氧化还原生物。2016年12月；10:211–220。
草酸苹果酸降低视网膜色素上皮中血管内皮生长因子的表达和分泌并抑制血管生成：与年龄相关性黄斑变性的关系
，一 ，一 ，一 ，b条 ，一 ，一 ，b中，c、，⁎和a、，⁎⁎
宋焕金
一韩国大邱京畿国立大学自然科学学院BK21 Plus KNU创意生物研究小组生命科学与生物技术学院
Hyunjin Kim先生
一韩国大邱京畿国立大学自然科学学院BK21 Plus KNU创意生物研究小组生命科学与生物技术学院
Hyeong Jun Ku先生
一大韩民国大邱庆浦国立大学自然科学学院BK21 Plus KNU创意生物研究小组生命科学与生物技术学院
Hanvit Cha公司
一韩国大邱京畿国立大学自然科学学院BK21 Plus KNU创意生物研究小组生命科学与生物技术学院
Seoyoon Lee先生
一韩国大邱京畿国立大学自然科学学院BK21 Plus KNU创意生物研究小组生命科学与生物技术学院
Jin Hyup Lee公司
b条韩国世宗韩国大学食品与生物技术系
c（c）韩国世宗韩国大学自然科学研究院
Jeen-Woo公园
一大韩民国大邱庆浦国立大学自然科学学院BK21 Plus KNU创意生物研究小组生命科学与生物技术学院
一韩国大邱京畿国立大学自然科学学院BK21 Plus KNU创意生物研究小组生命科学与生物技术学院
b条韩国世宗韩国大学食品与生物技术系
c（c）韩国世宗韩国大学自然科学研究院
2016年8月12日收到；2016年10月20日修订；2016年10月21日接受。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
- 补充资料
补充材料
GUID:EDD10238-75B6-4377-AA9E-3F57C40D6FA9
摘要
临床和实验观察表明，视网膜色素上皮（RPE）分泌的血管内皮生长因子（VEGF）在年龄相关性黄斑变性（AMD）的病理性血管生成和脉络膜新生血管（CNV）的形成中起着关键作用。RPE介导的VEGF表达导致血管生成，是眼部新生血管疾病的主要信号机制。用治疗分子抑制这种信号通路是一种很有前途的抗血管生成策略，可以治疗这种副作用可能较少的疾病。草酸苹果酸（OMA）是NADP的竞争性抑制剂+-依赖性异柠檬酸脱氢酶（IDH）在活性氧（ROS）调节的细胞信号通路中起着重要作用。在此，我们研究了OMA对VEGF表达的抑制作用，以及相关的潜在作用机制，使用在体外和体内AMD的RPE细胞模型。我们发现OMA降低RPE细胞中VEGF的表达和分泌，从而抑制CNV的形成。OMA的这种功能与其激活pVHL介导的HIF-1α在这些细胞中降解的能力有关通过ROS依赖的ATM信号轴，通过抑制IDH酶。这些发现揭示了OMA在抑制RPE-衍生VEGF表达和血管生成方面的新作用，并提出了治疗病理性血管生成和AMD发展的独特治疗策略。
关键词：VEGF、视网膜色素上皮、草酸苹果酸、活性氧
集锦
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草酸苹果酸通过促进HIF-1α降解降低RPE细胞中VEGF的表达。
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草酸苹果酸通过调节ATM-Chk2-E2F1轴激活pVHL介导的HIF-1α降解。
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草酸腺苷对IDH酶的抑制激活ROS介导的ATM信号轴。
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草酸苹果酸抑制CNV相关血管生成体内AMD小鼠模型。
1.简介
血管内皮生长因子（VEGF）家族由许多密切相关的配体组成，包括VEGF-a、B、C、D、E和胎盘生长因子（PIGF）[1]VEGF-A（以下简称VEGF）是一种重要的血管生成因子，与多种眼部疾病相关，包括年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性糖尿病视网膜病变[2]，[3]在AMD的发病过程中，VEGF表达增加导致视网膜下间隙病理性和高渗透性血管增生，特别是脉络膜新生血管（CNV），导致严重视力丧失[4]，[5]，[6]在成年人中，视网膜色素上皮（RPE），一种位于脉络膜和光感受器之间的单层上皮，似乎是眼睛后部VEGF的唯一来源[7]，[8]各种研究表明，分化的RPE以极化的方式向基底外侧分泌VEGF[9]，[10]其主要信号受体VEGFR2优先由RPE对面的脉络膜毛细血管（CC）表达[8]，[9]VEGF-VEGFR2结合导致各种信号级联的诱导，包括MAPK、Akt和Src，这对脉络膜毛细血管内皮细胞的增殖和维持CC的窗化至关重要[11]，[12]然而，由于年龄依赖性或病理改变，RPE上调VEGF被认为是AMD中CNV发展的关键因素[13]，[14].
