氧化还原生物。2016年12月；10: 179–190.
牛磺酸促进产前应激幼鼠的认知功能通过激活Akt-CREB-PGC1α途径
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宁佳
一西安交通大学人体解剖学、组织学和胚胎学系，陕西西安健康科学中心，邮编710061
孙钦如
b条西安交通大学法医学研究所，中国陕西西安健康科学中心，邮编710061
钱素
c（c）中国陕西省西安市健康科学中心西安交通大学第一附属医院新生儿科，邮编710061
邵康党
c（c）中国陕西省西安市健康科学中心西安交通大学第一附属医院新生儿科，邮编710061
陈国民
一西安交通大学人体解剖学、组织学和胚胎学系，陕西西安健康科学中心，邮编710061
一西安交通大学人体解剖学、组织学和胚胎学系，陕西西安健康科学中心，邮编710061
b条西安交通大学法医学研究所，中国陕西西安健康科学中心，邮编710061
c（c）中国陕西省西安市健康科学中心西安交通大学第一附属医院新生儿科，邮编710061
2016年8月28日收到；2016年10月8日修订；2016年10月11日接受。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
摘要
大量证据表明，海马神经元的氧化损伤与妊娠期不利刺激（称为产前应激）引起的认知损伤有关。牛磺酸是一种条件性必需氨基酸，在大脑中作为神经调节剂或抗氧化剂具有多种作用。为了探讨牛磺酸在PS诱导的学习记忆障碍中的作用，本研究建立了产前约束应激模型，并采用Morris水迷宫（MWM）测试了一个月大鼠后代的认知功能，检测海马ATP和细胞色素c氧化酶（CcO）活性及凋亡相关蛋白。测量海马Akt-cycle AMP反应元件结合蛋白（CREB）-过氧化物酶体增殖物激活受体-γ辅活化物-1α（PGC1α）通路的活性。结果表明，出生后早期高剂量的牛磺酸可减轻PS引起的空间学习记忆障碍。同时，牛磺酸可减少线粒体ROS的增加，恢复MMP、ATP水平的降低以及CcO、SOD2活性的降低PS诱导的海马过氧化氢酶。此外，牛磺酸给药恢复了PS抑制的SOD2表达水平。牛磺酸给药阻断了PS诱导的Bcl-2/Bax比值下降和裂解caspase-3/全长caspase-3比值增加。值得注意的是，牛磺酸抑制了PS-降低的Akt磷酸化（pAkt）和CREB磷酸化，从而提高了PGC1α的mRNA和蛋白水平。综上所述，这些结果表明，出生后早期高剂量的牛磺酸可以显著改善产前应激幼鼠的认知功能通过激活Akt-CREB-PGC1α途径。因此，牛磺酸在未来对产前应激子代大鼠具有治疗潜力。
关键词：产前应激、海马、线粒体、牛磺酸、Akt-CREB-PGC1α途径
集锦
•
牛磺酸可减轻产前应激（PS）引起的认知障碍。
•
牛磺酸可减少PS诱导的神经元凋亡和线粒体功能障碍。
•
牛磺酸维持SOD2和过氧化氢酶的活性以抑制ROS。
•
牛磺酸激活PS抑制的Akt-CREB-PGC1α途径。
1.简介
半个多世纪以来，大量证据表明，怀孕期间的不利刺激——产前应激（PS）可能会导致青少年和成年子女的精神和情感障碍[1],[2],[3],[4]进一步研究表明，海马损伤与PS引起的精神和情绪障碍有关[5],[6],[7],[8]，但其潜在机制仍不清楚。因此，到目前为止，还没有有效的措施来提高产前应激子代的学习和记忆能力。在以前的研究中，我们发现，产前应激导致神经元丢失、海马中谷氨酸的积累和细胞内活性氧（ROS）的过多生成一个月大的幼年大鼠仔鼠海马CA3区锥体神经元损伤伴空间学习记忆损伤[5],[6],[9],[10]这些结果表明，PS对后代海马神经元造成氧化损伤，这提醒我们，减少海马ROS生成可能有助于防止神经元损伤，从而提高产前应激后代的学习和记忆能力。
