Q生物物理评论。作者手稿；PMC 2016年10月19日发布。
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分子伴侣Hsp90的构象动力学
1美国加利福尼亚大学生物化学和生物物理系
2美国加利福尼亚大学霍华德·休斯医学院
三现住址：美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院系统生物学系
摘要
分子伴侣Hsp90是一种重要的真核蛋白，占所有细胞溶质蛋白的1-2%。Hsp90对于大量参与信号和调节过程的底物蛋白的成熟和维持至关重要。这些底物中的许多也与癌症和其他疾病有关，使Hsp90成为一个有吸引力的治疗靶点。Hsp90是一种高度动态和柔性的分子，可以使其构象适应与其作用的多种底物蛋白。这些客户蛋白的激活还需要大量构象重排。这些重排的一个驱动力是Hsp90固有的ATP酶活性，与其他伴侣一样。然而，与其他伴侣不同的是，研究表明Hsp90的ATP酶循环在构象上是不确定的。也就是说，ATP结合和水解不是决定构象状态，而是以一种依赖于有机体的方式改变预先存在的一组构象状态之间的平衡。体内Hsp90作为较大杂合物的一部分发挥作用。Hsp90的结合伙伴，即共同伴侣，有助于底物的募集和活化，许多共同伴侣通过将构象平衡转移到特定状态来进一步调节Hsp90构象动力学。研究还提出了调节Hsp90构象的其他机制。在这篇综述中，我们讨论了导致我们目前对Hsp90构象动力学的理解的结构和生物化学研究，以及核苷酸、协同伴侣、翻译后修饰和客户在调节Hsp90的构象中所起的作用。我们还讨论了当前Hsp90抑制剂对构象的影响，以及通过破坏构象动力学开发抑制Hsp90的小分子的潜力。
Hsp90的体系结构
从细菌到真核生物，Hsp90高度保守，在大肠杆菌和人类。在人类中，Hsp90主要以四种亚型存在，具有两种细胞溶质形式（Hsp90α、Hsp90β）、一种线粒体形式（Trap1）和一种内质网形式（Grp94）。所有版本的Hsp90均以专性二聚体的形式存在，每个单体由三个结构域组成(). C末端结构域（CTD，棕色）是二聚化的位点，中间结构域（MD，绿色）与客户端结合有关，ATP与N末端结构域结合（NTD，蓝色）(Pearl&Prodromou，2006年). NTD中的核苷酸结合囊是Hsp90跨物种最保守的方面，已被确定与ATP酶GHKL超家族有关，包括MutL和DNA回转酶(Bergerat等人，1997年;Dunbark等人，1997年). 与其他GHKL超家族蛋白质一样，核苷酸的结合和水解导致蛋白质的局部和全局构象变化。例如，核苷酸的结合导致N末端结构域的二聚化，这些变化是Hsp90伴侣循环中的关键步骤。其他重要的保守结构特征包括盖子(，紫色），与核苷酸结合囊相邻的螺旋-环-螺旋基序(Prodromou等人，1997年;Stebbins等人，1997年)和催化回路(，氰），NTD和MD之间的一个区域，对催化至关重要(Meyer等人，2003年). 这些区域也参与了Hsp90的构象动力学，这些结构变化的细节及其在功能上的重要性将在以下章节中讨论。
Hsp90以同型二聚体的形式存在，每个单体具有三个结构域。细菌同源物HtpG（PDB代码2IOQ）的晶体结构显示为卡通表示和表面表示。单体的结构域为蓝色（NTD）、绿色（MD）和棕色（CTD）。另一单体为灰色。NTD结合核苷酸，包含可变电荷环（红色）和与核苷酸结合囊相邻的保守盖子区域（紫色）。中间结构域包含保守的催化环（氰），对ATP水解至关重要。CTD提供构成二聚体界面。