因此，VEGF在增殖性AMD中的明显参与导致了多种抗VEGF药物的开发，如聚乙二醇苯胺和雷尼单抗，这些药物已被食品和药物管理局批准用于治疗CNV[15]，[16]，[17]所有这些分子都与分泌的可溶性VEGF结合，并阻止其与CC上的VEGFR2相互作用[18]，[19]，[20]然而，目前可用于治疗眼部新生血管疾病的抗VEGF治疗药物并不会改变VEGF在视网膜的表达。因此，目前的治疗分子以非常高的剂量反复给药，系统性副作用影响了它们在眼部疾病治疗中的效用[21]，[22]因此，设计用于抑制视网膜VEGF表达的潜在信号机制的治疗性分子似乎具有良好的抗血管生成特性，且副作用较少。
草酸苹果酸（OMA，α-羟基-β-草糖琥珀酸）是一种三羧酸中间体，是两类NADP的一种众所周知的有效竞争抑制剂+-依赖性异柠檬酸脱氢酶同工酶，主要位于细胞质（IDH1）或线粒体（IDH2）[23]，[24].OMA可以形成在体外和体内草酰乙酸和乙醛酸的缩合。事实上，它是生产出来的在体外草酰乙酸和高活性乙醛酸之间的非酶醛缩合[25]，[26]。此反应也会发生体内在哺乳动物细胞中，当草酰乙酸和乙醛酸存在时，后者在脊椎动物细胞中合成和分解代谢[27]，[28]，[29].
NADPH是IDH酶的代谢产物，是谷胱甘肽再生所必需的还原当量，因此对谷胱甘苷还原酶和过氧化物酶系统清除细胞活性氧（ROS）至关重要[30]，[31]有大量研究表明氧化应激对信号通路的一般影响，称为“氧化界面”。在此过程中，活性氧直接与MAP激酶、PI3激酶、Nrf-2和ATM等关键信号分子相互作用，在多种细胞过程中启动信号传递，如增殖、代谢、分化和存活，表明活性氧是关键信号分子[32]，[33]，[34]，[35]，[36].
IDH酶亚型或NADPH生成酶是主要的抗氧化剂和氧化还原调节剂，通过催化不同亚细胞隔室中NADPH的生成来防止氧化应激[37]，[38]IDH酶是进化上保守的蛋白质，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸和NADP的还原+至NADPH[39]具体而言，IDH2充当NADP+-在正向克雷布斯循环中消耗酶，生成NADPH，用于维持还原型谷胱甘肽和过氧化物酶原系统，并用于自我维持通过谷胱甘肽2对半胱氨酸失活IDH2的再激活作用[39]，[40].
最近有报道称，OMA通过抑制脂质生物合成、连接细胞氧化还原状态和调节脂肪细胞功能，有助于调节脂质代谢。研究表明，OMA治疗后IDH活性降低，导致血浆甘油三酯和胆固醇水平降低，脂肪细胞脂蛋白脂肪酶活性降低，提示OMA可能在脂肪积累中起抑制作用[41]除了其降脂作用外，OMA还具有其他一些作用，例如增强癌细胞的凋亡细胞死亡，以及通过诱导细胞内ROS积累抑制LPS诱导的炎症反应[42]，[43]，[44]，[45]然而，据我们所知，没有关于OMA对AMD患者CNV影响的信息。研究人员关注可溶性VEGF与新生血管疾病之间的关系[18]，[19]，[20]但不影响VEGF的表达。因此，在本研究中，我们使用在体外和体内AMD的RPE细胞模型。目的是确定OMA是否作用于RPE细胞以调节VEGF的表达和分泌，从而改变视网膜上皮细胞的功能。这可能是治疗年龄相关性黄斑变性中病理性血管生成和CNV发展的潜在治疗方法。
2.材料和方法
2.1、。细胞培养
RPE细胞（CRL-4000）和人脐静脉内皮细胞（以下简称HUVEC；CRL-1730）购自ATCC。RPE细胞在37°C，5%CO中培养2用含有1%青霉素-链霉素和10%FBS的DMEM饱和湿度培养箱培养。对照组细胞按如下方法处理：细胞在培养基中培养24h，然后在含有5mM OMA（Cayman Chemical）的培养基中培育24h。细胞培养在37°C和5%CO中进行2饱和湿度培养箱。RPE细胞的条件培养基（CM）建立如下：细胞在无血清DMEM中生长至60-70%细胞密度24小时，然后将培养基更换为含有5 mM OMA的培养基。培养24小时后，用新的无血清DMEM替换培养基，并继续培养24小时。然后收集培养上清液并在4°C下300g离心5分钟，以清除完整细胞，然后在Amicon Ultra-15试管中浓缩并通过离心脱盐（5 kDa分子量截止值；Millipore）。HUVEC在37°C、5%CO中培养2饱和湿度培养箱，细胞外基质（ECM）培养基中添加1%青霉素-链霉素和10%FBS。HUVEC与RPE细胞暴露于OMA后收集的CM培养，对照细胞在无血清DMEM中培养。
2.2. 细胞增殖试验
根据制造商的建议（Roche），通过MTT分析评估细胞增殖。简单地说，RPE细胞接种在1×10的96周培养板中4第二天，按照上述方法处理细胞。培养24小时后，取出培养基并添加100μl MTT溶液，然后在37°C的培养箱中培养4小时；然后去除MTT溶液，向每个孔中添加100μl DMSO，然后混合10分钟，然后使用Ultrospec 2100-pro分光光度计（Amersham Biosciences）在540nm处测量OD值。HUVEC的增殖评估如下：细胞按上述方法处理。然后，用PBS洗涤细胞两次，在3:1甲醇：乙酸中固定20分钟，用水冲洗，用5%结晶紫或1μg/mL碘化丙啶染色，并计数。细胞增殖是根据处理过的样品中细胞数量与对照板中细胞数量的比率来计算的。
