临床开发中的巨细胞病毒疫苗

摘要

介绍

本文介绍了抗巨细胞病毒感染的候选疫苗，重点介绍了最近和当前的临床试验。虽然从财政和公共卫生的角度来看，巨细胞病毒疫苗的最大影响是预防致残性先天感染，但仍有许多挑战使证明这种适应症的疗效成为一个艰巨的目标。因此，第一个批准的CMV疫苗（预计将在不久的将来）很可能最终获得许可，用于预防或改善SOT或HSCT患者的疾病。疫苗对这一人群诱导的保护性免疫的相关因素是否与预防先天性感染的问题相关，这是一个目前尚未解决的挑衅性问题，但随着临床上各种疫苗平台的试验进展，这需要仔细审查。

巨细胞病毒感染流行病学与接种目标人群

在1971年Weller发表的一篇里程碑式的评论中，CMV被描述为“具有多变临床表现的无所不在的病原体”[1,2]虽然大多数原发性感染在其他健康成人中是无症状的，但巨细胞病毒感染可在免疫功能正常和免疫功能受损的个体中引起各种临床综合征。除了EB病毒外，巨细胞病毒也被认为是年轻人单核细胞增多症的病因[3]CMV是SOT和HSCT患者发病率和死亡率的一个特别重要的原因，它会导致病毒血症和伴随的终末器官疾病，如肝炎和肺炎[4–6]除这些直接影响外，CMV还与移植患者的严重间接影响相关，如移植排斥、移植失败，以及HSCT患者的移植物抗宿主病[7,8]抗病毒治疗虽然在这些人群中对CMV疾病的治疗非常宝贵，但也有局限性，包括药物毒性和耐药性的出现。因此，在移植前向SOT或HSCT受体接种巨细胞病毒疫苗可能被证明在改善移植结果方面具有巨大价值。CMV也会在晚期HIV感染患者中产生严重的发病率，包括视力威胁性视网膜炎[9]尽管巨细胞病毒疫苗如何在HIV感染人群中预防疾病方面发挥作用尚不直观。

除了疫苗改善免疫受损患者CMV结果的前景外，还可以就所有人在一生中进行普遍免疫的益处进行论证。这一理论的基础来自新出现的大量证据，这些证据表明CMV可能在炎症和自身免疫性疾病以及恶性肿瘤，特别是多形性胶质母细胞瘤的发病机制中发挥作用[10]CMV血清状态也可能影响烧伤、创伤和败血症的临床进程[11–13]此外，在一些研究中，巨细胞病毒血清阳性与流感疫苗接种反应的降低有关，这表明对巨细胞病毒的保护可以提供与改进反应疫苗相关的次要益处，可以推断（但未经证实）降低获得流感的风险[14–16]这种现象可能只发生在老年人身上，因为一项对CMV血清阳性青年人的研究表明，与血清阴性个体相比，对流感疫苗的抗体反应增强，CD8+T细胞敏感性增加，干扰素-γ水平升高[17]CMV被认为是包括动脉粥样硬化性冠状动脉疾病在内的血管疾病发病机制中的协同因素[18-20]最后，CMV血清阳性状态已成为美国和欧洲大规模人群中全因死亡率的风险因素[21,22]考虑到CMV在非洲裔美国人中的总体血清流行率高于美国的白人[23]CMV血清阳性是这两组人群全因死亡率中所观察到的社会经济差异的一个促成因素[24].

从公共卫生和财政成本的角度来看，预防巨细胞病毒的先天性传播是研制巨细胞病毒疫苗的最大推动力。美国和其他发达国家0.5%至0.7%的孕妇将巨细胞病毒传播给胎儿[25]。发展中国家的估计不太准确，尽管最近的证据表明传输率甚至更高——在4%或更高的范围内[26]约13.5%的先天性感染新生儿有症状[27]在发达国家，先天性巨细胞病毒（CMV）是脑损伤和感音神经性听力损失最常见的感染原因，也是偶尔导致死亡的原因[28]在母亲接触巨细胞病毒的情况下，由妊娠期急性感染血清阴性孕妇所生的婴儿感染的风险特别高，在这种情况下，高达32%的原发性母亲感染导致先天性巨细胞病毒传播[25,29]一些证据表明，怀孕前接种疫苗可以降低先天性感染及其后遗症的风险。至少有两项研究比较了CMV从血清阴性和血清阳性妇女传播给胎儿的情况，试图量化孕前自然免疫的保护作用。在一项研究中，可归因于血清阳性状态的保护率为60%，在另一项中为91%[30,31]除了防止传播给胎儿外，如果发生传播，孕前免疫还能降低疾病的严重程度。据报道，怀孕期间原发性巨细胞病毒感染妇女所生的先天性感染婴儿中，有25%至少有一个后遗症，而复发性感染母亲所生婴儿中只有8%有后遗症[32]早期妊娠期母体CMV感染的母亲所生婴儿出现不良长期神经发育结局的风险似乎最高。在这种情况下，大约20-25%的先天性感染婴儿会出现感音神经性听力损失，高达35%的婴儿会出现涉及中枢神经系统的其他后遗症[33]因此，如果对CMV血清阴性的女性接种CMV疫苗，能够重现自然免疫的保护性特征的CMV疫苗可以降低先天性CMV感染的发病率和严重程度。