牛磺酸作为大多数哺乳动物组织中主要的细胞内游离β-氨基酸之一，由于其在大脑中作为神经调节剂和抗氧化剂的多功能作用而受到广泛关注。研究表明，牛磺酸不仅能保护神经元免受谷氨酸诱导的细胞毒性[11]，但也能阻止亚砷酸盐处理的SH-SY5Y细胞通过维持线粒体膜电位（MMP）并降低细胞内ROS水平。令人兴奋的是，补充牛磺酸有利于神经元增殖和突触形成体内表明其对增强突触可塑性和改善学习记忆的作用[12]此外，5周的牛磺酸治疗显著增加过氧化物酶体增殖物激活受体-γ辅活化因子-1α（PGC1α）[13]，是过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）的冷诱导转录辅激活物[14]一项研究报告称，PGC1α在调控线粒体生物发生和呼吸功能转录控制的调控网络中发挥着中心作用[15]此外，牛磺酸逆转了阿霉素诱导的线粒体中ROS解毒酶之一的超氧化物歧化酶-2（SOD2）表达下降[16]最近的一项研究表明，DETC-MeSO（一种N-甲基-D类-天冬氨酸（NMDA）受体部分拮抗剂）与牛磺酸联合使用，而非单独使用DETC-MeSO，可明显缩小缺血性梗死的梗死面积并减弱细胞凋亡通过增加磷酸化Akt（pAkt）水平，这是一种促生存标记物[17]此外，牛磺酸的抗抑郁作用与海马Akt-CREB通路的激活有关[18]另一项研究表明，CREB信号通路在调节PGC1α表达中起主导作用[19]更有趣的是，PGC1α可以增加肌肉细胞中SOD2的表达[20]基于上述数据，有充分的理由相信Akt-CREB-PGC1α通路参与牛磺酸的保护。
因此，在本研究中，我们想知道牛磺酸是否能减轻PS引起的线粒体功能障碍和认知损伤。以大鼠产前束缚应激为动物模型，采用Morris水迷宫（MWM）测试认知功能。为探讨牛磺酸的神经保护机制，测定了线粒体ROS、MMP和ATP水平、CcO活性、SOD2 mRNA和蛋白水平以及凋亡相关蛋白的表达水平。此外，我们还研究了Akt-CREB-PGC1α通路是否参与牛磺酸对产前应激的保护。
2.材料和方法
2.1. 动物和群体
无特定病原体（SPF）Sprague-Dawley大鼠购自西安交通大学医学实验动物中心，在12小时的光/暗周期（每天08:00-20:00发光）中保持恒温（25℃）和湿度（60%），在整个实验过程中自由获取食物和水。本研究采用的所有程序均符合西安交通大学动物护理和使用委员会的机构指南。根据美国国立卫生研究院实验室护理和使用指南进行测量，以将疼痛或不适降至最低。所有的努力都是为了尽量减少每次实验中使用的动物数量。
体重250–270克的无孕雌性大鼠与一只有性经验的雄性大鼠（280–350克）一起饲养，以进行交配（3:1），第二天早上检查阴道涂片。阴道涂片阳性的那一天被定义为妊娠的第0天。然后将每只怀孕的老鼠单独饲养。所有怀孕大鼠随机分为两组。一组成员在整个妊娠期内没有受到干扰，他们的后代在随后的实验中构成对照组（CON）。另一组成员在妊娠晚期（妊娠第14-20天）暴露于约束应激，他们的后代被随机分配到产前应激组（PS）和PS+TAU组。PS+TAU组由出生后第21天（P21）至出生后第30天（P30）用0.5%牛磺酸溶液喂养的子代大鼠组成。
2.2. 产前应激的处理
约束应力装置是一个透明圆柱体（直径6.8厘米），其长度可以根据动物的大小进行调整。气缸的气孔是用来呼吸的。每天进行3次束缚应激（大约在上午8:00、下午12:00和下午4:00），从胚胎第14-20天开始，每次45分钟[5],[21]在每次束缚应激训练后，将动物放回其家庭笼子。为了避免大鼠习惯于每日程序，在以下时间段（08:00–11:00、11:00–14:00和16:00–19:00）内随机切换阶段。分娩后，将每只母鼠及其后代置于同一塑料笼中，直到出生后第21天断奶。实验选择了8至14只幼崽以及适当数量的雄性和雌性幼崽。断奶后，每窝幼崽的雄性和雌性幼崽被分开并安置在两个笼子里。在出生后第31天，从每窝幼崽中取一到两只雌性和雄性幼崽进行以下实验。
2.3. 口服牛磺酸
牛磺酸粉末（Sigma，纯度>99%）购自Sigma。从出生后第21天到出生后第30天，给子代大鼠口服牛磺酸通过作为高剂量组（PS+TAU-H），他们每天的饮用水摄入量达到2000毫克/千克体重[22],[23]同时，作为低剂量组（PS+TAU-L），每天摄入200 mg/kg体重的较低剂量。每天都准备新鲜的溶液。
2.4. morris水迷宫（MWM）空间学习记忆测试