2.2.1. 体外细胞迁移测定
体外如前所述，划痕试验用于检测HUVEC的迁移[46]在无血清DMEM的12孔培养板中，HUVEC生长到80–90%的汇合处。用无菌10μl移液管尖端对平板进行机械刮伤，以产生两个垂直的线性刮伤。在无血清条件下使用CM治疗之前，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）广泛冲洗细胞，以清除细胞碎片，以确定细胞增殖对伤口愈合的贡献。使用连接至蔡司Axiovert 200倒置显微镜的数码相机（尼康），在同一区域内靠近交叉点的受伤后24小时，立即拍摄迁移过程。伤口愈合的程度取决于细胞迁移到裸露区域的距离。水平线表示缠绕边缘。通过倒置显微镜对24小时后HUVEC在伤口边缘的迁移进行评估和拍照。原始伤口面积宽度-受伤后24小时的伤口面积宽度=恢复面积宽度（恢复的对照组宽度的百分比）。恢复区宽度是指HUVEC细胞迁移距离或伤口闭合率为（伤口面积0小时−伤口区域24小时)×100/伤口面积0小时代表性数据是三个独立实验的累积数据。
2.2.2. 体外血管生成试验
细胞被涂上Matrigel（BD Biosciences），HUVEC被刺激形成毛细血管管状结构，如前所述[47]将Matrigel（60μl）添加到96 well板的孔中，轻轻摇晃培养板。在Matrigel凝固后，在每个孔中以1×10的细胞密度添加100μl HUVEC悬浮液4然后用CM处理细胞，并在37°C、5%CO中培养2培养24小时。为了对试管形成进行荧光监测，在收获之前，用2µM钙化蛋白AM（BD Biosciences）在37°C下培养HUVEC 30分钟。收集并计数细胞，以1×10的浓度进行单细胞悬浮6制备细胞/mL。细胞在无血清DMDM中稀释，加入CM。细胞以1×10的密度添加4每100μl注入每个孔，并在CO中培养24小时237°C培养箱。通过蔡司Axioverv 200倒置显微镜直接观察管的形成，并获得相衬显微照片。在分析过程中，只要使用钙调素AM，就可以使用蔡司荧光Axiovert 40 CFL倒置显微镜（485 nm激发/520 nm发射）观察试管的形成。为了分析使用相应物质治疗后的血管生成活性，通过使用ImageQuant 5.2软件（分子动力学）测量累积管长度来量化每个细胞群中管形成的程度。
2.3. ELISA检测
根据制造商的说明（研发系统），使用商用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测量分泌的VEGF浓度。CM的体积标准化为收集时出现的细胞总数。
2.4. 逆转录聚合酶链反应
根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒从培养细胞中提取总RNA（Qiagen）。通过在260:280 nm处测定光密度来评估RNA样品的纯度。使用GoScript逆转录系统（Promega）将三微克总RNA用于cDNA合成。所用引物的序列如下：HIF-1α，5′CAACCCAGACATACCACCTC和3′CTCTGATCTGAAACTCA；对于VEGF，5′GCTTGTCACATCTGCATCAC和3′AGTCCAACATCAGCAG；对于Actin，5´AAGTCAGTTACAGGTAAGCC和3´GTCCCCCAACTTGAGATGTATG。所有反应均在以下温度曲线下进行了30个周期：95°C持续3分钟（开始；之后30秒/周期）；55°C 45 s（退火）；72°C，持续45秒（延长）。然后在2%琼脂糖凝胶上分离10μl PCR产物，并用溴化乙锭染色观察条带。用ImageQuant 5.2软件对PCR产物进行定量。
2.5. 免疫印迹分析
使用了以下商业抗体和试剂：VEGF、HIF-1α、pVHL、phospho-Chk2、phosphal-ATM和泛素（细胞信号技术）；磷酸-E2F1和Prx-SO三（Abcam）；Prx-SO公司三（越境）；IDH1和IDH2（Sigma Aldrich）；和肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology）。常规免疫印迹程序用于检测目标蛋白：收集细胞，在冷PBS中清洗一次，然后刮取TEGN缓冲液（10 mM Tris，pH 8，1 mM EDTA，10%甘油，0.5%Nonide P-40，400 mM NaCl，1 mM DTT，0.5 mM苯甲基磺酰氟和含有1 M苯甲脒，3 mg/mL亮氨酸，100 mg/mL杆菌肽和1 mg/mLα2巨球蛋白的蛋白酶抑制剂混合物），在冰上培养15分钟。然后在20000下用离心法清除裂解液克持续10分钟。测定总蛋白浓度通过Bio-Rad蛋白质测定法。在10%SDS-PAGE上分离等量的蛋白质，并将蛋白质转移到硝化纤维素膜（Bio-Rad）。然后将膜在含有5%脱脂奶粉和0.1%吐温-20的PBS溶液中封闭1小时，然后在1%牛奶中用一级抗体、在PBS中用0.1%吐温-20探测过夜。清洗后，用1%牛奶中的辣根过氧化物酶连接二级抗体（Sigma-Aldrich）、在PBS中用0.1%吐温-20培养1小时。最后，在0.1%PBS/Tween-20中洗涤三次5分钟后，通过增强化学发光（Amersham Biosciences）观察蛋白质。使用ImageQuant 5.2软件对谱带强度进行量化。