与有症状的先天性巨细胞病毒感染相关的医疗保健系统的长期成本是巨大的。鉴于这些感染通常伴随着广泛的残疾，这并不奇怪。并发症包括感音神经性耳聋、脑瘫、精神发育迟滞、发育迟缓、学习障碍和癫痫发作障碍[34]受影响最严重的儿童可能需要长期的寄宿照顾。20世纪90年代，医学研究所（IOM）对先天性巨细胞病毒的经济影响进行了评估。据估计，美国先天性感染儿童的医疗和教育费用每年约为19亿美元[35–37]因此，国际移民组织将巨细胞病毒疫苗的开发列为从成本节约的角度来看任何潜在新疫苗中最优先考虑的项目。国际移民组织模式提出了一种疫苗，该疫苗将普遍用于12岁的男孩和女孩，目的是在进入生育年龄之前授予保护性免疫力。随后的工作表明，这种青少年疫苗只需在~60%的范围内产生一定的效果，就能为社会节约成本[38].

使先天性巨细胞病毒感染疫苗接种策略分析复杂化的一个主要且尚未解决的问题是，怀孕前免疫妇女所生婴儿的“感染悖论”[39]尽管具有先入为主免疫的女性先天性巨细胞病毒传播的风险低于妊娠期原发性感染的女性，但总的来说，多达四分之三的先天性巨细胞病毒感染发生在非原发性母体感染之后，因为大多数人群中育龄妇女的巨细胞病毒血清免疫背景率很高[29]这些感染是否代表潜伏感染的重新激活，或新CMV株的再次感染，目前尚不完全明确：有证据支持这两种机制[40–42]无论再感染的机制如何，先天性感染都可能导致严重的长期残疾，包括感音神经性听力损失。因此，为了最有效地预防先天性巨细胞病毒感染，需要一种疫苗，这种疫苗不仅能够保护血清阴性的女性免受原发感染，而且能够增强血清阳性个体的免疫反应，以防止再次激活或再次感染。

巨细胞病毒疫苗目前正在临床试验中

表中总结了最近完成或目前正在进行的候选巨细胞病毒疫苗临床试验​表1。1包括基于免疫显性包膜糖蛋白CMV糖蛋白B（gB）的佐剂重组蛋白疫苗；使用DNA质粒或基于肽的技术表达免疫原性病毒基因产物（包括gB和T细胞靶点ppUL83[pp65]和/或主要即刻早期蛋白1[IE1]）的疫苗；基于gB和其他CMV抗原表达的载体疫苗方法，使用活病毒和类病毒颗粒（VLP）系统；以及复制受损或复制缺陷型巨细胞病毒（减毒疫苗或失效的单周期[DISC]疫苗）。这些单独的类别总结如下。

重组gB疫苗

在迄今为止进行的CMV疫苗临床试验中，使用gB佐剂重组制剂的亚单位方法可以说是进展最快的。这些试验的目的是观察到CMV血清阳性个体中始终存在gB抗体，并且能够中和病毒[43,44]已经完成了使用微流佐剂59（MF59）中的重组CMV gB的几项I期和II期临床试验，MF59是诺华公司的专有水包油乳液，首次用于流感疫苗，[45–50]大多数研究都采用了三剂系列疫苗。gB结构基于CMV Towne株的序列，经过修饰，跨膜结构域和furin裂解位点被去除。跨膜结构域下游的羧基末端细胞质成分被重新设计为与截断的gB-ORF的框架内融合[51]因此，疫苗被表达为一种截短的分泌多肽，通过色谱法从中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的组织培养上清液中纯化蛋白质。

