/min/mg蛋白表示[27]用Carlberg和Mannervik方法以氧化谷胱甘肽为底物测定GR活性[28]以2-羟乙基二硫为模型底物，根据Scian和Atkins的方法测定Grx活性[29]GR和Grx活性均以NADPH氧化/分钟/毫克蛋白质的nmol表示。
为了测量血浆EGCG，将100μL血浆转移到含有20μL抗坏血酸-EDTA溶液（0.4 M NaH）的Eppendorf管中2人事军官4含有20%抗坏血酸-0.1%EDTA，pH 3.6）和10μLβ混合物的缓冲液-天-添加葡萄糖醛酸酶（250 U）和硫酸酯酶（1 U）。将混合物在37°C下培养45分钟。在添加1 mL乙酸乙酯后，将混合物旋涡3 min并在13000离心克在4°C下保持10分钟。将上层有机相与10μL 0.2%抗坏血酸混合，然后通过真空离心干燥。将干燥的固体溶解在100μL 10%甲醇水溶液中，并在17000下离心克在4°C下保持15分钟。使用超高效液相色谱（UPLC）-三重四极杆质谱仪（QQQ-MS/MS）分析所得上清液（5μL）。通过Hypersil GOLD柱（粒径1.9 mm；柱径50×2.1 mm）和保护柱（粒度3 mm；柱尺寸10×2.1 mm，35°C）实现分离。流动相由（A）0.05%甲酸水溶液和（B）甲醇组成。溶剂B的梯度为：0-1min，10%；1-7分钟，从10%到30%；7–7.5分钟，从30%到70%；然后保持在70%至8分钟；8-8.5分钟，从70%到10%；然后保持在10%到10.5分钟。洗脱速率为0.3mL/min。在负电离模式下使用电喷雾电离在米/z100–1000. 在325°C、喷雾器压力为45 psi的条件下，将干气设定为6 L/min。采用QQQ-MS/MS的MRM模式，通过从母体离子（EGCG/GCG，457→169）中选择的产物离子检测目标化合物。UPLC-QQQ-MS/MS数据通过安捷伦MassHunter定性分析软件进行分析。测量肝脏EGCG水平，0.2克用1mL抗坏血酸-EDTA溶液均质肝脏，用20μLβ--天-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶在37°C下保持45分钟。然后添加200μL乙醇以沉淀组织。在添加500μL二氯甲烷和足够的涡流后，在16000℃下对混合物进行离心克在4°C下保持5分钟。用乙酸乙酯萃取上层水相，然后以与血浆样品相同的方式进行后续程序。
2.4. RNA分离、cDNA合成和实时PCR
根据制造商的协议（中国大连塔卡拉生物技术公司），使用Trizol试剂分离肝脏总RNA，并使用含有100 ng总RNA、寡核苷酸dT引物、，和PrimeScript RT酶混合物（RT-for-PCR试剂盒，Takara Biotechnology）。根据制造商的说明（Takara Biotechnology），使用CFX系统（Bio-Rad）进行实时PCR。选择GAPDH或核糖体蛋白S6（Rps6）作为看家基因，以使所有基因表达正常化。PCR反应所用的引物是使用可用的基因序列设计的，如.
