Nrf2介导氧化还原适应运动

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1.简介

随着分子生物学的发展及其在运动中的应用，人们对急性运动诱导的细胞信号转导的认识大大增强，而急性运动会导致在多次运动后积累的生理适应。急性运动激活主要信使，如腺苷一磷酸（AMP）、钙和机械应激，随后激活次要信使，包括AMP-活化蛋白激酶（AMPK）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CAMK）和p38丝裂原活化蛋白激酶，导致mRNA转录的急性变化[1]急性运动刺激的另一个重要的主要信使是氧化还原平衡（或氧化还原电位）通过产生活性氧物种（ROS）而向更氧化状态的暂时变化[2]虽然ROS最初被指定为具有破坏性，但现在人们对ROS在细胞信号传导、免疫功能调节、基因转录和凋亡中的重要作用有了更深入的了解[3],[4],[5],[6]ROS在转录因子核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）激活中的作用是一个典型的例子，Nrf2是抗氧化酶和细胞抗应激的主要调节因子[7],[8],[9].

啮齿动物研究的数据表明，靶向Nrf2活性可降低疾病风险。目标Nrf2击倒（Nrf2^–/–)模型显示，所有组织对毒性和氧化应激源的抵抗力都显著受损，因此，Nrf2^–/–老鼠更容易患慢性病[10]针对Nrf2激活的药理学和遗传学（负调控基因敲除）方法有效改善氧化应激源的损伤并恢复对慢性病的抵抗力[11]在Nrf2信号传导被破坏的情况下病理学增加，以及随后Nrf2激活物的逆转已在其他地方进行了综述[12].

越来越多的证据表明，Nrf2通路在氧化应激如何介导运动的有益效果方面发挥着关键作用。通过多次急性运动诱发的氧化应激的间歇性增加刺激了Nrf2的激活，当重复应用时，如定期运动，这可能会导致内源性抗氧化防御系统的上调，总体上更能抵消氧化对核酸、蛋白质和脂质的破坏作用。

本综述的主要目的是总结关于急性运动和定期运动或运动干预对Nrf2活性和Nrf2信号下游靶点的影响的现有文献。我们还研究了支持或反对使用抗氧化剂补充剂和植物营养素Nrf2激活剂的证据与锻炼。由于当靶点受损时，干预的效果更容易看到，因此我们将强调始终将衰老作为受损细胞信号传导的非疾病模型进行的研究，这通常与年龄相关的病理表现相协调[13],[14],[15]我们首先简要概述Nrf2法规。

2.Nrf2：细胞防御的主调节器

转录因子Nrf2（由NFE2L2基因编码于人类）是抗氧化防御的主要调节器，调节200多个细胞保护基因以应对氧化应激[16].Nrf2是基本亮氨酸拉链（bZIP）转录因子家族的成员，在非应激条件下，通过与胞浆中的同二聚体蛋白Kelch样红细胞衍生蛋白与CNC同源相关蛋白1（Keap1）结合而被抑制[17]Nrf2和Keap1之间的相互作用在物种间高度保守，表明其重要的调节作用[18]在这种状态下，Keap1通过促进泛素化和26 s蛋白酶体随后对Nrf2的降解，充当Cul3/Rbx1介导的Nrf2降解的适配器。Keap1/Cul3/Rbx1也作为一种额外的负调控因子存在于细胞核中[19].

为了响应氧化或亲电刺激，半胱氨酸残基以独特的形式被修饰，由此，结构不同的诱导物与Keap1上不同的半胱氨酸残基组合反应，产生相同的生物反应——特别是从Nrf2上解下并激活Nrf2-抗氧化反应元件（ARE）反应，或通过稳定Keap1-Nrf2复合物减缓蛋白酶体的降解[20],[21],[22],[23]一旦从Keap1中分离出来，Nrf2就会转移到细胞核中，在那里它能够与小MAF蛋白异源二聚并与顺式作用ARE结合，从而有效激活II期解毒酶的转录（参见图1).

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图1

Nrf2信令。Nrf2由运动诱导的活性氧或植物营养素Nrf2激活剂激活。抗氧化剂补充抑制运动诱导的ROS信号传导，从而抑制下游Nrf2信号传导。

就治疗潜力而言，由于多种化合物和刺激物作为相互独立的Nrf2诱导剂发挥作用，这种半胱氨酸编码引起了极大的兴趣[24],[25],[26]例如，运动诱导的Nrf2的ROS激活可能通过这些半胱氨酸残基的氧化而发生。类似地，某些植物营养素已被证明可以激活Nrf2，并且这一过程可能通过不同于运动靶向半胱氨酸残基的半胱氨酸残基修饰而发生。如果事实如此，运动训练和Nrf2激活化合物之间可能存在协同效应。有一些最近的数据支持这一点，这些数据在本综述的第6节中给出[27],[28]。对于那些对Nrf2激活机制的更详细背景感兴趣的人，我们建议读者参考这一领域的最新优秀综述[16].

