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氧化还原生物。2016年12月；10: 206–210.
2016年10月25日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.redox.2016.10.011
预防性维修识别码：项目编号：5094378
PMID：27810735

人类和啮齿动物在浓缩唾液硝酸盐能力上的深刻差异：转化研究的意义

马塞洛F黑山,一 迈克尔·L·桑德奎斯特,a、，b条 卡琳娜·尼尔森,一 迈克尔·赫泽尔,一 马蒂亚斯·卡尔斯特罗姆,一 埃迪·魏茨伯格,一和乔恩·伦德伯格a、，⁎
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

在人类中，饮食循环中的硝酸盐通过唾液腺的主动运输在唾液中迅速积累。通过这种机制，唾液中的硝酸盐浓度是血浆中的10-20倍。口腔中的硝酸盐被共生细菌还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐随后被吞咽并进一步代谢为血液和组织中的一氧化氮（NO）和其他生物活性氮氧化物。硝酸盐的这种肠唾液循环是摄入无机硝酸盐后观察到的各种NO-like效应的核心。同样的系统也是毒理学家研究亚硝酸盐依赖性亚硝胺形成的潜在致癌作用的重点。硝酸盐的主动运输和唾液中的蓄积是否也发生在啮齿动物身上尚不完全清楚。在这里，我们测量了人类、大鼠和小鼠在服用标准剂量的硝酸盐后唾液和血浆中硝酸盐和亚硝酸盐的水平。

口服（人类）或腹腔注射（啮齿动物）硝酸钠（0.1 mmol/kg）后，所有三种物种的血浆硝酸盐水平均显著增加，达到约300µM。人类摄入硝酸盐后，唾液中硝酸盐含量迅速增加至>6000µM，即是血浆中硝酸盐浓度的20倍。相反，大鼠和小鼠唾液中的硝酸盐浓度从未超过血浆中的水平。唾液和血浆中的亚硝酸盐水平也遵循类似的模式，即在人类中显著增加，但在啮齿动物中略有升高。在小鼠唾液腺中也没有硝酸盐蓄积，这是在急性给予硝酸盐后获得的整个腺体中直接测量的。

这项研究表明，与人类相比，大鼠和小鼠并不积极地在唾液中集中循环硝酸盐。在研究啮齿类动物的硝酸盐-亚硝酸盐-一氧化氮途径、计算剂量、探索生理、治疗和毒理学效果以及与人类数据进行比较时，应考虑到这些明显的物种差异。

关键词：一氧化氮、亚硝酸盐、硝酸盐、膳食、微生物组、唾液腺

集锦

  • •
    在人类中，饮食中的硝酸盐通过唾液腺的主动运输有效地集中在唾液中。
  • •
    人类唾液中的硝酸盐水平是血浆中的10-20倍。
  • •
    与人类相比，大鼠和小鼠在唾液中不积极地浓缩硝酸盐。
  • •
    这些物种差异对翻译研究具有暗示意义。

1.简介

在哺乳动物中，硝酸盐-亚硝酸盐-NO途径已成为补充经典一氧化氮合酶（NOS）依赖途径的NO生成的重要额外来源[1],[2]NOS衍生NO内源性氧化后形成的无机硝酸盐或外源性饮食来源形成的无机硝态氮可被连续还原为亚硝酸盐，随后形成NO和各种其他潜在生物活性氮氧化物。摄入无机硝酸盐可使人和动物产生可测量的类一氧化氮生物活性，包括血压降低[3],[4]，抑制血小板聚集[5]以及代谢功能的改善[6],[7]硝酸盐和亚硝酸盐可以作为NO生成的底物，这一事实挑战了饮食中硝酸盐对健康有害的教条。在发现硝酸盐-亚硝酸盐-NO途径之前，硝酸盐主要是以生成潜在致癌亚硝胺的底物而闻名[8]有趣的是，从硝酸盐生成亚硝胺的途径与生成NO的途径相同，因为两者都需要中间生成更具活性的亚硝酸盐阴离子。

人类体内硝酸盐生物活性的一个核心过程是唾液腺从血液中主动吸收并在唾液中排泄。口腔中的共生菌将唾液中的硝酸盐还原为活性更强的亚硝酸盐阴离子[9].亚硝酸盐随后被吞下，在酸性胃环境中局部形成许多氮氧化物，吸收后在血液和组织中全身形成[1]在人类唾液中硝酸盐的积累程度是显著的，据信，25%的循环硝酸盐被唾液腺吸收，由此产生的唾液水平比血浆中高出20倍[10],[11],[12]在实验中，受试者在摄入硝酸盐后的一段时间内避免吞咽唾液，这清楚地说明了硝酸盐-亚硝酸盐-NO途径运行对唾液中硝酸盐积累和还原为亚硝酸盐的要求[5],[11]或使用抗菌漱口水防止细菌硝酸盐减少[12]在这两种情况下，硝酸盐的生理作用都被消除了。