2.5. 核馏分的制备
根据Carmona-Ramíreza方法制备核馏分等。
[30]简而言之，用冷PBS清洗肝组织一次，然后用10倍体积的冷等渗缓冲液A加蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）在冰上溶解10分钟，浓度为1μg/mL。500℃离心后克用冷缓冲液B清洗核微丸5分钟，然后在高渗冷缓冲液C和蛋白酶抑制剂混合物中重新悬浮。使用台盼蓝染料排除试验验证不含胞浆污染物的核组分。
2.6. 蛋白质印迹分析
用RIPA试剂提取的总蛋白浓度由BCA蛋白检测试剂盒（Beyotime Biotechnology，中国上海）测定。蛋白质提取物在95°C下在加载缓冲液中煮沸10 min，然后加载到10%SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）上进行蛋白质分离。凝胶中的蛋白质被转移到PVDF膜上。在室温（RT）下，用5%的无脂奶粉在含有0.05%吐温20（TBS-T）的三缓冲盐水中封闭膜2小时，然后在4℃下与TBS-T中稀释200至5000倍的特异性一级抗体孵育过夜。用TBS-T清洗膜四次，每次10分钟，然后在室温下与TBS-T中稀释2500倍或5000倍的二级抗体孵育1小时。用TBS-T清洗四次后，使用ChemiDoc XRS+检测系统（ECL，Bio-Rad）检测抗体结合，使用Quantity One®图像分析仪软件程序（Bio-Read）通过密度测定法对相应的谱带进行量化。
2.7. 统计分析
数据以平均值±SEM表示。所有统计分析均使用GraphPad软件（Prism版本5，加利福尼亚州圣地亚哥）进行。通过单因素方差分析（ANOVA）检验其显著性事后（post-hoc）Tukey或Dunnett测试，或双向方差分析事后（post-hoc）Bonferroni试验，视情况而定。生存率比较采用对数秩和检验。A类对-值小于0.05被认为具有统计学意义。
3.结果
3.1. 硒状态
膳食缺硒可导致硒含量和硒酶活性显著降低，尤其是肝脏中的GPx1活性[31]，[32]在本研究中，血清和肝脏GPx活性水平(A、 C）、肝脏GPx1蛋白和mRNA(D、 D′，E）和肝脏硒(B） 喂食低硒饮食的小鼠体内硒含量显著降低，表明硒缺乏模型已成功建立。在硒最佳小鼠中，EGCG降低了肝脏GPx1蛋白的表达，但增加了肝脏GPx1 mRNA的表达(D、 D′，E）。然而，无论硒的状态如何，EGCG治疗都不会影响血清或肝脏GPx活性或肝脏硒水平().
硒状态的生物标志物。给小鼠喂食Se-optimal或Se-deficient饮食7周。在最后7天，每天给小鼠腹腔注射一次生理盐水或45mg/kg EGCG。（A） 血清GPx活性。（B） 肝硒水平。（C） 肝脏GPx活性。（D） 和（D′）肝GPx1蛋白。（E） 肝脏GPx1 mRNA。数据以平均值±SEM表示（n=6）**对<0.01和***对<0.001与对照组。
3.2. 血浆和肝脏EGCG水平的动态变化
单次腹腔注射EGCG（45 mg/kg）后，0.5小时时血浆和肝脏EGCG水平分别为5.7μM和3.6μg/g（8 nmol/g）。然后在24小时内水平随时间而降低().
小鼠EGCG的时间依赖性变化。将剂量为45 mg/kg的EGCG腹腔注射给适当的小鼠一次，并在指定时间处死。样品用β-天-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶释放结合的EGCG，然后使用UPLC-QQQ-MS/MS测定EGCG水平。（A）血浆EGCG浓度。（B） 肝脏EGCG水平。数据表示为平均值±SEM（n=3）。
3.3. EGCG仅增强硒优化小鼠的肝TrxR、GR和Grx活性