值得注意的是，在某些情况下，如癌症，Nrf2激活和信号传递可能会产生有害影响。在正常条件下，Nrf2信号可以保护癌症，正如十字花科蔬菜中刺激Nrf2活化的植物营养素的作用一样[29],[30],[31]然而，在癌细胞中，Nrf2的激活可能赋予细胞抗应激能力，从而使细胞不易接受化疗[32],[33]Nrf2在癌症肿瘤中表达上调，化疗期间使用Nrf2抑制剂可能有必要提高治疗效果[16],[34].

3.Nrf2信号转导对急性运动的反应

使用C2C12骨骼肌细胞进行的细胞培养研究提供了证据，证明Nrf2由ROS激活，当抗氧化剂（如N-乙酰半胱氨酸）应用于培养基时，这种激活被抑制[35],[36]Horie等人。[35]使用电脉冲刺激（EPS）模拟急性运动，并证明Nrf2表达与刺激强度和持续时间相关。此外，EPS刺激了Nrf2相关抗氧化基因的表达，当使用siRNA转染敲除细胞中的Nrf2时，反应减弱[35]其他研究表明，用H处理肌管或大鼠心肌细胞后，Nrf2蛋白表达增加₂O（运行）₂ [36],[37].

将这些体外结果转化为体内结果主要是在动物模型中进行的，最近在人类中进行了一项研究。这些研究列于表1值得注意的是，一些早期的研究在其免疫印迹中针对Nrf2（57 kDa）的非特异性带。尽管Nrf2的预测分子量为57 kDa，但几个小组已经将90–110 kDa的条带确定为生物相关的Nrf2靶标[38],[39].

在野生型小鼠中进行一次急性运动可以增加Nrf2基因的表达[36],[40]以及骨骼肌中Nrf2蛋白的丰度[40]和Nrf2依赖的II期酶[36],[41]另外两项研究测量了运动对小鼠心肌中Nrf2信号传导的影响，这两项研究与骨骼肌的数据基本一致[42],[43]然而，这些研究使用了“急性运动应激”，即连续两天进行60分钟的平板运动。虽然时间显然不够长，无法归类为运动训练，但众所周知，连续运动会导致mRNA表达的累积反应，并且可能有必要观察蛋白质丰度的可测量变化[44]然而，Muthusamy等人。[42]对Nrf2信号转导对运动的反应进行了最全面的分析，并对年轻野生型（WT）和Nrf2进行了比较^–/–老鼠。尽管两组的ROS都有相似的增加，但运动组的WT小鼠心肌中的核蓄积和Nrf2-ARE结合显著增加，而Nrf2的活性没有变化^–/–老鼠。WT中几乎所有测定的II期酶的基因表达都显著增加；唯一的例外是血红素氧化酶-1（HO-1）。第二阶段抗氧化剂的蛋白质表达变化不太一致，仅在HO-1、谷氨酸-半胱氨酸配体修饰物（GCLM）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）中观察到变化。

关于人类运动诱导的Nrf2信号的数据仍然非常有限，但最近的一项研究首次表明，急性运动增加了青年和老年男性外周血单个核细胞（PBMC）中全细胞水平的Nrf 2蛋白丰度[45]此外，仅在年轻组中观察到Nrf2的核蓄积，这表明衰老与Nrf2核输入受损有关（参见图2). 毫不奇怪，运动刺激了年轻男性而非老年男性HO-1和NAD（P）H醌脱氢酶1（NQO1）基因表达的增加[45]小鼠心肌细胞溶质和核Nrf2以及Nrf2/ARE结合能力的年龄相关性降低[43]和大鼠肝脏[46]伴随着Nrf2依赖性抗氧化剂基因表达对急性运动的反应减弱[43].