虽然在人类中观察到的饮食硝酸盐的大多数有利影响也发生在啮齿类动物中，但在啮齿目动物中观察到类似影响所需的剂量通常要高得多[13]有人建议啮齿动物唾液中不含硝酸盐[14],[15],[16]但目前缺少与人类的直接测量和比较。在这项研究中，我们开始直接比较人类、大鼠和小鼠唾液中的硝酸盐浓度，方法是给药标准量的硝酸钠，然后随时间重复采集血液和唾液样本。

2.材料和方法

瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所区域伦理委员会批准了这项研究的人体部分。实验方案由瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所动物护理和使用机构委员会（IACUC）批准，并根据国家卫生研究院动物实验指南执行。

2.1. 研究参与者和实验动物

五名年龄在27-57岁的健康志愿者（3名女性）参与了这项研究。受试者在禁食一整夜后，在前一天被指示避免食用富含硝酸盐的食物后，于第二天早上抵达实验室。在肘前静脉放置导管进行采样。采集基础血液和唾液样本后，摄入硝酸钠（0.1 mmol/kg溶于10 mL饮用水中），并在60 min内重复采集血液和唾液。

使用灭活素（60 mg/kg）和氯胺酮（60 mg/kg/kg）麻醉体重280–500 g的大鼠（Sprague Dawley），并仔细进行气管造口术，以避免对颌下腺造成任何损伤。将导管（PE50）插入股静脉进行采血。之后，腹腔内注射低剂量毛果芸香碱（64µg/kg），以诱导低唾液流量，足以使用毛细管收集唾液。在基线收集唾液和血液后，腹腔注射硝酸钠（0.1 mmol/kg），并在15、30、45和60分钟收集唾液和血。在小鼠实验中，使用氯胺酮（100 mg/kg）麻醉动物（C57Bl/J6），然后腹腔注射匹罗卡品（64µg/kg）。在腹腔注射硝酸钠（0.1 mmol/kg）前（基线）和60分钟后收集唾液和血液。在另一组实验中，6只小鼠接受了硝酸钠（0.1mmol/kg）的单次胃灌胃。60分钟后，对小鼠进行麻醉，并采集血液，同时切除并快速切除舌下腺和腮腺。这些实验中没有使用毛果芸香碱。

2.2. 样品制备

立即在+4°C（4700×克，5分钟），血浆储存在−80°C下，直到分析。使用HPLC级甲醇（CROMASOLV，Sigma-Aldrich）提取血浆样品，并使用玻璃瓶在冰箱中预冷甲醇，以避免不同塑料材料的亚硝酸盐/硝酸盐污染。简而言之，将100µL甲醇添加到1.5 mL Eppendorf试管中的100µL血浆中，以检测亚硝酸盐/硝酸盐污染。对试管进行涡流，然后离心10分钟4°C 10000克.

唾液样本在4℃和10000℃下离心10分钟克在用含有10%HPLC级甲醇的载体溶液稀释之前。

将从动物身上取下的唾液腺称重，切成小块，并立即放入冰镇甲醇1mL/g组织中。然后使用子弹搅拌器和锆石珠将组织均匀化。均质后，样品在4°C 10000下离心10分钟克。然后将上清液转移到另一个试管中，并在−20°C下储存过夜。

2.3. 硝酸盐和亚硝酸盐评估

使用专用于评估亚硝酸盐和硝酸盐的高效液相色谱系统（ENO-20；日本EiCom），并连接到自动采样器（840，日本京都EiCom840）。该方法对亚硝酸盐和硝酸盐敏感且特异，其基础是通过反相/离子交换色谱法分离硝酸盐，然后用镉和还原铜将硝酸盐在线还原为亚硝酸盐。用格里斯试剂对还原硝酸盐进行衍生化，并在540 nm处测量重氮化合物的含量。反应器溶液在分析前新鲜制备。用亚硝酸钠和硝酸钠制备标准曲线，并用0.1-20µM范围内的载体溶液进行稀释。将等分标准品储存在−20°C下。对斜率进行了检查，并用于计算样品中的浓度。