2.6. 免疫细胞化学分析
为了研究VEGF的表达，对RPE细胞进行了VEGF免疫荧光染色。细胞在盖玻片上生长24小时。此后，如图所示，用OMA处理细胞。细胞用PBS洗涤并用4%多聚甲醛固定，用0.5%Triton X-100在PBS中渗透，并用封闭溶液预处理。固定后并阻断非特异性结合后，将盖玻片与抗VEGF抗体（细胞信号技术）在4°C下孵育过夜，然后与FITC-结合二级抗体（载体实验室）在室温下在黑暗中孵育1小时。清洗后，用DAPI对细胞进行复染，并将盖玻片贴在DAKO细胞荧光贴装培养基（DAKO）上。用倒置荧光显微镜对制剂进行分析。使用ImageQuant 5.2软件进行图像分析。
2.7. 蛋白酶体抑制和免疫沉淀
如图所示，在不含OMA的情况下，用20µM MG-132（Sigma-Aldrich）处理RPE细胞，然后用常规免疫印迹法检测蛋白质稳定性。对于泛素化分析，用冰镇PBS清洗RPE细胞，并在含有150 mM NaCl、50 mM Tris–HCl、pH 7.4、1%NP-40、1 mM NaF、1 mM-Na的缓冲液中溶解三VO（旁白）4，和不含EDTA的Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Scientific Pierce）在冰上浸泡30分钟。总细胞裂解物（1 mg蛋白质）在4℃下用2μg抗HIF-1α免疫沉淀1 h。添加蛋白质G Sepharose（GE Healthcare Bio-Sciences AB），并在4°C下培养过夜。免疫沉淀细胞裂解物经10%SDS-PAGE处理，用抗泛素抗体检测泛素化HIF-1α（Santa Cruz Biotechnology）。ImageQuant 5.2用于根据免疫印迹照片中显示的带密度量化蛋白质水平。
2.8. 氧化还原状态和细胞活性氧的测量
总谷胱甘肽的浓度由5-硫代-2-硝基苯甲酸在412 nm处的形成速率决定（ε=1.36×104百万−1厘米−1)根据Akerboom和Sies描述的方法[48]用2-乙烯基吡啶处理谷胱甘肽（GSH）后，采用5,5´-二硫代双（2-硝基苯甲酸）-GSSG还原酶循环法测定GSSG[49]如前所述，使用酶循环法测量NADPH[50]并表示为NADPH与NADP总库的比率。如前所述，通过使用荧光素酶测定细胞内ATP水平[51]在特纳设计TD 20/20光度计（Stratec生物医学系统公司）中对发光进行了量化。利用FACS分析（BD Biosciences）分别使用氧化敏感荧光探针DCFH-DA和阳离子试剂JC-1（分子探针）测量细胞内ROS生成和线粒体膜电位[52]荧光强度以对数标度上的任意单位表示。线粒体ROS的形成如下所示：在培养基中加入5µM的MitoSOX（Invitrogen），孵育10分钟后，用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，用Mowiol固定在载玻片上，并在荧光倒置显微镜下观察。通过为每个样本选择20-30个细胞的细胞区域，并使用ImageQuant 5.2软件测量MitoSOX荧光强度，进行定量。
2.9. 小鼠异种移植模型
采集处于亚融合状态的RPE细胞或HUVEC，用PBS洗涤，并在无血清培养基中重新悬浮。总计1.5×106在存在或不存在相应物质的情况下，将细胞与等体积的Matrigel混合。立即将混合物接种到6周龄雄性无胸腺nu/nu小鼠的两侧。这些动物在京畿国立大学大学实验动物资源中心的动物设施中进行繁殖，并在规定的无病原体条件下饲养。所有实验均按照大学机构动物护理和使用委员会的指导方针进行。在整个研究期间，以2-d的间隔监测动物的Matrigel塞大小。植入14天后处死动物，仔细切除Matrigel塞，不留其他邻近组织。立即对切除的塞子拍照，并对标本进行免疫组织化学分析，如下所述。
2.10. 组织学分析