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图2

运动在全细胞水平上诱导Nrf2增加，但老年人的核积累减弱。Nrf2在PBMC的整个细胞[A]和核分数[B]中对运动的反应。数值为平均值±SEM。相应图表上方提供了年轻人（Y）和老年人（O）的Nrf2变化和负荷控制的代表性斑点。时间对全细胞Nrf2的折叠变化有显著的主效应(P（P）=0.003). 核聚积只在年轻人中显著增加，而在老年人中没有显著增加（年龄、，P（P）=0.031). 转载自[45]得到爱思唯尔的许可。

另外两项人体研究虽然没有直接研究Nrf2信号传导，但具有相关性，因为它们包括了对急性运动反应的Nrf2 mRNA的测量。在正常氧恢复条件下持续90分钟的急性自行车运动后，Nrf2和靶SOD2的基因表达在年轻健康男性的骨骼肌中显著增加[47]有趣的是，当在缺氧条件下进行恢复时，没有看到这些反应[47]同样，在经常锻炼的中年女性中，适度跑步机锻炼30分钟后2小时，Nrf2 mRNA显著增加；然而，久坐的女性在运动后的Nrf2或靶基因表达没有变化[48]这表明，随着年龄的增长，健康可能在维持急性Nrf2反应中发挥作用。

与细胞培养研究类似，一些动物研究表明，Nrf2信号的增加取决于运动的持续时间。持续不到1小时的跑步机运动未引起Nrf2 mRNA或蛋白表达的变化[40],[49],[50]随着持续时间增加到90分钟或更长，Nrf2激活在骨骼肌组织和脑匀浆中都变得明显，骨骼肌中Nrf2蛋白表达显著增加，两种组织中的基因表达都增加[40],[49]在耐力训练的一个极端例子中，李和同事[50]在跑步机上跑1h的小鼠中，Nrf2活性没有差异，但在跑步仪上跑6h后，Nrf2-核累积和Nrf2-ARE结合显著增加。此外，与非手术对照组和1-h组相比，一些II期酶的基因表达显著增加[50]与这些结果相反，其他研究报告了跑步机跑1h后Nrf2蛋白丰度增加[36]中等强度骑行30分钟[45]这些研究之间观察到的差异可能是由于方案强度的差异（总结如下表1).

现有研究均未研究运动强度对Nrf2信号反应的影响。然而，Wang等人。[40]发现运动诱导的线粒体H₂O（运行）₂含量、Nrf2基因表达和Nrf2蛋白表达（根据不同持续时间的运动反应进行测量）。然而，在高强度导致更大氧化应激的假设下；这些数据以及肌管电脉冲刺激的结果表明，强度可能影响Nrf2信号。运动的刺激作用可能存在上限（无论是通过持续时间还是强度），因为跑到筋疲力尽的大鼠的Nrf2蛋白或II期酶蛋白水平或包括谷胱甘肽还原酶（GR）、NQO1和谷胱甘苷-S-转移酶（GST）在内的酶活性没有增加，除非他们之前接受过莱菔硫烷（一种有效的Nrf2激活剂）治疗[51].

需要考虑的另一种机制来自Xue等人最近的工作。[52]他证明，在刺激II期抗氧化表达方面，Nrf2的积累可能不如Nrf2进出核的频率重要。在他们的模型中，Nrf2循环的速率和幅度决定了下游信号的强度，虽然很难翻译这些体外数据，但这个概念很有趣。运动模式、强度和持续时间都会影响体内Nrf2循环的速率和幅度。例如，即使持续时间只有30秒，最大强度的运动也会导致氧化还原平衡的系统性变化；随着强度和持续时间的增加，氧化还原平衡的变化幅度也会增加[40],[50],[53]因此，与传统的有氧运动相比，通过高强度间歇训练传递氧化还原平衡的重复变化可能会对Nrf2的输入/输出频率产生不同的影响。确定Nrf2激活的最佳“剂量”或运动量为未来研究提供了很大的机会。

4.Nrf2信号对定期运动的响应

与急性运动相比，定期运动训练对Nrf2反应的影响得到了更广泛的研究。这些研究的比较概述于表2无论持续时间（4–24周）或训练方案（传统的中等强度或高强度间歇训练）如何，啮齿类动物模型中的定期有氧运动始终被证明可以激活多个组织（包括骨骼肌、肾脏、大脑、肝脏、睾丸、前列腺和心肌）的Nrf2信号[27],[42],[43],[54],[55],[56],[57],[58],[59],[60],[61],[62],[63].