在产后妇女的第二阶段研究中对gB/MF59疫苗进行了评估。这项研究发现，与接受安慰剂的同一队列妇女相比，在出生后1年内接种血清阴性的妇女中，gB/MF59疫苗对原发性巨细胞病毒感染的有效性为50%[47]在一项平行研究中，对参加本研究但被发现对CMV具有免疫力的女性也接种了gB/MF59疫苗或安慰剂，旨在评估疫苗接种是否能增强血清阳性女性的抗体反应[48]使用ELISA数据和中和抗体滴度，与对照组相比，接种血清阳性的女性的gB特异性反应增强，并且在最终疫苗剂量后6个月，血清阳性疫苗接种者的抗体滴度仍然高于接种系列的第0天。在大多数时间点，包括最终接种后6个月，疫苗接种者的CD4+T细胞对gB的反应和产生IFN-γ的T细胞水平都较高。由于大多数先天性巨细胞病毒感染发生在对该病毒的前概念免疫环境中，如果所观察到的抗体和细胞介导的免疫反应的增强与胎儿保护的改善相关，那么这些数据可能对预防先天性感染的疫苗如何应用于临床实践具有重要意义。

另一项针对年轻女性的临床试验最近在CMV血清阴性的健康青少年中报告。与安慰剂组相比，疫苗组在三次接种后CMV感染的发生率降低，尽管这一差异并不显著(P（P）=0.2)[49].通过尿液和血液样本的PCR检测CMV病毒血症，如果检测到病毒血症，则将受试者纳入亚组研究(http://www.clinicaltrials.govNCT00815165）。该亚组研究保留了盲法，正在更详细地检查CMV特异性细胞介导的反应。该子研究的数据仍在分析中，目前尚不可用。

为了实现在移植环境中测试gB/MF59疫苗的目标，一项第二阶段双盲研究(http://www.clinicaltrials.govNCT00299260）检测了肾或肝移植患者的免疫原性和CMV疾病，并通过病毒血症（DNAemia）进行评估[50]接受gB/MF59和血清阳性器官捐赠者的血清阴性器官受者与接受安慰剂的受者相比，病毒血症和更昔洛韦治疗天数减少。此外，移植后病毒血症的持续时间与gB抗体反应的程度呈负相关。研究作者假设，gB/MF59疫苗接种的免疫反应阻断了捐赠器官向新宿主传播CMV的能力。该机制尚未明确，但推测与疫苗增强抗体依赖性细胞毒性有关[50].

另一种gB亚单位疫苗，命名为GSK1492903A，是一种在葛兰素史克（GSK）实验室开发的专有系统中佐剂的重组gB疫苗(http://www.clinicaltrials.govNCT00435396）。用于制造该疫苗的gB亚单位序列基于AD169 CMV株。与赛诺菲gB构建物一样，furin裂解位点和跨膜结构域被删除，胞外结构域的末端序列融合到细胞质尾部。此外，将单纯疱疹病毒1型（HSV-1）糖蛋白D（gD）的羧基末端394个氨基酸融合到AD169衍生的gB序列以促进分泌[52]在一期研究中，任何疫苗均未发现严重不良反应。虽然这些结果尚未公布，但数据是公开的(www.gsk-clinicalstudyregister.com/study/108890#rs、和www.gsk-clinicalstudyregister.com/study/115429#rs).

巨细胞病毒DNA疫苗

ASP0113（以前称为VCL-CB01和TransVax）是一种抗巨细胞病毒的DNA疫苗，由Vical Corporation开发，目前已获得Astellas的三期临床试验和商业化许可。ASP0113是一种二价CMV DNA疫苗，由两个质粒VCL-6368和VCL-6365组成，用泊洛沙姆CRL1005和阳离子表面活性剂苯扎氯铵在PBS中配制[53,54].VCL-6368编码来自AD169的pp65蛋白，其假定的蛋白激酶结构域通过缺失氨基酸435-438而被移除。VCL-6365编码源自AD169序列的CMV gB的胞外结构域（氨基酸1-713）。用CRL1005和苯扎氯铵配制两种质粒可产生热力学稳定的自组装纳米粒子系统，具有规定的粒径、表面电荷和稳定性剖面。一项评估ASP0113安全性的I期临床试验发现，在22名CMV血清阳性和22名血清阴性免疫者中没有发生严重不良事件[54]最常见的并发症包括注射部位的疼痛和压痛、硬结、红斑、不适和肌痛。血清阴性受试者接种疫苗后，会引起pp65和/或gB特异性T细胞反应以及gB抗体反应，而血清阳性受试者只会增加pp65特异性T淋巴细胞反应。