将Matrigel塞样品固定在PBS中4%（w/v）多聚甲醛中，并用常规石蜡包埋法进行处理。将厚度为5µm的石蜡包埋组织切片进行热固定，使用二甲苯脱蜡，然后在一系列增加的乙醇浓度中进行再水化。通过在10 mM柠檬酸钠（pH 6.0）中培养切片并加热至90°C 20分钟来进行抗原回收。根据制造商的说明，使用VECTASTAIN ABC试剂盒（Vector Laboratories），使用针对PECAM、VWF和ERG（Santa Cruz Biotechnology）、phospho-E2F1（Abcam）和pVHL、HIF-1α、VEGF、phosphal-Chk2和phospho-ATM（Cell Signaling Technology）的抗体进行免疫组织化学。根据先前公布的方案对小鼠眼睛进行组织学研究[53]将每组的眼睛摘除，用4%多聚甲醛固定，并嵌入复合石蜡块中。然后，将5μm厚的组织切片脱蜡，再水化，并用于苏木精和伊红染色和免疫荧光。用于鉴定RPE细胞的抗体是抗细胞角蛋白18（Santa Cruz Biotechnology）。用DAPI（Vector Laboratories）对切片进行复染。使用蔡司Axiovert 200倒置显微镜或蔡司LSM 510激光扫描共聚焦显微镜采集图像。使用ImageQuant 5.2软件（分子动力学）的颜色去卷积特征分析染色强度。
2.11. CNV诱导和治疗干预
本研究使用8周龄雄性C57BL/6 J小鼠。这些动物被安置在气候控制的特定无病原屏障设施中，在12小时的光暗循环下，并提供食物和水随意Kyungpook国立大学动物护理和使用委员会批准了本研究的实验方案。根据先前记录的方案，通过视网膜下注射PEG诱导CNV[54]，[55]简而言之，用一根27 gauge的针头将针头穿过结膜和巩膜边缘后1 mm处，对动物的眼睛进行减压。使用配备Nanofil 100μl注射器和33 gauge钝针（Word Precision Instruments）的UMP3微型注射器进行注射。当操作员感到光阻力时，针停止移动。随后，单次注射0.5 mg PEG-8（PEG，平均M第页第400页；Spectrum Chemical）溶于2μl无菌PBS中，然后在10 s内给药。通过显微镜观察控制视网膜下水泡的形成。在CNV诱导后立即通过玻璃体内注射OMA进行局部给药[56]简而言之，用一把镊子将眼睛突出并固定到位，同时用33克皮下注射针（Sigma-Aldrich）注射4μg OMA/4μl PBS。注射部位用氯霉素处理，并重新放置球状物。在注射后第3天摘除眼睛，并进行视网膜和RPE/脉络膜组织处理以进行组织学分析。
2.12. 统计分析
结果显示为平均值±SD，使用双尾t吨-测试。
3.结果和讨论
3.1. OMA对VEGF表达和血管生成的影响
为了确定OMA是否能直接抑制RPE细胞中VEGF的表达，我们用OMA（5 mM）处理这些细胞24小时；收集CM，用ELISA法检测VEGF水平。VEGF水平被标准化为细胞数量和培养基体积的细胞数量。如所示A、 与对照细胞相比，OMA治疗导致RPE细胞中VEGF的生成减少。此外，根据中的数据A、 我们还发现，与对照细胞相比，经OMA处理的RPE细胞中VEGF蛋白显著减少(B和C），表明OMA治疗明显减少VEGF的表达和分泌。为了确定VEGF表达是否在mRNA水平降低，采用RT-PCR评估VEGF mRNA表达。如所示D、 我们观察到，与对照细胞相比，OMA处理的RPE细胞中的VEGF mRNA显著减少，表明OMA可以抑制VEGF转录。为了排除VEGF生成减少是由于细胞增殖受到抑制的可能性，我们在相同的实验条件下使用MTT分析细胞增殖。与对照细胞相比，OMA治疗对RPE细胞的增殖几乎没有影响（数据未显示）。这些结果表明，OMA抑制VEGF生成并不是通过调节细胞增殖或死亡。总之，这些结果表明，OMA通过抑制转录水平的表达来减少VEGF的生成。
OMA抑制VEGF表达和血管生成。（A） RPE细胞CM中VEGF的水平。数据以PBS处理的对照组百分比表示。（B）RPE细胞中VEGF胞内表达的免疫印迹分析。肌动蛋白被用作加载控制。显示了归一化为肌动蛋白的VEGF水平的量化。（C） RPE细胞中VEGF免疫荧光染色的代表性图像。直方图表示荧光强度的量化。用DAPI对细胞核进行复染。（D） RPE细胞中VEGF mRNA水平的RT-PCR分析。肌动蛋白被用作实验的内部控制。mRNA水平归一化为肌动蛋白水平。（E） HUVEC与CM孵育24小时的细胞增殖试验。然后用5%结晶紫或碘化丙啶（PI）染色细胞并进行评分。数据表示为用PBS处理的RPE细胞制备的CM处理的对照的比率。（F） 在CM存在下培养24小时的HUVEC迁移的代表性图像。按照材料和方法中的描述计算细胞迁移距离的范围。迁移距离的变化以对照组的百分比表示。（G） 钙黄绿素AM染色的HUVEC的明亮视野和荧光显微照片分别显示了在Matrigel上生长24小时的CM存在下HUVECs的形态外观和毛细血管形成。定量图像分析将血管生成结构的总管长描述为对照的百分比。（H） 用CM治疗的HUVEC的Matrigel塞中新生血管的宏观外观和血管生成标记物的免疫组织化学染色。血管密度和血管生成标志物表达水平的定量结果显示为对照的百分比。每个值代表三个独立实验的平均值±SD*P（P）<0.01,与对照组。图中显示了三个独立实验的代表性数据。