EGCG显著诱导Se-optimal小鼠肝脏TrxR1的mRNA和蛋白水平(A、 B和B′），导致TrxR活性增加(C） ●●●●。正如预期的那样，硒缺乏导致肝脏TrxR1 mRNA和蛋白质水平以及TrxR活性显著下降(A–C）。值得注意的是，EGCG通过诱导TrxR1 mRNA和蛋白显著增加肝脏TrxR活性(A–C）以及Se-optimal小鼠的肝脏GR和Grx活性(D和E）。然而，缺硒消除了EGCG对这些酶的诱导作用(A–E）。
EGCG对肝脏TrxR1、GR和Grx的影响。给小鼠喂食Se-optimal或Se-deficient饮食7周。在过去7天内，小鼠每天一次腹腔注射生理盐水或45 mg/kg EGCG。（A） 肝TrxR1 mRNA。（B）和（B′）肝TrxR2蛋白。（C） 肝TrxR活性。（D） 肝脏GR活性。（E） 肝Grx活性。数据表示为平均值±SEM（n=6）*对<0.05, **对<0.01和***对<0.001与对照组。
3.4. 褪黑素不影响EGCG对硒优化小鼠肝TrxR、GR和Grx活性的诱导
为了研究EGCG诱导的硒最佳小鼠肝脏TrxR、GR和Grx活性的增加是否与EGCG的明显促氧化作用有关，褪黑素可以减轻EGCG引起的肝毒性[33]被雇佣。本文概述了EGCG对上述Se-optimal小鼠肝脏TrxR1蛋白和TrxR、GR和Grx活性的影响(A-D）。褪黑素不影响EGCG对肝脏TrxR1蛋白的影响(A、 A′）或TrxR和Grx活性(B、 D）。褪黑素甚至适度地增强了EGCG对肝脏GR活性的诱导，很可能是由于加性效应，因为褪黑素本身显著提高了肝脏GR的活性(C） ●●●●。这些结果表明，EGCG对Trx和GSH系统中关键酶的诱导可能只涉及EGCG的轻度而非明显的促氧化作用。
褪黑素对EGCG介导的肝TrxR、GR和Grx活性增加的影响。将生理盐水、45 mg/kg EGCG、50 mg/kg褪黑素或EGCG与褪黑素的组合每天一次腹腔注射给Se-optimal小鼠，连续5天。（A） 和（A′）肝TrxR1蛋白。（B） 肝TrxR活性。（C） 肝脏GR活性。（D） 肝Grx活性。数据表示为平均值±SEM（n=6）*对<0.05, **对<0.01和***对<0.001与对照组。
3.5. 硒缺乏促进EGCG引起的Nrf2应答升高
EGCG略微增加但不显著增加肝脏核Nrf2蛋白水平(A） NQO1的肝脏mRNA水平显著增加(B） 。然而，EGCG并未显著激活肝脏Nrf2反应，因为HO1 mRNA水平、HO1和NQO1蛋白水平以及Trx和GST活性没有显著增加(C-F）。虽然硒缺乏有增加细胞核Nrf2蛋白水平的趋势(A） ，肝脏NQO1和HO1的mRNA水平和蛋白质水平均未因缺硒而显著增加(B-D）。然而，硒缺乏小鼠的肝脏GST活性显著增强(F） 推测与细胞核中Nrf2蛋白的非显著增加有关。在硒缺乏小鼠中，EGCG显著增加肝细胞核内的Nrf2蛋白水平，从而显著诱导HO1和NQO1的mRNA和蛋白水平，并显著增加Trx活性(). 总的来说，单是EGCG和硒缺乏似乎都会触发适度的Nrf2反应，NQO1 mRNA诱导和GST活性升高分别证明了这一点。只有在Se-deficient条件下，EGCG才会产生强大的Nrf2响应。这种独特的Nrf2反应似乎与p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化有关，p38的磷酸化增加了2.2倍(对<0.01）仅在硒缺乏小鼠中使用EGCG治疗(补充图1).
不同硒状态下Nrf2对EGCG的反应。给小鼠喂食Se-optimal或Se-deficient饮食7周。在过去7天内，小鼠每天一次腹腔注射生理盐水或45 mg/kg EGCG。（A） 肝细胞核Nrf2蛋白水平。（B） 肝脏NQO1 mRNA水平。（C） 肝脏HO1 mRNA水平。（D） HO1和NQO1的肝蛋白。（E） 肝脏Trx活性。（F） 肝脏GST活性。数据表示为平均值±SEM（n=6）*对<0.05, **对<0.01和***对与对照组相比，<0.001。