在HSCT血清学阳性患者的双盲、安慰剂对照、平行组II期试验中，对ASP0113的疗效进行了后续评估(http://www.clinicaltrials.govNCT00285259）[55]与疫苗和安慰剂相比，不良事件没有显著差异，接种ASP0113后CMV病毒血症（DNAemia）显著降低。接种疫苗组和安慰剂治疗组之间开始抗病毒治疗的比率也没有显著降低（47.5%与61.8%). 最近启动了一项全球III期临床试验，以继续评估ASP0113对HSCT患者的疗效(http://www.clinicaltrials.govNCT01877655）。评估这种DNA疫苗在实体器官移植患者中的安全性和有效性的类似研究（II期，http://www.clinicaltrials.govNCT01974206）和透析患者（第一阶段，http://www.clinicaltrials.govNCT02103426）正在进行中。

一种非佐剂三价DNA疫苗（VCL-CT02），除了gB和pp65编码序列外，还包括T细胞靶点IE1，也已在第一阶段临床试验中进行了评估(http://www.clinicaltrials.govNCT00370006和NCT00373412）[56]这些研究是在CMV血清阴性受试者中进行的，这些受试者在肌肉内或皮内接种DNA疫苗，然后接种Towne疫苗（如下所述），以检查DNA疫苗的免疫启动。Vical建议进一步开发三价DNA疫苗，作为先天性巨细胞病毒感染免疫的平台，但该疫苗目前在临床开发中的状态尚不确定。Vical最近还发表了对gB和pp65质粒与不同佐剂系统（阳离子脂质佐剂Vaxfectin）联合交付的临床前评估结果，已观察到该佐剂可以提高作为质粒DNA交付的抗原的免疫原性[57,58].

肽疫苗

初步试验表明，pp65特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应可以保护HSCT患者免受移植后CMV疾病的影响，这促使了以pp65表位作为肽疫苗的疫苗的开发[107]CTL表位HLA A*0201 pp65_495–503由于其在分析的病毒分离株中的序列变异有限，被鉴定为一种有前途的肽序列。HLA A*0201第65页_495–503融合到合成的pan-DR表位（PADRE）或天然破伤风（Tet）序列，这两种序列都是已知的通用T辅助表位。在第一阶段试验中评估这些系统(http://clinicaltrials.govNCT00722839），健康参与者接种递增剂量的PADRE或Tet pp65_495–503含或不含CpG 7909佐剂的疫苗。CpG 7909，也称为PF03512676，是一种免疫调节合成寡核苷酸，设计用于TLR9拮抗剂[59,60]它通过B细胞和浆细胞样树突状细胞中的TLR9受体来刺激多种宿主免疫反应。这些包括人类B细胞增殖和抗原特异性抗体的产生，以及IFN-α的产生、IL-10的分泌和NK细胞的活性。这种佐剂与PADRE和Tet pp65的组合_495–503疫苗增加了对人体疫苗反应的刺激[60]据估计，HLA A*2010第65页_495–503根据HLA A*2010等位基因在人群中的频率，表位将覆盖30-40%的高危人群[60].

该疫苗结构也在接受HSCT的血清阳性患者中进行了研究，这些患者在移植后有CMV重新激活的风险(http://clinicaltrials.govNCT01588015；[61]). 这项开放标签的Ib期试验主要关注安全性。试验表明，HSCT无不良反应，无急性移植物抗宿主病，无抗dsDNA抗体产生，无意外不良反应。此外，疫苗接种者中报告了54例3-4级不良反应，而未接种疫苗且仅处于观察期的患者中报告了91例不良反应。有趣的是，尽管没有病毒学数据报告，而且该研究也没有用于检查CMV相关疾病的结果，但值得注意的是，与观察组相比，接种疫苗的患者的无复发总体生存率更好[61]基于这些令人鼓舞的初步数据，目前正在进行Tet-pp65疫苗的二期研究，命名为CMVpp65-A*0201或CMVPepVax(http://clinicaltrials.govNCT02396134），在希望城（加利福尼亚州杜阿尔特）和明尼苏达大学针对HLA-A*0201阳性、CMV血清阳性的HSCT患者进行入学。研究终点将包括CMV相关事件，如病毒血症、开始抗CMV抗病毒药物和CMV终末器官疾病，以及其他HSCT相关事件，例如无病死亡率、移植物抗宿主病和植入总时间。