血管生成涉及内皮细胞的多种事件，包括细胞增殖、迁移和管形成，而VEGF在这些过程中起着核心作用。内皮细胞对VEGF的反应是有丝分裂，随后细胞组织成新血管[57]，[58]为了确定OMA的抗血管生成潜力及其通过VEGF抑制的潜在作用机制，在体外在HUVEC中进行血管生成分析，测量增殖、迁移和管形成。将RPE细胞与OMA（5 mM）混合培养24 h，并在一系列血管生成检测中将CM应用于HUVEC。
最初的实验是通过计算结晶紫染色后的HUVEC总数来评估内皮细胞的增殖。我们发现，用来源于RPE细胞的CM刺激后，增殖增加，但当HUVEC在OMA处理的RPE细胞制备的CM中培养时，增殖受到明显抑制(E） ●●●●。为了进一步评估OMA的抗血管生成活性，这是由VEGF的下调所暗示的，使用HUVECs进行了运动性和管形成测定。如所示F和G，OMA抑制RPE细胞制备的CM诱导的HUVEC的迁移和管形成。OMA对血管生成相关内皮细胞功能的影响在体外已确认体内在Matrigel血管生成分析中。免疫缺陷小鼠皮下注射Matrigel混悬液，混悬液中含有用未经处理或OMA处理的RPE细胞衍生的CM处理的HUVEC。如中所示H、 未经处理的RPE细胞经CM刺激后，在HUVEC中观察到新生血管。然而，当用OMA处理的RPE细胞衍生的CM处理HUVEC时，这种作用被阻止。综上所述，这些结果表明OMA具有强大的抗血管生成活性。
3.2. OMA对HIF-1α蛋白表达的影响
为了探讨OMA抑制VEGF的可能机制，我们确定OMA是否可以调节VEGF表达的主要调节因子HIF-1α的水平。VEGF的调节主要通过转录因子HIF-1α介导[3]我们用OMA处理RPE细胞，然后检测对HIF-1α蛋白水平的影响。如所示A、 我们发现OMA处理抑制了RPE细胞中HIF-1α的表达。为了研究HIF-1α是否参与调节RPE细胞中VEGF的表达，我们使用siRNA对HIF-1β进行RNA干扰；在转染抗HIF-1αsiRNA的细胞中，VEGF的表达显著降低，但在转染对照siRNA的电池中，VEGF的表达没有显著降低（数据未显示）。
OMA通过pVHL介导的泛素化促进HIF-1α的降解。（A） OMA治疗后RPE细胞中HIF-1α水平的免疫印迹分析。Actin充当加载控件。蛋白质水平归一化为肌动蛋白水平。（B） 定量RT-PCR分析RPE细胞中HIF-1α基因mRNA表达。肌动蛋白作为负荷控制进行了检查，并显示了描述基因相对丰度量化的图表。N.S.表示与对照组相比无显著差异。（C） HIF-1α的衰变动力学。对于HIF-1α的免疫印迹，在有或无OMA的情况下，用20µM MG-132处理RPE细胞指定的时间。总肌动蛋白的免疫印迹作为负荷对照。通过测量HIF-1α蛋白带的密度并将其归一化为肌动蛋白的密度，确定免疫印迹中HIF-1β蛋白的相对水平。数据表示为时间零点与控制的比率。（D） OMA处理可在RPE细胞中高度诱导pVHL。用5 mM OMA处理细胞，并在处理后24天收获，用肌动蛋白作为负荷对照，通过免疫印迹法检测pVHL诱导。pVHL定量结果归一化为肌动蛋白的表达，并显示。（E） OMA通过上调pVHL活性增加HIF-1α的泛素化。RPE细胞裂解物用抗HIF-1α抗体免疫沉淀，用抗pVHL和抗泛素抗体免疫印迹。总HIF-1α的免疫印迹作为负载对照。显示了归一化为HIF-1α的相对带强度。（F） 5 mM OMA存在下混合PRE细胞的Matrigel塞上VEGF蛋白表达和pVHL介导的HIF-1α降解的免疫组织化学染色。细胞核用哈里斯苏木精染色。所示蛋白质表达水平的定量结果表示为对照的百分比。该图显示了三个独立实验的代表性数据。误差线表示平均值±SD（n=3）*P（P）<0.01,与对照组。
接下来，我们询问OMA抑制HIF-1α蛋白积累是否会导致转录抑制。然而，经OMA治疗后，RT-PCR显示RPE细胞HIF-1αmRNA水平无明显变化(B） 。这些结果表明，OMA可能通过转录后机制抑制HIF-1α蛋白的积累。OMA抑制活性的一种可能的转录后机制是HIF-1α蛋白的降解增加和/或合成减少。为了确定OMA干扰HIF-1α蛋白表达抑制的点，我们检测了蛋白酶体抑制剂MG-132治疗后RPE细胞中HIF-1β的积累，以防止HIF-1 a降解。在MG-132存在下，HIF-1α在2小时内迅速累积。特别值得注意的是，在有或无OMA的情况下HIF-1α的积累率似乎具有可比性(C） 强烈表明，OMA对VEGF和HIF-1α蛋白表达的抑制作用主要是通过直接促进HIF-1β降解而不是通过抑制HIF-1γ的合成来介导的。
接下来，我们希望了解在OMA存在下如何促进HIF-1α蛋白降解。众所周知，pVHL肿瘤抑制因子在HIF-1α稳定性的调节中起着关键作用，通过E3泛素连接酶的泛素化和蛋白质体降解[59]，[60]此外，pVHL突变阻止其与HIF-1α的相互作用，HIF-1β积累并刺激编码生长因子（如负责新生血管形成的VEGF）的几个基因的表达[61]，[62]因此，pVHL是一种重要的肿瘤抑制因子，主要通过抑制HIF-1α介导的VEGF表达来抑制血管生成性肿瘤的生长，以应对DNA损伤或氧化应激[60]为了检测OMA对pVHL活性的贡献以及随后pVHL介导的HIF-1α泛素化，我们用OMA处理RPE细胞并分析pVHL的表达(D） 以及HIF-1α的泛素化(E） ●●●●。数据显示，OMA治疗诱导pVHL上调(D） 重要的是，pVHL活性的增加反映在HIF-1α泛素化的刺激上(E） 表明OMA通过pVHL介导的泛素化促进HIF-1α的降解。