我们以前的研究表明，高剂量EGCG引起的肝毒性与肝脏Nrf2激活有关，而在昆明小鼠中，同样使用无毒高剂量（45 mg/kg，i.p.）5-7天的EGCG，并没有在硒缺乏小鼠的肝脏中产生全面的Nrf2反应[33]，[34]因此，我们接下来研究了在硒缺乏小鼠中看到的强大的Nrf2反应是否与EGCG触发的肝毒性有关。
3.6. 硒缺乏不会增强EGCG毒性
高剂量EGCG可产生过量的ROS，可能引发肝毒性甚至致命性[35]，[36]在本研究中，给Se-optimal小鼠每日一次、连续7天服用EGCG（45 mg/kg，i.p.）不会影响体重(A） 也没有引起血清ALT、AST和4-HNE正常水平所示的肝毒性()以及肝脏γ-H2AX蛋白(C） 其表达在EGCG诱发的肝损伤期间显著增加[33]，[34]，[35]，[36]EGCG治疗实际上减少了炎症，血清IL-2和IL-10水平较低就是证明(). 虽然没有观察到毒性作用，但使用的EGCG剂量可能是最大无毒剂量，因为肝脏p21 mRNA适度但显著增加(B） 。在这种情况下，值得注意的是，我们之前发现，在触发肝毒性的剂量下，EGCG使p21 mRNA水平增加了一个数量级以上（55 mg/kg，i.p.，昆明小鼠连续5天每天一次，与本文所用的小鼠菌株相同，我们的未公开数据）。如果硒缺乏增强EGCG毒性，那么在硒缺乏小鼠中EGCG的最大无毒剂量有望降低。然而，Se-deficient小鼠对EGCG的最大无毒剂量（45 mg/kg）具有良好的耐受性，这在Se-optimal小鼠中得到了证实，反映在体重上(A） 和肝脏γ-H2AX蛋白(C） 血清ALT和AST活性以及4-HNE水平(). 此外，硒缺乏不会干扰EGCG对炎症标记物的有益作用()甚至消除了p21 mRNA水平的升高(B） 。这些结果表明，在所用的实验条件下，硒缺乏不会增强EGCG的毒性。我们目前的结果表明，硒缺乏小鼠中Nrf2对EGCG的强烈反应()与EGCG引起的肝毒性无关。Nrf2细胞保护酶的激活可能弥补了硒缺乏引起的抗氧化防御缺陷。另一项使用致死剂量EGCG的实验进一步支持了硒缺乏不会增强EGCG毒性的观点。给小鼠注射EGCG（70 mg/kg，i.p.），每天一次，持续3天，在Se-optimal和Se-deficient小鼠中导致相同（50%）的死亡率(D） ●●●●。此外，两组的生存情况没有显著差异。
不同硒状态下对EGCG的毒性反应。（一） 给小鼠喂食Se-optimal或Se-deficient饮食7周。在过去7天内，小鼠每天一次腹腔注射生理盐水或45 mg/kg EGCG。（A） 体重。（B） 肝p21 mRNA。（C）肝γ-H2AX蛋白。（二） 给小鼠喂食Se-optimal或Se-deficient饮食7周。第6周，向小鼠腹腔注射生理盐水或70 mg/kg EGCG，连续3天每天注射一次，设计为第0天、第1天和第2天，如展示其生存情况的面板（D）所示。数据表示为平均值±SEM（n=6）*对与对照组相比<0.05。
表2
| 血清参数 | 控制 | EGCG公司 | 硒缺乏 | 硒缺乏/EGCG |
|---|
| ALT（单位/毫升） | 31.3±7.6 | 50.9±11.7 | 28.5±2.4 | 30.6±4.2 |
| AST（U/mL） | 22.2±3.3 | 21.8±3.0 | 17.1±2.6 | 18.4±1.5 |
| IL-2（微微克/毫升） | 94.7±12.7 | 37.0±7.3** | 52.8±17.3* | 29.4±1.7** |
| IL-10（纳克/毫升） | 3.4±0.3 | 1.5±0.2** | 2.7±0.6 | 1.2±0.1*** |