包膜病毒样颗粒疫苗

包膜病毒样颗粒（eVLP）是模仿野生型病毒但没有病毒基因组的蛋白质结构，原则上创造了更安全的候选疫苗。由VBI实验室生产的eVLP CMV疫苗目前正在CMV血清阴性受试者中进行第一阶段研究。该技术基于将感兴趣的疫苗免疫原（在本例中为CMV gB）与人类胚胎肾（HEK）细胞中的Moloney鼠白血病病毒（MLV）gag蛋白联合转染。MLV gag的表达促进eVLP的发生：gag蛋白被细胞蛋白酶裂解，产生病毒基质、衣壳和核衣壳蛋白。衣壳蛋白自发组装成VLP，然后在从细胞中释放出来时获得脂质膜。gB的包涵体允许该蛋白在eVLP中表达，并具有来自HEK细胞翻译后处理的真实糖基化特征。在临床前研究中，在小鼠中检测了使用两种gB变体的eVLP：一种基于gB的VLP，其表达结构编码gB的细胞外部分、跨膜结构域（TM）和细胞质部分（906个氨基酸）；和gB-G，一个仅编码细胞外部分（氨基酸1-752）的gB截短序列，与水疱性口炎病毒（VSV）G蛋白的TM和细胞质域融合[62]发现两种疫苗在BALB/c小鼠中诱导的中和抗体滴度比用相同剂量的可溶性重组gB蛋白诱导的滴度高10倍，滴度水平与用免疫球蛋白（细胞免疫球蛋白）治疗观察到的滴度水平相当。然而，值得注意的是，gB-G VLP具有更强的免疫原性，这可能是因为gB-G在转染细胞中具有“融合后”构象。当在成纤维细胞和上皮细胞中评估疫苗诱导抗体的中和能力时，观察到中和水平提高。

该疫苗的一期研究VBI-1501A于2016年初启动，目前正在招募(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02826798). 本研究将在大约125名18至40岁的健康CMV血清阴性志愿者中，比较四种剂量的疫苗配方的安全性和免疫原性，范围从含磷酸铝（明矾）的0.5μg至2μg gB含量，不含明矾的1.0μg gC含量，以及安慰剂。VBI疫苗描述了另一种eVLP CMV候选疫苗，靶向gB和pp65。该疫苗由一个与pp65融合的Gag质粒和共转染的CMV gB质粒组成。该疫苗被提议作为治疗性疫苗，与GM-CSF联合使用，用于CMV相关的多形性胶质母细胞瘤[63]预计2016年将召开IND会议。

另一种针对巨细胞病毒的候选eVLP疫苗由Redvax GmbH开发，该公司是瑞士私人生物制药公司Redbiotec AG的子公司。与使用哺乳动物（HEK）细胞的VBI方法不同，该技术基于杆状病毒表达系统。尽管由于这些eVLP的尺寸相对较大，最初很难对其进行净化，但生产系统中引入了改进措施，以便于这些颗粒的澄清和浓缩[64]最近，辉瑞疫苗公司购买了Redvax技术，并承诺开发先天性巨细胞病毒疫苗项目。

载体疫苗

另一类已进入II期临床试验的巨细胞病毒疫苗是基于通过病毒载体表达病毒抗原的方法。通常，这种载体能够感染人类细胞并表达一种或多种病毒蛋白，而不会产生生产性感染。已经开发并测试了两种疫苗，它们利用减毒金丝雀痘载体传递gB（ALVAC-CMV[vCP139]）或pp65（ALVAC-CMV[vCP260]）[65,66]表达gB的ALVAC疫苗未能提高血清阳性受试者的中和滴度，与基线滴度水平相比，在血清阴性受试者中未诱导显著的中和滴量。因此，它是作为“先用后用”策略的一部分进行研究的，在该策略中，先用ALVAC疫苗启动，然后再注射后续剂量的Towne疫苗（如下所述）或gB/MF59亚单位疫苗[65,67].ALVAC-gB疫苗已做好准备，以改善对随后的Towne疫苗的反应。与用重组ALVAC-狂犬病糖蛋白对照免疫的对照组相比，用ALVAC-gB激发的受试者在Towne增强后更快地产生中和滴度和针对gB的ELISA抗体。相比之下，在随后对纯化的佐剂gB亚单位疫苗的反应中，使用ALVAC-gB启动没有益处。除ALVAC-gB疫苗外，表达pp65的ALVAC（vCP260）已进入第一阶段临床试验。结果表明，该疫苗具有良好的安全性，能够在CMV血清学阴性的健康成年人中诱导强大的pp65特异性CTL和抗体反应[66].HSCT患者的随访II期临床试验(http://www.clinicaltrials.govNCT00353977）于2008年完工。