在HPLC中运行样品之前，将100µL样品转移到带有锥形孔的96孔板中（无Costar、硝酸盐和亚硝酸盐）。为了避免自动采样器的蒸发和污染，自动采样器含有大量向周围空气释放NO的电气元件，我们用无菌膜密封了板，自动采样器针头很容易穿透。样品通过自动取样器中的冷却装置保持在4°C。使用PowerChrom软件（V 2.7.9，eDAQ）收集和分析数据。

2.4. 药物和解决方案

所有使用的药物和试剂均购自西格玛化学公司（美国密苏里州圣路易斯）。所有药物在使用前立即溶于生理盐水中。

2.5. 统计分析

结果表示为平均值±S。E.M.各组之间的比较通过t吨测试，使用Bonferroni校正进行双向方差分析，或使用Dunnett的多重比较测试进行单向方差分析。p值<0.05被认为是显著的。

3.结果

服用硝酸盐后的血浆和唾液硝酸盐水平如所示图1在人类中，摄入硝酸钠后，血浆和唾液中的硝酸盐如预期般增加。60分钟时，血浆硝酸盐浓度为299±14µM，而唾液中的硝酸盐浓度达到6022±485µM。唾液与血浆的比值约为20:1(图1E） ●●●●。在大鼠和小鼠腹腔注射硝酸盐后，观察期间血浆硝酸盐也显著增加。60分钟时，大鼠血浆硝酸盐水平增加到357±72µM，小鼠血浆硝酸盐水平增加到261±54µM(图1C） 与唾液中的结果相似（大鼠和小鼠分别为343±91和260±29，图1D） ●●●●。因此，在大鼠和小鼠中，唾液与血浆中硝酸盐的比率接近1:1(图1E） ●●●●。所研究的三种物种唾液样本中硝酸盐水平的代表性HPLC追踪显示于图2.

图1

硝酸盐给药对人、大鼠和小鼠血浆和唾液中硝酸盐水平的影响。口服（人类，n=5）或腹腔注射（大鼠，n=12）0.1 mmol/kg硝酸钠后，重复测量人和大鼠血浆（A）和唾液（B）中的硝酸盐。给药60分钟后测量大鼠、小鼠（n=6）和人类血浆（C）和唾液（D）中硝酸盐水平以及唾液与血浆（E）的比值。#p<0.01和p<0.05。通过重复测量ANOVA和Dunnett的多重比较测试，在同一组内与基线（0分钟）进行比较。数据显示为平均值±S。E.M.公司。

图2

具有代表性的HPLC追踪显示在给予硝酸钠0.1 mmol/kg后收集的唾液中测得的硝酸盐水平。

服用硝酸盐后，人体血浆和唾液中亚硝酸盐水平显著升高(表1). 这种增加也发生在啮齿动物身上，但程度要小得多。

表1

硝酸钠（0.1 mmol/kg）给药前和给药60分钟后唾液和血浆中的亚硝酸盐水平（μM）。

人类（n=5）大鼠（n=12）小鼠（n=6）
唾液基础63 (38)0.654 (0.12)1.52 (0.51)
60分钟2023 (495)*14.28 (4.18)*5.04 (2.33)


等离子玄武岩0.220 (0.04)0.245 (0.02)0.265 (0.05)
60分钟0.716（0.15）*0.461 (0.10)*0.337 (0.04)

数据显示为平均值±（S.E.M.）

*p<0.05。与基线（0分钟）

在提前60分钟接受硝酸盐治疗的麻醉小鼠的整个唾液腺中，硝酸盐的水平与在同一时间点采集的血浆中的水平没有差别(图3).

图3

给药硝酸钠（0.1 mmol/kg）60分钟后，测量小鼠血浆和整个唾液腺中的硝酸盐水平。组间差异（n=6）不显著。

4.评论

这里的结果表明，与人类相比，啮齿动物并不能有效地将硝酸盐集中在唾液中。如图所示，人类摄入硝酸盐后，唾液中的硝酸盐迅速积累，其浓度是血浆浓度的20倍以上。这显然是一个非常强大的系统，允许口腔细菌将大量硝酸盐还原为亚硝酸盐，最终产生许多具有潜在生物活性的氮氧化物[17].