莫里斯水迷宫（Morris Water Maze）是在一个黑色圆形水池（直径180厘米，高50厘米）中进行的，水池中充满了水（21–23℃），在四个方向上安装了四个不同的视觉提示。水面被两条垂直交叉的线分成4个象限。这4个象限被定义为东南（SE）、东北（NE）、西北（NW）和西南（SW）象限。在东北象限距离圆形水池中心45 cm的水面下方2 cm处放置一个直径为10 cm的平台。逃到隐蔽平台的潜伏期由计算机视频图像分析系统（莫里斯水迷宫跟踪系统100，成都泰盟软件有限公司）记录。整个测试由两部分组成，即训练时间和探测时间。在第一次训练的前一天，每只老鼠被允许自由游泳120秒，然后被带回家中。在训练期间，所有大鼠连续五天每天接受三次试验，试验期间开始象限随机变化。在每次试验中，在老鼠被放进游泳池后计算游泳和爬上平台的时间。然后让老鼠在平台上停留30秒。任何未能在120秒内到达平台的老鼠都被引导找到平台，并被允许在平台上停留3秒。第6天，在最后一次24小时的训练后，在游泳池中没有隐藏平台的情况下进行了探针测试。将每只老鼠放在离平台原来位置最远的地方，并允许它们游泳120秒。平台交叉次数记录为目标交叉次数。
2.5. 海马线粒体超氧化物的测定
测量线粒体活性氧水平体内各组大鼠均用乙醚麻醉后处死。大脑被迅速移除，海马体被解剖并放在一个冰镇的盒子里。将海马体切割成300µm厚的薄片，每片薄片上加载MitoSOX（5µm，Invitrogen）30分钟。用激光共聚焦显微镜（TCS-SP2）检测切片或细胞中氧化染料的荧光。激发波长为498 nm，发射波长为522 nm。使用Leica SP2软件分析ROS荧光值。
2.6. 线粒体的分离和线粒体膜电位（MMP）的测定
为了分离相对高纯度的线粒体，每组大鼠均用乙醚麻醉，然后斩首。快速取出大脑，并在冰镇玻璃均质器中用线粒体分离缓冲液（225 mM甘露醇、75 mM蔗糖、4 mM HEPES和0.5 mM EGTA，pH 7.4）均质。线粒体置于冰上，蛋白质浓度用康马西蓝染色法测定。
为了测定线粒体膜电位，使用了荧光染料罗丹明123。简言之，向线粒体溶液中添加10µm罗丹明123。荧光信号由荧光计（Bio-rad）分别在490 nm和535 nm的激发和发射波长下记录。
2.7. 海马ATP水平的测定
根据制造商的说明，使用ATP测定试剂盒（BioVision）测定ATP水平。简单地说，每组的所有大鼠都用乙醚麻醉，然后斩首。大脑被迅速移除，海马体被解剖并放在一个冰镇的盒子里。用冷裂解缓冲液使海马组织均匀化15分钟。以14000×克在4℃下保持15分钟。然后收集上清液，并使用Beckman-Coulter DTX880（Beckman）测量化学发光，积分时间为10秒。
2.8. 细胞色素c氧化酶（CcO）酶活性的评估
使用细胞色素c氧化酶试剂盒（Sigma）测定细胞色素c酶活性。各组大鼠均用乙醚麻醉后处死。大脑被迅速移除，海马体被解剖并放在一个冰镇的盒子里。用PBS缓冲液冲洗海马组织3次后，将海马组织在冰镇溶解缓冲液中以1:5（wt/vol）的比例均匀化。将总体积为100µL的新鲜海马组织溶解缓冲液和酶溶液的混合物添加到950µL分析缓冲液中。通过添加50µL铁细胞色素c底物溶液引发反应。使用SmartSpec Plus分光光度计（Bio-rad）记录最终混合物在550 nm处的荧光。
2.9. SOD2活性测定
根据制造商说明，使用SOD检测试剂盒（Beyotime公司）以水溶性四氮唑盐（WST）-8为底物检测SOD2酶活性。简单地说，通过添加SOD1抑制剂（氰化钾）来钝化Cu/ZnSOD，通过抑制WST-1还原速率来测量SOD2活性。使用Bio-rad微孔板读取器测量在450nm处的吸收。
2.10. 过氧化氢酶活性测定
使用过氧化氢酶活性试剂盒（Beyotime）测定过氧化氢酶活性。简单地说，来自海马组织的冰镇匀浆与显色底物和过氧化氢混合。为了监测（N-（4-安替比林）-3-氯-5-磺酸盐对苯醌一亚胺）的生成，使用分光光度计记录520 nm处的吸光度。
2.11. 实时PCR（RT-PCR）测定PGC1αmRNA和SOD2 mRNA
按照制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从海马分离总RNA。使用Revert Aid™First Strand cDNA合成试剂盒（K1621，Formentas）进行逆转录，然后使用特定引物进行聚合酶链反应（PCR）（PTC-200，Bio-Rad）（如). 热循环程序包括94℃下3min，94℃下30s，55℃（PGC1α、Bcl-2和β-actin）或60℃（SOD2）下30s的35个循环，72℃下30min，然后72℃下10min，冷却至4℃。通过电泳溴化乙锭染色2.0%琼脂糖凝胶分析PCR产物，并通过密度计定量对应于PGC1α、SOD2和β-肌动蛋白的条带。车道通过Quantity One软件（Bio-Read）进行计算和分析。
表1