为了进一步证明OMA可以通过靶向HIF-1α以pVHL介导的破坏来抑制VEGF的表达，将含有或不含OMA的RPE细胞的Matrigel混合物皮下注射到免疫缺陷小鼠的侧面区域。按照此治疗方案，采集Matrigel塞并用所示抗体进行免疫组织化学染色。F表明服用OMA显著抑制了VEGF的表达通过与对照样品相比，pVHL介导的HIF-1α降解激活，这与E.这为视网膜色素上皮对OMA的反应提供了一种机制性解释。因此，这些结果支持OMA通过干预pVHL介导的HIF-1α降解激活来抑制VEGF表达的结论。
3.3. OMA对E2F1通路的影响
迄今为止的数据表明，OMA上调RPE细胞中的pVHL活性，这与通过HIF-1α降解抑制VEGF生成有关。然而，这些数据并没有提供对这种关联性质的深入了解。我们认为E2F1转录因子是在pVHL活性和OMA之间建立联系的潜在候选因子，因为pVHL是E2F1的直接下游靶点[63]此外，最近有报道称E2F1的磷酸化和活性形式是以ROS依赖的方式调节的[64]，[65]先前已经对E2F1的ROS依赖性磷酸化进行了一些详细的研究。ATM蛋白激酶被细胞ROS磷酸化，作为细胞中的氧化还原传感器，ATM的ROS依赖性磷酸化激活效应激酶Chk2，进而磷酸化其下游靶标E2F1[32]，[64]，[66]，[67].
因此，为了解决pVHL活性的调节是否由ATM-Chk2-E2F1轴的磷酸化和激活介导，我们测试了OMA对参与该信号通路的成分磷酸化的影响。如中所示A、 我们发现OMA可以激活E2F1、Chk2激酶和E2F1转录因子的磷酸化。此外，根据A、 在用OMA治疗的小鼠得到的基质胶塞中，与对照样品相比，这些信号成分的磷酸化显著升高(B） 。这表明，激活ATM-Chk2-E2F1信号轴至少部分有助于增强OMA对pVHL介导的HIF-1α降解的作用，并反映在抑制VEGF表达中。
OMA调节ROS依赖的E2F1激活。（A） OMA治疗后（5 mM，24 h）RPE细胞中与ATM介导的E2F1激活相关的蛋白质的免疫印迹分析。肌动蛋白被用作加载控制。所示蛋白质水平的量化标准化为肌动蛋白的表达并显示。（B） 在OMA存在下，对Matrigel塞与PRE细胞混合的ATM信号轴相关蛋白进行免疫组织化学分析。所示为所示蛋白质水平的定量，作为对照的百分比。（C） 线粒体SOX荧光水平用于评估经OMA处理的RPE细胞线粒体ROS生成。直方图表示荧光强度的量化。（D） RPE细胞线粒体跨膜电位（MMP）的流式细胞术分析。细胞在5 mM OMA存在或不存在的情况下生长24 h，并使用线粒体荧光探针JC-1染色，然后进行FACS分析以测定MMP。通过JC-1荧光形式从红色（JC-1聚集物；MMP高的线粒体）变为绿色（JC-1单体；MMP低的线粒体）来证明MMP的丢失。MMP的定量表示为不同治疗组中JC-1（绿色/红色）的比率。（E） Prx-SO的免疫印迹分析三未经治疗或经OMA治疗的RPE细胞中的水平。肌动蛋白被用作加载控制。显示了归一化为肌动蛋白的蛋白质水平的定量。（F） GSSG比率与总谷胱甘肽浓度，NADPH比率与在OMA处理后测量RPE细胞中NADP总浓度、细胞内过氧化物生成和ATP水平。数值表示为在控制中观察到的水平上的折叠变化。（G） 通过ROS控制的RPE细胞中E2F1活性调节HIF-1α介导的VEGF表达的模型，以及OMA抑制IDH酶的结果。数据表示为三个独立实验的平均值±SD*P（P）<0.01,与对照组。图中显示了三个独立实验的代表性数据。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）
接下来，我们试图阐明OMA治疗导致这些信号轴中ATM激酶激活升高的机制。已经证实，细胞质和核活动之间的协调对细胞内环境稳定至关重要，在这种细胞内通讯过程中，一些信号分子和转录因子，如ATM激酶和肿瘤抑制因子p53，受细胞内ROS的调节[32]，[68].OMA，一种三羧酸（α-羟基-β-草糖基琥珀酸），形成于在体外和体内草酰乙酸和乙醛酸的缩合(补充图1A)已知是NADP的一种强有力的竞争性抑制剂+-依赖性异柠檬酸脱氢酶亚型1（IDH1）和亚型2（IDH2），分别定位于细胞质和线粒体[23]，[24]特别是，这两种IDH酶亚型都是各自亚细胞隔室中的主要NADPH产生者，因此通过维持NADPH依赖的GSH/GSSG比率在细胞氧化还原调节中发挥关键作用[37]，[38]，[39]因此，这强烈表明OMA对IDH酶的抑制调节细胞氧化还原状态，因此负责调节此信号通路。正如预期的那样，OMA处理RPE细胞后，IDH1和IDH2的酶活性均被显著抑制，而IDH酶的总体水平没有明显变化(补充图1B和C). 接下来，我们抑制了IDH活性，并检测了对线粒体氧化还原状态和细胞内ROS生成的影响；我们分析了线粒体氧化还原(C） ，线粒体膜电位(D） 和细胞内活性氧(E和F）。数据显示，OMA对IDH酶的失活导致线粒体ROS水平升高，与线粒体膜电位改变有关，并导致RPE细胞内ROS水平增加。这表明OMA治疗后RPE细胞的ROS总体增加。综合起来表明OMA抑制IDH酶，导致细胞ROS生成增加，调节RPE细胞中ROS依赖的ATM介导的E2F1轴。