如果小鼠和大鼠不能有效地将硝酸盐集中在唾液中，那么为什么饮食中的硝酸盐在这些物种中仍然具有生物活性？有几种可能的解释。首先，这里指出的硝酸盐从血液到唾液的被动扩散可能足以使口腔共生细菌形成足够的亚硝酸盐。如果是这样的话，这可以解释为什么在啮齿动物研究中通常需要更高剂量的硝酸盐来达到生理上的类氮效应。其次，啮齿动物可能通过上调哺乳动物系统的调节，将硝酸盐还原为亚硝酸盐，从而补偿了无效的硝酸盐运输和随后的口腔微生物硝酸盐减少。事实上，黄嘌呤氧化酶能够做到这一点，并负责在给药硝酸盐后无菌小鼠体内系统亚硝酸盐的增加[18],[19]此外，硝酸盐的许多有利作用(体内)或亚硝酸盐(在体外)通过抑制啮齿类动物的异或而消除[20],[21],[22],[23],[24]第三，据报道啮齿动物在上消化道分泌硝酸盐[25]这显然不会发生在人类身上[12]这种硝酸盐可以通过居住在这些位置的细菌进行类似的代谢，从而通过最初还原为亚硝酸盐来增强硝酸盐的生物活性。

一个令人费解的事实是，当地使用抗菌漱口水似乎有效地阻止了啮齿动物饮食中硝酸盐的影响[13],[26]就像它们在人类身上一样[12]这确实表明，小鼠和大鼠体内也存在一些硝酸盐的肠唾液循环，表明即使没有有效浓度，唾液中较低的硝酸盐和亚硝酸盐水平也可能足以引发效应。最近的一项研究证实了这一点，在无菌小鼠的饮用水中添加微量亚硝酸盐（与人类空腹唾液中的亚硝酸盐水平相似），会导致强烈的生理反应，表现为胃粘液形成增加[27].

服用硝酸盐后唾液硝酸盐含量增加，随后人类唾液亚硝酸盐含量也显著增加。这是先前研究的预期结果，是有效的细菌硝酸还原酶活性的结果[10],[11],[12]唾液亚硝酸盐也在啮齿类动物中增加，但程度要小得多。这可能有几个原因。首先，啮齿动物唾液中硝酸盐的积累要低得多。其次，由于唾液流的收集方法和药物刺激，啮齿类动物的硝酸盐暴露于口腔细菌的时间较短。除此之外，啮齿类动物的口腔微生物群在硝酸盐还原能力方面可能与人类不同，尽管这里没有对此进行专门研究。在所研究的三个物种中，亚硝酸盐的血浆水平遵循相同的趋势，在人类中出现了更大的增加。总的来说，与啮齿动物相比，硝酸盐的肠唾液再循环以及由此产生的生物活性以形成更具活性的亚硝酸盐阴离子似乎对人类更有效。

除了研究饮食中硝酸盐对心血管的有益影响的研究人员感兴趣外，这项研究还可能与毒理学家研究硝酸盐的潜在有害影响有关，包括亚硝胺的形成[8],[10]事实上，与啮齿动物相比，人类在硝酸盐负荷后唾液中亚硝酸盐的积累要大得多，因此也具有亚硝化能力。

本研究存在一些值得提及的局限性。很难从啮齿动物身上获得唾液，因此使用毛果芸香碱可以刺激唾液流动。在人类中，这是不需要的，也没有使用毛果芸香碱。有人可能会争辩说，毛果芸香碱诱导的唾液流量如此之高，以至于不可能有效地浓缩硝酸盐。虽然从更高的流速将导致更低的绝对硝酸盐浓度的意义上来说，这是最正确的，但稀释因子仍不太可能完全掩盖啮齿动物的浓缩能力。为了尽量减少这种稀释因子，我们使用了低剂量的毛果芸香碱，刚好可以使用毛细管收集唾液。因此，如果啮齿类动物体内存在活性硝酸盐浓度，唾液与血浆的比率可能不会低至1:1。事实上，兔子唾液中也含有硝酸盐[28]尽管动物接受了高剂量的毛果芸香碱治疗，但仍存在高比例的唾液：血浆。另一个潜在的混淆因素是在啮齿动物中使用麻醉剂，理论上可能会影响唾液腺的功能。然而，在早期研究碘如何在大鼠唾液中浓缩的研究中（碘在唾液腺中的转运机制与硝酸盐的转运机制相同），麻醉并不影响阴离子浓缩的能力[15].

总之：本研究的结果支持这样一种观点，即与人类和其他一些哺乳动物相比，大鼠和小鼠在唾液中不会主动浓缩硝酸盐。

资金来源

本研究得到了威廉·哈维研究院（项目608765）和瑞典心肺基金会（项目20140673）的资助。

利益冲突

伦德伯格博士和魏茨伯格博士是硝酸盐和亚硝酸盐医疗用途专利申请的共同发明人。

致谢

我们感谢Anette Ebberyd、Annika Olsson和Margareta Stensdotter（卡罗琳斯卡研究所生理学和药理学系）的杰出技术贡献。

工具书类

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