| 靶基因 | 底漆顺序（5′−3′） | 放大器尺寸（bp） |
|---|
| PGC1α | 福沃德 | ATGAATGCAGCGGTCTTAGC公司 | 171 |
| 反向 | TGGTCAGATACTTGAGAGC公司 |
|
| SOD2标准 | 向前地： | GCTGGAGCCGCACATTAAC公司 | 109 |
| 反向 | CAGCGCTCGTGGTACTTCT公司 |
|
| β-肌动蛋白 | 向前地： | CACCGCGAGTACAACCTTC公司 | 207 |
| 反向： | CCCATACCCACACACACCACCACAC（中国民航协会） |
2.12. 蛋白质提取和蛋白质印迹分析
各组大鼠均用乙醚麻醉后处死。大脑被迅速移除，海马体被解剖并放在一个冰镇的盒子里。在用PBS缓冲液冲洗海马组织3次后，将海马组织以1:5（wt/vol）的比例均匀化于含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物的冰镇裂解缓冲液中。
将样品进行SDS-PAGE并转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用以下主要抗体探测印迹：多克隆小鼠抗β-肌动蛋白（Sigma）、兔抗Akt（Cell Signaling）、鼠抗pAkt，单克隆小鼠抗Bax（细胞信号传导）、单克隆小鼠抗Bcl-2（细胞信号传导）、多克隆兔抗caspase-3（Santa Cruz），然后与物种匹配的辣根过氧化物酶偶联的二级抗体孵育。用化学发光底物溶液（Pierce）显影印迹，并暴露于X射线胶片。使用Quantity One软件（Bio-Read）量化免疫反应带的光密度。
3.统计分析
所有数值均表示为平均值±SEM，并使用SPSS 11.0软件进行数据分析。单因素方差分析用于检验各组之间的差异。在P（P）<0.05级。
4.结果
4.1. 牛磺酸促进身体发育，但不影响每日液体摄入量
为了研究牛磺酸对身体发育的影响，在出生后第21天和30天记录了每只大鼠的体重。在10天内，体重增加代表了断奶后的身体发育。在CON组中，女性的体重增加了92.24%，男性增加了96.23%。在PS组中，女性体重增加了83.65%，男性增加了84.52%。在PS+TAU-H组中，女性体重增加了119.74%，男性增加了121.38%。在雌性和雄性大鼠中，PS组的体重增加显著小于CON组(P（P）<0.01). 摄入高剂量牛磺酸可完全逆转PS引起的体重增加下降(P（P）<0.01），而低剂量牛磺酸给药并未显著增加体重增加（如).
表2
| 组（n=10） | 体重（g）
| 体重增加/P21（%） |
|---|
| 第21页 | 第30页 |
|---|
| 反对的论点 | 女性的 | 36.1±0.4 | 69.4±0.8 | 92.24 |
| 男性的 | 37.1±0.3 | 72.8±0.7 | 96.23 |
|
| PS（聚苯乙烯） | 女性的 | 31.2±0.5 | 57.3±0.8 | 83.65* |
| 男性的 | 32.3±0.4 | 59.6±0.9 | 84.52* |
|
| PS+TAU-L | 女性的 | 30.9±0.4 | 58.6±0.6 | 89.64 |
| 男性的 | 31.9±0.4 | 60.7±0.7 | 90.28 |
|
| PS+TAU-H | 女性的 | 30.9±0.3 | 67.9±0.6 | 119.74# |
| 男性的 | 31.8±0.5 | 70.4±0.6 | 121.38# |
在牛磺酸给药期间，记录每只大鼠的每日液体摄入量，并在中列出出生后第21、24、27、30天的每日液体摄入量数据显示，无论男女，四组中的任何两组（CON、PS、PS+TAU-L和PS+TAU-H组）之间均无显著差异。
表3
| 组（n=10） | 液体摄入（mL）
|
|---|
| 第21页 | 第24页 | 第27页 | 第30页 |
|---|
| 反对的论点 | 女性的 | 19.1±0.9 | 19.8±1.8 | 25.9±0.9 | 30.5±1.5 |
| 男性的 | 20.4±1.2 | 22.3±1.6 | 27.8±1.2 | 31.7±0.9 |
|
| PS（聚苯乙烯） | 女性的 | 18.6±1.5 | 20.1±1.5 | 25.8±1.1 | 30.5±1.7 |