一个基于α病毒的载体疫苗平台已经过临床试验评估。该疫苗最初由AlphaVax开发，命名为AVX601。它来自委内瑞拉马脑炎（VEE）病毒。在这种疫苗中，VEE结构蛋白被表达Towne gB胞外结构域和双启动子复制子中pp65-IE1融合蛋白的基因所取代[68,69]一期临床试验中血清阴性的志愿者在24周内接受了三次低剂量或高剂量的疫苗。该疫苗耐受性良好，给药后仅出现轻微的局部反应，参与者在接种后产生了CTL并中和了对所有三种CMV抗原的抗体反应[70]该平台于2008年被诺华公司收购，在购买诺华疫苗组合后，现由葛兰素史克持有。目前尚不清楚第二阶段研究的计划。

最近进入第一阶段研究的另一种载体疫苗方法利用减毒重组淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）平台[71]该载体利用组成性表达LCMV病毒糖蛋白（GP）的产生细胞，使用感兴趣的疫苗抗原替换编码LCMV糖蛋白的基因成为可能。这些rLCMV疫苗具有复制缺陷性，不仅能引起强大的CTL和CD4+T细胞反应，还可引起高度中和抗体反应。这些载体似乎也不会引发载体特异性抗体免疫，这将允许再次给药载体用于加强疫苗接种，这一特征对于保护女性生殖期可能是非常可取的。此外，LCMV在人类中的血清流行率很低，这是使用该平台的另一个有用属性。Hookipa Biotech AG开发了一种复制缺陷型LCMV介导CMV疫苗，命名为HB-101，这是一种双价疫苗，包含两种载体，一种表达CMV pp65蛋白，另一种表达gB。一项第一阶段剂量递增研究已开始招募连续三组18名健康志愿者；每个队列将接受低、中或高剂量的疫苗(n个=14名志愿者）或安慰剂(n个=4;https://clinicaltrials.gov网站NCT02798692），在0个月、1个月和4个月通过肌肉注射使用三剂系列疫苗。主要研究终点是安全性，次要终点包括ELISA和病毒中和滴度；针对gB和pp65的IFN-γELISPOT；细胞内细胞因子染色分析。

其他几种载体疫苗已在临床前研究中进行了探索。最近的研究调查了修饰痘苗病毒安卡拉（MVA）疫苗的免疫原性，该疫苗在啮齿动物或非人灵长类动物模型系统中表达多种CMV抗原，包括pp65、gB和蛋白质gH/gL/UL128/130/131的五聚体复合物（PC）[72–77]特别值得注意的是，最近的一项研究表明，当小鼠或猕猴接种表达PC全部五种蛋白成分的MVA载体时，会产生中和抗体反应，能够阻断霍夫鲍尔巨噬细胞（位于胎盘内的胎儿源性细胞）的CMV感染[78]这一结果可能与CMV疫苗特别相关，CMV疫苗旨在激发免疫反应，阻止病毒经胎盘传播至发育中的胎儿。

减毒和“DISC”疫苗

最早的研制抗巨细胞病毒感染疫苗的尝试是使用减毒活病毒。最初的研究集中于高度组织培养传代的CMV弱毒株AD169和Towne。对组织培养传代过程中这些菌株中积累的衰减突变的详细描述超出了本文的范围，但这是一些优秀评论的主题[79–81]特别令人感兴趣的是，这两株CMV在开放阅读框（ORF）中都有突变，破坏了PC的表达UL130型导致ORF中的移码突变，并且AD169菌株有一个单碱基对插入（a），类似地导致UL131型这些传代分离物PC成分的突变可能有助于其衰减，但也可能损害接种宿主的免疫原性，特别是在产生抗体反应的能力方面，抗体反应可以阻断上皮细胞和内皮细胞的感染性，而上皮细胞和血管内皮细胞是重要的感染靶点体内.

AD169是首个在人类身上研究的巨细胞病毒疫苗，将来自AD169感染细胞的裂解物皮下注射给英国伦敦圣乔治医院医学院的健康学生和工作人员志愿者，剂量从100到300000个血小板形成单位（pfu）不等[82]虽然10000 pfu组的转化率达到96%，但在接种疫苗8年后进行评估时，只有一半的志愿者检测到CMV抗体反应[83,84]–鉴于2009年报告的MF59/gB疫苗研究中提出的对免疫持续时间的类似担忧，这是一个有趣的观察结果[47].