| IL-6（纳克/毫升） | 0.6±0.1 | 0.9±0.1 | 0.7±0.1 | 0.9±0.1 |
| 4-HNE（纳克/毫升） | 4.6±0.3 | 4.5±0.4 | 4.4±0.8 | 4.4±0.2 |
4.讨论
色氨酸和谷胱甘肽系统是两种有充分文献记载的NADPH依赖的二硫键还原途径，对维持氧化还原稳态至关重要。作为对氧化应激的反应，Nrf2通路也被激活以参与氧化还原稳态的维持。本研究揭示了硒状态依赖性肝防御通路对EGCG的反应。在硒最佳小鼠中，EGCG同时增强了肝脏Trx和GSH系统，而在硒缺乏小鼠中，EGCG没有诱导这两个系统，而是成为肝脏中更有效的Nrf2激活剂。
在化学方面，EGCG具有强大的ROS和RNS清除能力[37]此外，EGCG已被证明能增加分离的人类中性粒细胞中Mn-SOD和总SOD、过氧化氢酶和GR的活性[38]上调小鼠和人颌下腺细胞中Prx6的表达[39]此外，绿茶可以显著提高小鼠肠道、肺和肝脏的GPx和过氧化氢酶活性[40]因此，直接清除ROS/RNS的能力和抗氧化酶的诱导都被视为绿茶多酚的抗氧化机制，尤其是研究充分的EGCG。我们的研究首次证明EGCG可以同时增加小鼠肝脏的TrxR、GR和Grx活性。Trx和GSH系统为核糖核苷酸还原酶提供电子以进行DNA复制，并共同支持广泛的还原途径，保护细胞免受氧化损伤。它们还互为备份系统[41]因此，只有当两个系统都受到抑制时，才会出现明显的组织损伤或细胞死亡。几行观察结果与这一概念一致：1）丁硫氨酸亚砜胺（BSO）（一种谷胱甘肽生物合成抑制剂）和金诺芬（一种有效的TrxR抑制剂）联合使用时，显著提高了癌细胞对细胞毒药物的反应[42]; 2） BSO与三氧化二砷（一种TrxR抑制剂）或BSO与奈达铂（一种TrxR抑制剂）的联合分别在体外或体内协同杀死癌细胞[43]，[44]; 3） 用异环磷酰胺或环磷酰胺（使TrxR失活）联合治疗牛血清白蛋白（BSO）对小鼠的急性肾功能衰竭或心脏损伤比单独用药严重得多[45]，[46]我们认为EGCG诱导的肝Trx和GSH系统增强及其协同作用是EGCG发挥抗氧化作用的重要机制。
在被研究的三种酶中，只有TrxR1基因是一个清晰的Nrf2靶基因，其活性被EGCG提高[47]褪黑素，是一种自由基清除剂和广谱抗氧化剂[48]，[49]，[50]，能有效缓解高剂量EGCG引发的氧化应激，抑制EGCG诱导的Nrf2活化[33]，[34]本研究结果表明，褪黑素不影响EGCG对TrxR1的诱导，表明EGCG的明显促氧化作用不参与EGCG诱导的TrxR1的增加。先前的研究表明，抑制TrxR1可引起Nrf2反应[14]，[15]，[16].TrxR1可以充当Nrf2的强大调节器和守门人[17]，[51]EGCG诱导TrxR1的机制尚不清楚。一种可能是EGCG对TrxR1的轻度抑制[52]，[53]可以通过Nrf2的温和和短暂激活触发TrxR1的合成，从而增加TrxR1的转录[17]在这个场景中，诱导的TrxR1反过来扮演了一个守门人的角色，关闭了公开Nrf2激活的门。另一种可能性是EGCG激活叉头盒O类（FoxO）转录因子[54]在转位到细胞核后，FoxO刺激编码无数抗氧化蛋白的基因转录，包括超氧化物歧化酶、Prx、Trx和TrxR家族成员[55]，[56]这种机制可以解释为什么EGCG可以增加许多抗氧化酶的活性。FoxO是否参与EGCG诱导的TrxR、GR或Grx活性增加需要进一步调查。新的证据表明Keap1的S-谷氨酰化导致Nrf2活化[57]，[58]这表明Grx和GSH系统可以参与抑制Nrf2活化。基于上述讨论，我们提出，在Se-optimal条件下，高基础TrxR1及其由EGCG诱导以及GR和Grx活性的相关增加限制了Nrf2的激活；而在硒缺乏的条件下，低基础TrxR1及其对EGCG的沉默反应以及GR和Grx诱导的相关缺乏促进了Nrf2的激活。这些酶系统之间的相互作用如.