| 男性的 | 19.8±1.2 | 21.9±1.5 | 26.8±1.5 | 30.7±1.6 |
|
| PS+TAU-L | 女性的 | 18.8±1.8 | 19.4±1.2 | 25.5±1.7 | 30.7±1.8 |
| 男性的 | 19.3±1.5 | 22.0±1.4 | 27.7±1.6 | 31.6±1.1 |
|
| PS+TAU-H | 女性的 | 18.8±1.2 | 19.5±1.8 | 25.6±1.8 | 30.8±1.2 |
| 男性的 | 19.2±0.9 | 22.1±1.7 | 27.8±1.1 | 31.6±1.3 |
4.2. 牛磺酸减弱产前应激幼鼠的认知功能
为了解决牛磺酸对空间学习和记忆能力的保护问题，1个月大的大鼠后代接受Morris水迷宫实验。实验第3天、第4天和第5天，PS组雌性大鼠的逃避潜伏期显著长于CON组(P（P）<0.01) (A） ●●●●。探针测试结果表明，PS组大鼠的靶交叉数低于CON组大鼠(P（P）<0.05) (B） ●●●●。高剂量牛磺酸几乎完全抵消了PS对雌性后代逃逸潜伏期和目标交叉数的影响(P（P）<0.01). 另一方面，与PS组相比，低剂量牛磺酸治疗未显示出显著差异（如A和B）。
牛磺酸可对抗PS引起的认知障碍。给药后，子代大鼠进行Morris水迷宫测试空间学习记忆能力。在雌性后代中，PS在实验第3、4和5天增加了逃避潜伏期（A），降低了Morris水迷宫中的目标交叉数（B）。高剂量牛磺酸可显著降低PS3、4和5天逃避潜伏期的增加（A）和PSC诱导的靶交叉数（B）的减少。（C）和（D）在Morris水迷宫中的雄性后代中显示出类似的结果。*P（P）<0.05,**P（P）<0.01与反对的论点；#P（P）<0.05,##P（P）<0.01与PS，n=10。
类似地，如C、 实验第3天、第4天和第5天，PS组雄性大鼠的逃跑潜伏期明显长于CON组(P（P）<0.05). PS组大鼠的靶交叉数低于CON组大鼠(P（P）<0.05) (D） ●●●●。高剂量牛磺酸处理显著降低了PS诱导的较长逃避潜伏期和更多靶交叉数(P（P）<0.05），而低剂量牛磺酸处理没有显示出明显差异（如C&D）。
4.3. 牛磺酸显著降低PS诱导的线粒体超氧化物的积累
线粒体超氧化物水平不仅是线粒体功能障碍的标志，也是细胞氧化损伤的标志。如所示A、 在雌性大鼠中，与CON组相比，PS组CA3区海马锥体神经元中检测到较高水平的线粒体ROS(P（P）<0.01). 高剂量牛磺酸显著降低线粒体ROS的生成(P（P）<0.01），而低剂量牛磺酸治疗在产前应激子代大鼠中没有统计学意义(C） ●●●●。同样，PS提高了雄性大鼠海马CA3区线粒体ROS的生成，而高剂量的牛磺酸治疗会减弱这种生成(P（P）<0.01），但不是低剂量牛磺酸治疗(P（P）>0.05) (B&D）。
牛磺酸降低了PS诱导的海马线粒体ROS生成。雌性（A）雄性（B）后代海马线粒体MitoSOX（红色）和DAPI（蓝色）双重染色的荧光照片，比例尺=50µm；定量分析显示，高剂量牛磺酸给药减少了雌性（C）和雄性（D）后代的PS，增加了线粒体ROS的产生。*P（P）<0.01与反对的论点；#P（P）<0.01与PS，n=6。
MMP是评价健康或损伤细胞线粒体功能的重要指标。如所示A和B，在雌性和雄性大鼠中，PS组海马的MMP显著低于CON组(P（P）<0.01). 摄入高剂量牛磺酸显著逆转PS诱导的MMP下降(P（P）<0.01），而低剂量组无统计学意义(P（P）>0.05).
牛磺酸可恢复海马线粒体膜电位（MMP）、ATP水平和CcO活性。在雌性后代中，高剂量牛磺酸显著增加了PS诱导的MMP（A）、ATP水平（C）和CcO活性（E）。在雄性后代中，摄入高剂量牛磺酸显著增加了PS诱导的MMP（B）、ATP水平（D）和CcO活性（F）。*P（P）<0.01与反对的论点；#P（P）<0.01与PS，n=6。
4.4. 牛磺酸恢复了ATP水平并保持了细胞色素c氧化酶（CcO）的酶活性
为了进一步评估线粒体的功能，检测了ATP水平和细胞色素c氧化酶（CcO）的酶活性。如所示C&D，在雌性和雄性大鼠中，PS组海马锥体神经元的ATP水平显著低于CON组(P（P）<0.01). 摄入高剂量牛磺酸可显著逆转PS诱导的ATP水平下降(P（P）<0.01），而低剂量组无明显变化(P（P）>0.05).