G总结了我们研究的机制发现如下：OMA降低了IDH酶的活性，作为RPE细胞中的竞争性抑制剂，导致细胞内ROS升高，从而激活E2F1转录因子。这种情况会发生通过ROS介导的ATM-Chk2信号轴的调节，由细胞氧化还原状态的调节引起。因此，E2F1的激活导致pVHL活性上调，进而通过促进HIF-1α降解抑制VEGF的生成。因此，这些数据表明OMA在抑制VEGF介导的血管生成中起着关键作用。
3.4. OMA对老年性黄斑变性伴脉络膜新生血管的影响
接下来，我们确定通过OMA抑制RPE细胞中VEGF表达是否可用于治疗目的。RPE衍生的VEGF被认为是AMD中CNV形成的关键分子之一[13]，[14]因此，我们推断OMA可能会抑制CNV相关的血管生成，特别是抑制RPE相关的VEGF生成。我们使用聚乙二醇（PEG）诱导的AMD小鼠模型[54]，[55]测试OMA治疗CNV发展和视网膜功能障碍的疗效。通过视网膜下注射PEG-8在8周龄雄性C57BL/6 J小鼠中建立AMD小鼠模型[55]随后，小鼠在诱导CNV形成后立即通过玻璃体内注射接受4μg的OMA。治疗后，我们对小鼠眼睛的石蜡切片进行了组织学研究。与对照组织相比，PEG-8注射小鼠的外视网膜和脉络膜组织的光镜评估显示出明显的组织变化(A） ●●●●。CC通常在Bruch膜（BrM）下形成一个连续的神经丛，被扩大的不连续血管所取代。此外，脉络膜血管系统的变化与RPE功能障碍有关，RPE细胞核密度增加证明了这一点。
OMA抑制AMD小鼠模型中RPE-衍生VEGF的表达和CNV的形成。（A） 按照专家组所述进行治疗的小鼠的外视网膜和脉络膜组织的代表性苏木精和伊红染色切片(n个=7). （B和C）分别用抗VWF和抗VEGF抗体（红色）检测不同治疗组脉络膜血管（B）和RPE-衍生VEGF表达（C）的免疫组织化学染色(n个=7). 用DAPI（蓝色）检测细胞核。所示为合并图像，与RPE细胞特异性标记物细胞角蛋白18（CK18，绿色）相关。按照材料和方法的规定，在注射后第3天处死动物，并进行组织学分析。左侧的面板表示注射PBS后RPE脉络膜的正常结构。虚线表示视网膜下间隙中的RPE细胞层。组织切片中的条显示为10µm。该图显示了五个独立实验的代表性数据。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）
然而，RPE-BrM-CC复合物的病理表型是AMD病理学的标志[69]经OMA治疗后，这些区域的细胞数量显著减少（达到与对照组相当的水平）。与对脉络膜血管系统的影响平行，OMA的给药显著抑制了CNV相关的血管生成，这是AMD的标志[4]，[5]位于视网膜下位置的两层细胞角蛋白18阳性RPE细胞之间。相反，与对照组相比，注射PEG-8的小鼠的突出脉络膜血管仅位于脉络膜内(B） ●●●●。体内OMA治疗后RPE中VEGF表达的测量表明，与PEG-8治疗的小鼠相比，RPE顶端和脉络膜内VEGF阳性染色显著减少。这表明RPE对OMA治疗有良好的反应，RPE是CNV相关VEGF的主要产生者(C） ●●●●。因此，从体内AMD小鼠模型支持基于培养细胞实验的预测，即OMA通过抑制RPE介导的VEGF表达来抑制CNV相关血管生成。
总之，我们的研究结果表明，OMA能够通过以下多种机制调节RPE细胞中VEGF的表达和分泌：（1）通过抑制IDH酶调节细胞内ROS；（2） 促进ROS依赖的ATM-Chk2-E2F1信号轴；（3） 激活pVHL介导的HIF-1α降解。此外，鉴于RPE-derived VEGF在AMD期间CNV形成中的重要作用，我们的数据强烈支持以下假设，即OMA通过减少RPE-derivated VEGF的生成来抑制CNV形成，从而表明OMA在针对AMD发病机制的治疗方法方面的潜在发展。
致谢
我们感谢实验室成员的帮助，特别是林叶进和金正浩，他们批判性地阅读了手稿并提供了有用的评论。我们感谢李素熙、潘真勋、金俊浩和金英俊对手稿的批判性评论和有益讨论。我们感谢韩国京畿大学生物医学研究成像中心的服务。这项工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，由韩国政府（MSIP）资助（NRF-2015R1A4A1042271和NRF-2015R1C1A1A01053746），并由韩国大学授予。没有报告与本文相关的潜在利益冲突。
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