硒状态依赖性细胞防御途径的分化调节对EGCG的反应。Keap1中二硫键和/或S-谷氨酰化的形成激活Nrf2。在Se-optimal条件下，高基础TrxR1及其由EGCG诱导，以及GR和Grx活性的相关增加限制了EGCG对Nrf2的诱导（左图）。在缺硒条件下，低基础TrxR1及其对EGCG的静音反应，以及GR和Grx对EGCG缺乏反应，都会促进Nrf2的激活（右图）。
体外实验表明，许多Nrf2诱导剂在缺硒或缺硒条件下上调TrxR1 mRNA[19]，[59]，[60]，[61]然而，Se状态如何影响Nrf2诱导物触发的TrxR1 mRNA的上调仍不清楚。一些研究发现，与缺硒条件相比，在缺硒条件下诱导TrxR1 mRNA的效率更高[19]，[60]，然而也报告了相反的结果[61]本研究表明，EGCG仅在硒缺乏小鼠中诱导肝TrxR1的基因表达，而在硒缺乏鼠中没有。体内外硒缺乏条件对Nrf2诱导剂调节的TrxR1 mRNA的差异可能与体内外硒水平对基础TrxR1mRNA的不同影响有关。硒状态不影响体外基础TrxR1 mRNA水平[19]，[60]，[61]然而，我们发现缺硒显著降低了体内基础TrxR1 mRNA水平(A） ，这与其他人报告的观察结果类似[62]在硒缺乏的条件下，即使EGCG诱导TrxR1 mRNA表达，TrxR1的生物合成也会受到损害。
我们在这项研究中表明，无论硒状态如何，EGCG都不会影响肝脏GPx活性(C） ●●●●。由于GPx1是谷胱甘肽系统的重要成员，是肝脏中最丰富的硒酶之一，我们还研究了EGCG对GPx1表达的影响。我们发现，在Se-optimal小鼠中，EGCG降低了肝脏GPx1蛋白的表达(D、 D′），但增加了肝脏GPx1 mRNA的表达(E） ●●●●。EGCG诱导的肝GPx1 mRNA升高可能与p53的激活有关[63]，[64]EGCG激活p53的作用是通过在Se-adequate小鼠中p21的增加来实现的(B） 。GPx1蛋白的低表达可能是由于高增加的TrxR1蛋白对硒的隔离[65]，[66]，[67]，[68]，[69]，因为TrxR1位于硒蛋白层次的顶部，而GPx1位于底部[13]GPx家族由8个成员组成，GPx1-4和6为硒蛋白，GPx5、7和8为非硒蛋白[70]EGCG可诱导肝脏GPx2、3、5和7 mRNA的表达[36]因此，EGCG引起的肝GPx1蛋白水平降低可能不会影响肝GPx的总活性。
在本研究中，我们使用缺硒饮食作为工具来研究抗氧化防御酶系统之间的相互作用。本研究中，硒剥夺后小鼠的血清GPx活性（硒状态的常用生物标记物）约为硒缺乏小鼠的14%。这与使用少量缺硒饮食（50%的硒水平）产生的情况类似[71]如前所述，明显的硒缺乏会显著诱导肝脏Nrf2反应[12]在本研究中，未观察到硒剥夺后小鼠肝脏中典型的Nrf2反应。因此，目前的结果可能是从处于亚最佳硒水平和显性硒缺乏之间的中间硒状态获得的。在硒水平低于最佳水平的人中，EGCG诱导的Nrf2反应可能与本研究中所见的强或弱。然而，目前观察到的EGCG对肝脏TrxR1、GR和Grx的诱导作用预计也会同样发生在适当的人身上。据报道，口服药理剂量后小鼠和人类的EGCG血浆峰值浓度分别为2-9μM和7.5μM[72]在本研究中，单次腹腔注射EGCG（45 mg/kg）的小鼠的血浆EGCG峰值浓度为5.7μM(A） 因此，本研究中使用的EGCG剂量虽然远高于茶饮料的消耗量，但与绿茶提取物膳食补充剂（用于减肥）的消耗量相似，其中EGCG是主要成分。由于一些人大量食用绿茶提取物，出现了不良反应，主要是肝毒性，但比例很低[73]，[74]目前观察到的抗氧化防御系统的反应可能是保护机制。
基于目前的结果，我们得出结论，在硒充足的情况下，较高的TrxR1基础水平以及EGCG对TrxR1、GR和Grx的诱导将使Nrf2免受EGCG的激活；而在硒缺乏症中，由于TrxR1的基础水平较低以及EGCG缺乏TrxR1、GR和Grx的诱导，Nrf2系统被强烈激活。我们的研究首次证明了这些抗氧化防御酶在动物体内对饮食化学物质EGCG的应激反应中的相互作用。
致谢
我们感谢Gary F.Merrill博士（俄勒冈州立大学生物化学和生物物理系）提供TrxR1一级抗体。这项工作得到了国家自然科学基金（31170648）和大别山地区农林产业协同创新中心的支持。
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