此外，如所示E和F，PS组海马锥体神经元CcO的酶活性显著低于CON组(P（P）<0.01). 摄入高剂量牛磺酸显著减弱了PS对CcO酶活性的影响(P（P）<0.01），而低剂量组无显著差异。值得注意的是，雌性和雄性大鼠之间没有显著差异（数据未显示）。
4.5. 牛磺酸保留SOD2和过氧化氢酶的酶活性
为了探讨牛磺酸如何降低ROS水平，检测了海马中SOD2和过氧化氢酶的活性。在本研究中，两名女性(A） 和男性(B） 结果表明，与CON组相比，PS组海马SOD2的酶活性显著降低(P（P）<0.01). 摄入高剂量牛磺酸显著增强SOD2的活性(P（P）<0.01），而低剂量的牛磺酸没有显示出这种效果。
牛磺酸保留了海马SOD2和过氧化氢酶的酶活性。在雌性（A，C）或雄性后代大鼠（B，D）中，PS显著降低SOD活性和过氧化氢酶活性，而高剂量牛磺酸的施用显著保持SOD2和过氧化氢酶的酶活性。*P（P）<0.01与反对的论点；#P（P）<0.01与PS，n=6。
同样，在两个女性中(C） 和男性(D） 结果表明，与CON组相比，PS组大鼠海马过氧化氢酶活性显著降低(P（P）<0.01). 摄入高剂量牛磺酸显著提高过氧化氢酶活性(P（P）<0.01），而低剂量的牛磺酸没有显示出这种效果。雌性和雄性大鼠之间没有显著差异（数据未显示）。
4.6. 牛磺酸增加海马SOD2的mRNA和蛋白水平
作为铁/锰超氧化物歧化酶家族的成员，SOD2清除线粒体活性氧物种（ROS）。在这里，我们检测了SOD2的mRNA和蛋白水平。如所示在雌性和雄性后代大鼠中，PS组海马SOD2的mRNA和蛋白水平均显著低于CON组(P（P）<0.01). 令人耳目一新的是，高剂量牛磺酸恢复了PS诱导的SOD2 mRNA和蛋白水平的下降(P（P）<0.01），低剂量牛磺酸的给药无统计学意义。值得注意的是，雌性和雄性大鼠之间没有显著差异（数据未显示）。
牛磺酸减弱PS对海马SOD2 mRNA和蛋白水平的影响。通过RT-PCR对雌性（A）或雄性（B）子代大鼠SOD2和β-actin mRNA水平的代表性结果。凝胶条带的定量分析表明，在雌性（C）和雄性（D）子代大鼠中，PS显著降低SOD2 mRNA水平，而高剂量牛磺酸显著提高SOD2mRNA水平后代大鼠。免疫印迹条带的定量分析表明，在雌性（G）和雄性（H）子代大鼠中，PS显著降低SOD2的表达，而高剂量牛磺酸显著提高SOD2水平。SOD2的mRNA和蛋白水平归一化为β-肌动蛋白。*P（P）<0.01与反对的论点；#P（P）<0.01与PS，n=6。
4.7. 牛磺酸减轻PS诱导的海马细胞凋亡
为了观察PS对海马的损伤，采用Western blot检测海马中裂解型caspase-3、全长型caspase-3、Bcl-2和Bax的表达水平。如所示与CON组相比，PS组雌性和雄性子代大鼠的Bcl-2表达降低，Bax表达增加(P（P）<0.01). 相应地，PS组Bcl-2/Bax的比值显著低于CON组(P（P）<0.01). 同时，与CON组相比，PS组裂解的caspase-3显著增加，同时全长caspase-3显著减少(P（P）<0.01），因此，与CON组相比，PS组中裂解caspase-3/全长caspase-3的比率显著增加(P（P）<0.01). 令人兴奋的是，摄入高剂量牛磺酸不仅大大恢复了Bcl-2/Bax的比值，而且还显著减弱了PS对裂解caspase-3/全长caspase-3比值的影响(P（P）<0.01). 相比之下，摄入低剂量牛磺酸并没有逆转PS对Bcl-2/Bax和裂解caspase-3/全长caspase-3比值的影响。雌性和雄性大鼠之间没有显著差异（数据未显示）。
牛磺酸逆转了PS诱导的Bcl-2/Bax比值下降和裂解caspase-3/全长caspase-3比值增加。雌性（A）或雄性（B）子代大鼠海马中Bcl-2、Bax、全长caspase-3和裂解caspase-2和β-actin的代表性免疫印迹带。免疫印迹条带的定量分析表明，在雌性（C，E）和雄性（D，F）子代大鼠中，PS降低了Bcl-2/Bax的比率，增加了裂解caspase-3/全长caspase-3的比率，并且高剂量的牛磺酸可以逆转PS对上述比率的影响。蛋白质表达水平归一化为β-肌动蛋白。*P（P）<0.01与反对的论点；#P（P）<0.01与PS，n=6。
4.8. 牛磺酸激活海马Akt-CREB-PGC1α通路