健康、血清阴性成年人接种巨细胞病毒Towne株疫苗后的免疫反应已有充分记录[31,85]。与野生型感染相比，Towne疫苗接种对移植受者的严重CMV疾病也有一定的保护作用，尽管它不能预防移植后的CMV感染，并且通过ELISA测定产生的中和抗体反应有限[86]与野生型感染相比，Towne诱导保护性免疫的能力减弱是由于其衰减和中和抗体滴度较低[31].

为了寻找一种安全性符合Towne标准但没有病毒限制性衰减的疫苗，我们进行了努力，以产生含有高度衰减的Towne毒株和弱毒的临床CMV分离株Toledo成分的“嵌合”病毒[87]这些含有两种病毒不同基因组组合的Towne/Toledo嵌合病毒是通过重叠的cosmid文库的联合转染产生的。这些疫苗最初在CMV血清阳性受试者的一期试验中进行了评估[88]该方法旨在鉴定Towne/Toledo重组体，其相对Toledo减弱，但比Towne疫苗弱（因此更具免疫原性和保护性）。所有疫苗都含有托莱多衍生的基因组区域，称为ULb’区域，当CMV在成纤维细胞中连续传代时，快速发生缺失和突变的区域[79–81]在第一阶段研究中，对Towne/Toledo重组疫苗接种者的转氨酶水平和白细胞计数以及接种后CMV培养结果进行了比较，并与受试者实验感染Toledo株的病毒挑战性研究的历史对照进行了比较[88]这一并排分析表明，Towne/Toledo嵌合疫苗相对于其亲本Toledo毒株减弱。接下来，在一项剂量范围研究（10¹–10^三 pfu/剂量）的安全性和免疫原性(http://www.clinicaltrials.govNCT01195571）。没有受试者的尿液或唾液中有CMV。在这项研究中，36名CMV血清阴性男性中有11人进行了血清转换。用疫苗嵌合体2和4更常见地观察到血清转化。所有11名血清转化者都产生了低水平但可检测的中和抗体，一些受试者对IE1表现出CD8+T反应。所有嵌合体都含有一个被破坏的UL128标准从Toledo菌株衍生出的序列，因此，与Towne和AD169一样，被认为不能引发PC-特异性抗体反应[89]未来的工作应集中于在后续临床试验中评估嵌合体2和嵌合体4，并阐明这些嵌合体疫苗诱导不同免疫反应的分子基础。

鉴于人们对CMV减毒活疫苗安全性的担忧，产生转基因致残感染性单周期（DISC）疫苗株是一种有吸引力的替代品。这些病毒在特定的细胞类型或允许病毒复制的特定生长条件下繁殖[90-92].体内DISC病毒复制能力不足，并且表达病毒蛋白质组的有限子集（如果有的话）。其中一种病毒V160目前正在血清阴性和血清阳性受试者中进行一期临床试验，其中恢复了UL131型通过细菌人工染色体（BAC）重组实现[90]第1外显子的移码突变UL131型AD169的上皮向性缺陷在大肠杆菌通过删除7个核苷酸中的腺嘌呤A延伸UL131型挽救上皮细胞和内皮细胞的向性，从而允许五聚体gH复合物的正确加工和表达。通过删除BAC片段，进一步修改了该克隆Cre/lox公司重组。将修饰后的BAC DNA转染到人类视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞中，以回收感染性病毒。该病毒已被进一步修饰，使基本病毒蛋白IE1/IE2和UL51表达为带有FKBP12蛋白不稳定变体的单个融合蛋白。FKBP12是FK506家族中的一种雷帕霉素结合蛋白，或他克莫司结合蛋白，称为FKPB[91].UL51对病毒裂解-基因组包装至关重要，而IE1/IE2在急性感染和病毒潜伏期重新激活期间都是必要的[93,94].V160能够在合成稳定配体Shield-1存在下在视网膜色素上皮细胞中繁殖。如果没有这种配体，融合蛋白会迅速降解，病毒复制也会受到抑制[93]其他条件复制缺陷型CMV（rdCMV）/DISC疫苗株包含融合到CMV基本蛋白UL52、UL79和UL84的不同FKBP。这些融合蛋白调节病毒基因产物的转录、病毒DNA合成以及病毒基因组的加工和包装[95,96]。由于自然界中不存在Shield-1配体，原则上，V160 DISC病毒应无法恢复复制能力，从而确保该疫苗具有良好的安全性。

观点

近年来，制药业对研制巨细胞病毒疫苗的兴趣激增。这一进展令数十年来认识到这种未满足需求的临床医生感到欣慰[97]，并受到重组gB疫苗的成功（尽管不太理想）的推动[47]以及通过提高对先天性巨细胞病毒问题的全面认识和认识。