综上所述，来自这些动物研究的数据表明，定期运动可以提高Nrf2蛋白的丰度和II期酶的数量和/或酶的活性。迄今为止，还没有对人类Nrf2信号进行运动干预研究。然而，一项对久坐和活动的老年人单个肌肉活检中的Nrf2和Keap1蛋白质含量进行比较的横断面研究表明，运动的个体Nrf2蛋白质含量显著较高，Nrf2-Keap1比率也较高[64]这表明定期运动可能减弱Nrf2信号的年龄相关变化。问题仍然是运动干预能否恢复Nrf2信号受损个体的氧化还原平衡。来自老年动物的运动干预数据支持在老年人中恢复Nrf2信号的潜力[43]另一个有趣的问题是它是否重要什么时候一个人在一生中开始锻炼。最近的两项研究虽然没有测量Nrf2信号，但表明老年人的终身训练与骨骼肌氧化还原平衡的年龄相关性变化的代偿适应有关[65],[66]Zhao等人更直接地调查了这个问题。[62]在加速衰老的小鼠模型（SAMP8）中。他们有三组动物接受游泳锻炼，要么终身进行，要么从生命早期开始，要么从生命晚期开始。这些组还与非手术对照组进行了比较。总的来说，晚锻炼组仍然比久坐组有一些好处，这支持了一句古老的格言，即开始锻炼永远不会太迟。然而，终身组和早期组比晚期组显示出更大的益处，这表明早期开始可以更好地防止运动诱导信号中与年龄相关的缺陷。重要的是，有规律的锻炼已经被证明可以提高对随后的侮辱的恢复力。例如，接受跑步机训练或久坐不动的大鼠接受脑内注射药物，破坏多巴胺受体，以模拟帕金森病[67]运动训练可保护大鼠免受神经退化、氧化应激和Nrf2降低对药物的反应。此外，当Nrf2被阻断时，运动的保护作用并不明显，支持Nrf2在运动介导的神经保护中的作用[67].

据我们所知，迄今为止还没有任何研究对Nrf2信号转导对传统阻力训练的反应进行过调查。Gomes等人。[68]在Sprague-Dawley大鼠身上使用带负重背心的跳跃方案作为阻力训练的一种形式。在幼年动物中未观察到Nrf2表达的变化，而接受相同训练方案的老年动物中Nrf2的表达下降[68]老年动物中Nrf2表达的基线水平显著高于年轻动物，这可能部分解释了运动训练后观察到的Nrf2减少。年龄较大的动物可能上调Nrf2以对抗日益加剧的促氧化环境。运动训练可以改善Nrf2诱导的反应，从而降低基线值。可能需要测量运动干预前后对急性运动的反应，以阐明这些观察到的Nrf2表达差异。在卧床休息的人身上观察到了类似的情况，无论是否伴随着阻力训练[69]卧床休息对照（无运动）显示骨骼肌中Nrf2mRNA水平升高；然而，与睡前休息水平相比，卧床休息加阻力训练未引起Nrf2表达的变化，表明通过阻力训练维持氧化还原平衡。这两项研究都没有关注Nrf2信号本身，只包括Nrf2基因表达变化的测量。需要进一步研究来阐明阻力训练是否能诱导Nrf2信号传导。

5.补充抗氧化剂对Nrf2信号传导的影响

虽然证据明确支持运动是通过激活Nrf2诱导内源性抗氧化防御的一种可行方法，但人们始终对是否可以通过外源性补充或药物实现这一点感兴趣。鉴于氧化应激在衰老中的作用这一前提，外源性抗氧化剂补充应减缓衰老，或至少通过在接触细胞成分之前减少自由基和促进更平衡的细胞氧化还原环境，减缓由活性氧引起的细胞损伤和年龄相关病理的速率。这一假设导致了大量研究，旨在探讨外源性补充剂与成功衰老和/或延长寿命之间的关系。事实上，Pubmed对“抗氧化剂和老化”的搜索产生了13000多个回报。尽管有大量的文献报道，但关于抗氧化剂补充的任何益处尚未达成共识。许多研究表明没有影响，一些研究甚至显示抗氧化剂补充剂的负面影响[70]目前，美国超过40%的成年人摄入的维生素补充剂至少相当于每天摄入的多种维生素，仅在美国每年就创造320亿美元的产业收入[71]研究中最常见的两种维生素是维生素C和E。

维生素C（抗坏血酸/抗坏血酸钠）是一种有效的亲水性抗氧化剂，能够直接中和活性氧，尽管速率很慢[72]维生素E（α-生育酚）是细胞膜中主要的疏水性抗氧化剂，也是体内脂质过氧化的有力抑制剂。由于其疏水性，它被储存在细胞膜中，在那里它清除过氧自由基的速度比它们与膜本身反应的速度快得多。此外，α-生育酚可以直接清除线粒体膜上的活性氧。鉴于维生素E的抗氧化特性，它通过抑制循环脂蛋白的氧化修饰而具有防止动脉粥样硬化的潜力[73]根据这些反应，维生素C和E应能提高细胞存活率，然而，最近的荟萃分析表明，补充抗氧化维生素没有效果，甚至可能增加发病风险[70]运动和抗氧化维生素补充之间的相互作用使情况更加复杂[74],[75]外源性抗氧化剂可以通过在细胞信号传导开始之前减少ROS来减弱信号传导（参见图1).