为了探讨牛磺酸对PS诱导的海马损伤的保护机制，我们检测了pAkt/Akt、pCREB/CREB的比值以及PGC1α的mRNA和蛋白水平。如所示在雌性和雄性后代大鼠中，PS组海马中pAkt/Akt和pCREB/CREB的比率均显著低于CON组(P（P）<0.01). 摄入高剂量牛磺酸可逆转pAkt/Akt和pCREB/CREB比值的下降(P（P）<0.01). 类似地，如所示PS组海马PGC1αmRNA和蛋白水平显著低于CON组(P（P）<0.01). 高剂量牛磺酸可恢复PS诱导的PGC1αmRNA和蛋白水平的下降(P（P）<0.01），低剂量牛磺酸的给药无统计学意义。值得注意的是，雌性和雄性大鼠之间没有显著差异（数据未显示）。
牛磺酸抑制PS诱导的pAkt/Akt、pCREB/CREB比值下降。雌性（A）或雄性（B）子代大鼠海马中pAkt、Akt，pCREB、CREB，PGC1α、SOD2和β-actin的代表性免疫印迹带。免疫印迹带的定量分析表明，在雌性（C，E）和雄性（D，F）子代大鼠中，PS降低了pAkt/Akt和pCREB/CREB的比率，并且高剂量的牛磺酸可以逆转PS对上述比率的影响。蛋白质表达水平归一化为β-肌动蛋白。*P（P）<0.01与反对的论点；#P（P）<0.01与PS，n=6。
牛磺酸抑制PS诱导的海马PGC1αmRNA和蛋白水平下降。RT-PCR检测雌性（A）或雄性（B）子代大鼠PGC1α和β-actin mRNA水平的代表性结果。凝胶带的定量分析表明，在雌性（C）和雄性（D）后代大鼠中，PS显著降低了PGC1αmRNA的水平，而高剂量牛磺酸的给药显著提高了PGC1αmRNA的水平。雌性（E）PGC1α和β-肌动蛋白蛋白水平的代表性免疫印迹带或雄性（F）子代大鼠。免疫印迹条带的定量分析表明，在雌性（G）和雄性（H）子代大鼠中，PS显著降低PGC1α的表达，而高剂量牛磺酸显著提高PGC1α水平。PGC1α的mRNA和蛋白水平归一化为β-肌动蛋白。*P（P）<0.01与反对的论点；#P（P）<0.01与PS，n=6。
5.讨论
自上世纪60年代以来，越来越多的证据表明，产前应激可导致儿童和成人的心理和行为障碍。我们之前的研究表明，与正常对照组相同年龄的后代相比，1个月龄的产前应激幼仔鼠的空间学习和记忆能力受损。尽管其潜在机制尚不明确，但近十年来，越来越多的学者开始探索有效的药物和措施来改善PS引起的认知障碍。许多研究表明，通过在出生后早期进行丰富的环境治疗，可以恢复由产前应激引起的学习和记忆障碍[24],[25]暴露于慢性轻度产前应激会导致女性后代的认知功能障碍，使用抗抑郁药物阿米替林可以改善这种状况[26]母体喂食二十二碳六烯酸（DHA）可显著预防产前应激导致的后代学习和记忆障碍[27]白藜芦醇逆转了妊娠早期和晚期应激诱导的后代认知缺陷[28]综上所述，虽然对结果和观点尚未达成共识，但有可能改善PS引起的学习记忆障碍通过在孕期或后代出生后早期采取一些措施或药物。然而，其潜在机制尚不清楚，药物或措施的效果有限。到目前为止，寻求安全有效的药物或措施仍然是一个紧迫的问题。
牛磺酸是一种游离含硫氨基酸，广泛分布于人体内，是脑内抑制性神经递质之一。多项研究表明，牛磺酸在神经疾病的预防和治疗中具有神经保护作用[29],[30]在本研究中，结果表明，PS显著降低了雌性后代大鼠从出生后第21天（P20）到出生后第30天（P30）的体重增加。从P20到P30，高剂量的牛磺酸（每日摄入2000 mg牛磺酸），而非低剂量的牛氨酸（每日摄入200 mg牛磺酸。结果表明，低剂量牛磺酸和高剂量牛磺酸均不影响PS组雌、雄大鼠的每日液体摄入量。这些结果表明，在出生后早期给予牛磺酸可以加快产前应激子代大鼠的身体发育，而不会产生明显的毒性副作用。因此，有可能研究牛磺酸是否会影响大脑发育和认知。
与之前的研究一致，在本研究中，在Morris水迷宫中，与CON组大鼠相比，PS组的雌性和雄性大鼠在训练期间表现出更长的逃避潜伏期，在探针测试中表现出更少的目标交叉数。正如预期的那样，从P21到P30的高剂量牛磺酸显著减弱了PS对逃逸潜伏期和靶交叉数的影响。这些结果表明，出生后早期高剂量的牛磺酸可以逆转PS引起的空间学习记忆障碍。