尽管取得了这些进展，但仍存在许多挑战。一个未满足的主要需求是缺乏对发育中胎儿保护性免疫相关性的了解。事实上，在更基本的层面上，我们需要明确CMV疫苗针对的是母体-胎盘-胎儿三联体的哪些成分（图​（图1）。1). 最近一篇综述的主题是先天性巨细胞病毒感染的免疫学保护相关性[98]CMV疫苗能否通过限制母体DNA血症，从而限制胎盘的血源性植入，从而预防胎儿感染而获得成功？在这种情况下，尽管最近一项CMV-Ig的胎盘对照试验可能令人惊讶地未能证明其对经胎盘传播的益处，但已经提出了中和抗体作为预防先天性传播的相关因素的作用[99]与安慰剂相比，CMV-Ig没有降低母体或胎盘病毒载量，也没有对病毒特异性T细胞反应产生影响[99]这些最新结果与2005年的一项非随机研究形成对比，该研究显示CMV-Ig显著降低了原发性母亲感染的母婴传播率和先天性疾病风险[100]抗体反应的性质，尤其是女性是否具有针对PC蛋白的高滴度抗体，可能成为传播的关键预测因素[101]这一观察结果将为疫苗设计提供大量信息。杜克大学Brenna Anderson领导的一项目前由NIH资助的被动抗体治疗临床试验将研究CMV-Ig在预防胎儿CMV感染中的作用，并可能解决这个问题(http://clinicaltrials.govNCT01376778）。在母亲免疫反应的背景下，其他保护相关物可能成为巨细胞病毒控制的关键效应器。这些包括母体CD4+T细胞，最近在恒河猴模型中被证明对预防先天性巨细胞病毒至关重要[102]并且似乎在防止女性传播方面发挥了作用[103,104]事实上，CD4+和/或CD8+反应延迟、T细胞功能下降（细胞因子生成减少或修饰、功能衰竭）以及CD45RA+效应记忆T细胞百分比下降，似乎都是增加先天性巨细胞病毒传播风险的重要因素[98,103,105–107].

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图1。

先天性巨细胞病毒感染疫苗潜在靶点示意图。对于疫苗是否主要需要针对母体、胎盘或胎儿隔室的问题，需要明确。新生儿即使面对高滴度中和抗体也会发生先天性感染，包括伴随的后遗症。再感染与随后传播的悖论[39]也需要解决。如果可以在母亲身上实现绝育免疫，胎盘和胎儿传播就成为无意义的问题。在疫苗中产生保护性免疫可能需要强有力的母体抗体和T细胞反应，尤其是CD4+反应

一旦巨细胞病毒（CMV）到达胎盘-胎儿界面，保护的免疫学相关因素可能与母体间室中的免疫相关因素不同。胎盘中相对缺乏T淋巴细胞[98]免疫的先天效应器，尤其是NK细胞，占主导地位。抗体可能在保护中仍然至关重要，但尚不清楚是否有针对PC的中和抗体[78]或针对gB的中和抗体[108]在滋养层水平上更为重要。非中性抗体可能反常地促进CMV在胎盘滋养层细胞表达的新生儿Fc受体上的易位，实际上促进先天性传播[109]在一项对患有和不患有神经后遗症婴儿经胎盘获得的抗体的研究中，发现患有后遗症的婴儿的抗-gB抗体和中和抗体水平较高，并且没有发现中和和听力损失之间的联系[110]在考虑将中和抗体作为保护的假定相关性的巨细胞病毒疫苗策略时，必须牢记这些观察结果。在防止胎儿传播方面，高亲和力抗体的存在可能比中和抗体更重要[111–113]需要在临床试验中超越现有疫苗的新策略。IgG的非中和功能，如抗体介导的细胞毒性，需要更深入地检查。通过分析疫苗学技术，对免疫个体的B细胞库进行检查，可以深入了解迄今为止尚未识别的新型亚单位候选疫苗[114]最后，需要考虑在获得先天性巨细胞病毒疫苗许可之前进行临床试验所需的研究终点。尽管最近的一份共识声明表明，预防先天性感染将是此类试验的合适终点[115]应该记住，大多数先天性巨细胞病毒感染不会产生后遗症或残疾。因此，在临床前“概念验证”模型和女性临床试验中，降低胎儿病毒载量可能是评估巨细胞病毒疫苗的另一个（和适当的）终点。

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