因此，ROS的许多有益作用被破坏，这与通过Nrf2介导的内源性抗氧化防御对ROS的控制性减少形成了直接对比。在一项双盲、安慰剂对照的维生素C和E补充研究中，Morrison等人。[76]根据F测定，明显证明补充维生素A对减少氧化应激没有益处₂-异前列腺素对急性运动挑战的反应。此外，在对补充营养的成年人进行为期4周的运动干预后，他们发现SOD1和SOD2蛋白表达减弱，而安慰剂组显示这些蛋白显著增加。在功能水平上也显示了对运动同时补充的不适应反应，补充减少了疲劳测试、血压控制和葡萄糖耐量的时间改善[74],[75]在肌肉水平上，抗氧化剂补充抑制了线粒体对耐力训练适应的几个标记；虽然目前尚不清楚补充剂是否会影响人类的耐力运动表现[77].

6.运动和植物营养素Nrf2激活剂有协同作用吗？

对植物营养素或植物化学物质对Nrf2信号传导的影响的深入讨论超出了本综述的范围（请参阅以下参考文献进行综述：[78],[79]). 相反，我们将关注最近的工作，该工作证明了运动与已知的Nrf2活化剂相结合的潜在协同效应，以进一步改善氧化还原平衡。Pala等人。[28]在雄性Wistar大鼠中证明了辅酶Q10（CoQ10）补充和运动训练之间的协同作用。与久坐对照组相比，运动和辅酶Q10的补充相互独立，显著增加了心脏、肝脏和骨骼肌中Nrf2的表达。在所有组织中，补充和运动对Nrf2表达的联合影响显著更大，诱导型HO-1的表达模式相似。Sprague-Dawley大鼠补充已知的Nrf2激活剂，冬虫夏草 [80],在15天的游泳项目中，Nrf2蛋白表达和II期酶表达的增加水平显著高于单独运动时的水平[27]这一领域值得进一步研究。图3显示了改编自早期研究的数据，这些数据表明，运动的效果是如何通过同时补充抗氧化剂而受到抑制，并通过同时使用植物营养素Nrf2激活剂而得到增强的。

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图3

补充抗氧化剂维生素的运动训练抑制了训练适应性，而Nrf2激活剂增强了训练效果。与久坐对照组小鼠相比，补充维生素C训练的啮齿动物未能改善其疲劳时间[A]。相比之下，在训练期间补充Nrf2激活化合物的大鼠在疲劳时间测试中的表现明显好于两个久坐对照组和非补充运动组显示潜在的协同效应[B]。数据改编自Gomez-Cabrera等人。[77]和Kumar等人。[27].

激活Nrf2和II期反应的另一种可能机制是通过热量限制[81],[82],[83]据我们所知，关于限制热量摄入和运动联合对Nrf2和下游信号传导的影响，尚未发表任何随机对照研究。

7.结论和未来方向

总之，数据令人信服，运动通过Nrf2信号的氧化还原激活发挥了许多益处。Nrf2在包括大脑、肾脏和睾丸在内的各种组织中激活的证据可能是运动如何产生众所周知的全身效应的重要机制，而这些效应不仅限于骨骼肌和心肌。此外，还有一些新的数据表明，这些结果实际上已经转化为人类的结果。显然还需要进行更多的研究，尤其是对人类运动干预研究的随机对照试验。动物研究和人类研究几乎都只限于男性受试者。研究结果需要扩展到女性，并且需要阐明可能的性别差异。

Nrf2基因敲除小鼠的使用对于提高我们对这种转录因子在健康和疾病中的重要作用的理解具有极其重要的价值。编号2^−/−表现出与衰老小鼠非常相似的表型，表明Nrf2-Keap1信号传导的中断是生物衰老的一个因素[84]使Nrf2成为一个有前途的靶点，特别是在预防与年龄相关的疾病的过程中治疗生物衰老。

动物研究的一个警告是，通常只有两个时间点可用（急性运动前/后或运动前/后干预）。许多Nrf2调节的基因和蛋白质可能具有不同的反应时间过程，因此可能需要多个时间点来捕捉整体变化。这些需要在未来的研究中进一步澄清。

利益冲突

作者声明，本论文的出版不存在利益冲突。

这项研究没有从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何具体资助。

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