我们以前的研究表明，神经元中活性氧（ROS）的积累和海马CA3区神经元的丢失与空间学习记忆的损伤有关[9]线粒体在能量代谢、自由基生成和细胞凋亡中发挥着重要作用。线粒体功能障碍可能导致电子传递链中的电子流中断，导致线粒体ROS过度生成[31]为了探讨牛磺酸如何改善产前应激后代的空间学习和记忆，检测了海马线粒体ROS、MMP、ATP和CcO活性水平。结果表明，PS增加线粒体ROS积累，降低MMP和ATP水平，降低CcO活性。线粒体活性氧的积累被认为是线粒体功能障碍的结果，包括清除酶的缺乏和酶活性的降低。正如预期的那样，结果表明，与CON组相比，PS组SOD2的表达以及SOD2和过氧化氢酶的酶活性显著降低。另一方面，线粒体活性氧过多会导致线粒体功能障碍进一步恶化。研究表明，活性氧生成增加导致线粒体膜电位（MMP）崩溃、线粒体外膜破裂和线粒体代谢酶失活[32]我们之前的研究也提供了证据，证明PS增加了海马线粒体中8-羟基-20-脱氧鸟苷（8-OH-dG）的水平，而线粒体是DNA氧化损伤的主要最终产物[5]因此，过量的线粒体ROS和线粒体功能障碍之间会形成一个相辅相成的恶性循环，最终导致神经元凋亡和坏死。在本研究中，我们测定了凋亡相关蛋白，发现PS降低了Bcl-2/Bax的比率，增加了裂解caspase-3/全长caspase-3的比率。牛磺酸管理能阻止这种恶性循环吗？在本研究中，结果表明，出生后早期高剂量的牛磺酸可阻止PS诱导的线粒体ROS积累增加、ATP水平下降、MMP和CcO活性下降，高剂量牛磺酸可减弱PS对SOD2表达的抑制以及SOD2和过氧化氢酶活性的抑制。同时，结果表明，高剂量牛磺酸给药抑制了PS诱导的Bcl-2/Bax比值的降低和裂解的胱天蛋白酶3/全长胱天蛋白酶3比值的增加。结合Morris水迷宫中的行为结果，我们推测牛磺酸可以改善空间学习和记忆通过保持SOD2的表达和SOD2和过氧化氢酶的酶活性，抑制线粒体ROS的积累，维持MMP和ATP水平，增强CcO的活性，这可能会中断产前应激诱导海马神经元凋亡的连锁反应。
胞浆中磷酸化的Akt（pAkt）可能导致Akt移位，继而诱导其下游蛋白的激活[33],[34]CREB是Akt的下游效应器之一，是与学习和记忆相关的功能蛋白表达的重要调节器[35],[36],[37]值得注意的是，Akt-CREB途径被认为介导牛磺酸的神经保护作用[17],[18]CREB信号通路被认为是PGC1α表达的主要调节因子[19]因此，为了研究Akt-CREB-PGC1α通路是否参与牛磺酸对PS诱导的学习记忆损伤和海马神经元凋亡的保护，我们测量了Akt、CREB的磷酸化和总蛋白水平以及海马中PGC1α的表达。结果表明，PS显著降低了磷酸化Akt（pAkt）和磷酸化CREB（pCREB）的水平，尽管Akt和CREB的总蛋白水平没有明显变化。令人耳目一新的是，在出生后早期给予高剂量牛磺酸会增加产前应激后代的pAkt和pCREB水平。同时，结果表明，PS降低了PGC1α的mRNA和蛋白水平，而这在给予高剂量牛磺酸时是不存在的。其他研究组的数据表明，PGC1α的减少与亨廷顿氏病（HD）中的细胞丢失有关，而PGC1α过度表达可防止α-同核蛋白介导的线粒体功能障碍和随后的细胞丢失[38],[39]此外，SOD2是受PGC1α调节的ROS脱毒酶之一[40],[41]本研究发现，牛磺酸诱导的PGC1α上调可能与SOD2表达增加有关。
此外，在本研究中，所有实验对象均来自两性，尽管两性在行为和生化检测方面没有显著差异。PS对后代的影响是否存在性别差异？关于这一点一直存在争议。Richardson等人。[42]发现女性胎儿比男性胎儿更容易受到产前压力的影响。另一组数据表明，母亲的产前压力更可能导致成年女性后代的焦虑，而男性后代的学习和记忆问题[43]这些不完全一致的结果可能是由一些因素造成的，包括产前/母体应激的类型和强度、受试者的种类和年龄、采用的方法等。此外，用于行为和生化检测的1个月大鼠后代在性成熟之前，因此，结果表明，雌雄之间没有差异。
6.结论
综上所述，上述结果表明Akt-CREB-PGC1α通路活化的下降与PS诱导的认知损伤有关。线粒体ROS生成过多和线粒体功能障碍可能参与了这一过程。出生后早期给予牛磺酸可显著改善认知功能通过激活Akt-CREB-PGC1α途径。牛磺酸也能降低线粒体ROS水平，增加MMP、ATP和CcO活性。本研究为牛磺酸可以作为婴儿出生后早期食物的补充物，对抗PS引起的认知障碍提供了理论依据。未来，还需要更多的工作来制定适合婴幼儿食物的剂量和有效措施。
作者贡献
宁佳和孙勤茹构思并设计了这些实验。宁佳、孙勤茹、苏倩、党少康和陈国敏进行了实验。宁佳和孙勤茹分析了数据。宁佳和孙勤茹贡献了试剂/材料/分析工具；宁佳写了草稿，孙勤茹检查并修改。所有作者均同意向本出版物提交此版本。
资金
本研究得到了国家自然科学基金（批准号：3120084381500927）和中央高校基本科研业务费（批准号：xjj2015077）的资助。
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