尽管存在高度相似性，但不同Hsp90的整体域组织存在重要差异(). 重复带电区域(，红色），其长度不同，存在于酵母和胞质高等真核生物Hsp90s以及Grp94中NTD的C末端。该带电区域也存在于细菌蛋白HtpG中，但其长度明显较短。该区域最初被认为是两个结构域之间的柔性系链，但晶体结构显示，该带电区域两侧的结构元素是NTD的一部分，仅留下少量氨基酸作为NTD和MD之间的连接物(Ali等人，2006年;Huai等人，2005年;Shiau等人，2006年;Soldano等人，2003年). 虽然带电区域在酵母中是分散的，但它与底物的结合有关。含有N末端结构域和带电区的截短突变体对肽和非天然底物的亲和力高于缺乏带电区的突变体(Scheibel等人，1999年). 酵母和细胞溶质高级真核蛋白也有一个C末端MEEVD肽，该肽在协同伴侣的结合中很重要。辅色酮是与Hsp90形成复合物的辅助蛋白，被认为在客户蛋白负载、调节ATP酶循环以及Hsp90构象方面发挥作用。许多共同伴侣也作为伴侣独立于Hsp90发挥作用，或在细胞中具有其他功能。共伴侣Hsp70、Hop和FKBP52等含有TPR结构域，通过C末端MEEVD结合Hsp90。目前还没有发现Trap1、Grp94或HtpG的共伴侣，这表明它们已经进化出了控制伴侣循环的替代方法。
不同Hsp90同源物的结构域。域用蓝色的N端域（NTD）、绿色的中间域（MD）和棕色的C端域（CTD）着色。
全长蛋白的全局构象变化
对Hsp90的结构研究表明，分子伴侣是一种高度动态和柔性的分子，Hsp90构象的变异性对其与客户蛋白的相互作用和激活至关重要。如上所述，Hsp90与多种底物蛋白相互作用，这些客户蛋白在大小和形状上的巨大差异表明Hsp90必须根据客户蛋白的构象调整其构象。结构上的适应能力可能是Hsp90能够识别如此广泛的客户蛋白的机制之一。细菌Hsp90的晶体结构显示apo（无核苷酸）蛋白呈开放的V型构象，只有CTD二聚体() (Shiau等人，2006年). 在这种结构中，疏水表面沿着二聚体的内部缝隙呈现，表明了一种底物识别的方法(紫色，残留物8-23、326-342、368-384和586-612；Hsp82编号）。SAXS对载脂蛋白HtpG的研究揭示了溶液中更广泛的构象() (Krukenberg等人，2008年). 作为区分客户蛋白的一种手段，这两种构象可能在功能上是相关的。例如，延伸结构可以与较大的客户蛋白（如端粒酶）结合，而晶体结构可以与较小的底物（如类固醇激素受体）更紧密地相互作用。HtpG的另一种载脂蛋白构象与内质网同源物Grp94的晶体结构非常相似(). 有趣的是，在柠檬酸合成酶聚集分析中，类Grp94状态阻止柠檬酸合合成酶的聚集，而扩展状态没有影响，这进一步支持了不同Hsp90构象识别不同客户蛋白的观点。
Hsp90的载脂蛋白构象也因物种而异。SAXS和EM对人类Hsp90（hHsp90）、酵母Hsp90和猪Hsp90的研究表明，其构象比HtpG中的构象更广(Bron等人，2008年). 线粒体Grp94在溶液中也以类似的延伸构象存在（Krukenberg等人，出版）。yHsp90、hHsp90和pig Hsp90也观察到类似HtpG晶体结构的额外构象(Bron等人，2008年). 原核和真核Hsp90之间的结构差异可能指示与不同客户蛋白的相互作用或调节构象循环的不同方法。
虽然Hsp90在缺乏核苷酸的情况下存在结构变异，但众所周知，核苷酸在调节Hsp90的构象动力学方面也起着重要作用。Hsp90的ATP结合囊是GHKL超家族特有的蛋白质，其特征是Bergerat折叠(Dutta&Inouye，2000年)，Hsp90的ATP酶活性对功能至关重要。由于ATP酶结构域与GHKL超家族相似，最初提出了一种类似于MutL和DNA Gyrase的构象循环，Hsp90在NTD二聚化后充当分子钳(Dutta&Inouye，2000年). 全长Hsp90的结构研究表明，NTD二聚体确实在物种间发生。在存在非水解ATP类似物AMPPPNP和结合NTD的共同伴侣p23的情况下，yHsp90以闭合构象结晶，其中NTD被二聚化() (Ali等人，2006年). 在这种状态下，疏水表面不如在载脂蛋白状态下暴露得好，但在二聚体裂的外缘仍然可以接触到(Ali等人，2006年)这表明分子钳类比并不是对Hsp90与客户蛋白相互作用的最恰当描述。封闭状态不允许在单体之间为客户蛋白留出足够的空间，疏水表面的放置表明客户与二聚体间隙的外边缘结合。结合到客户蛋白的Hsp90的EM重建证实了这一假设，显示客户结合到二聚体的一侧(沃恩等人，2006年). 由于AMPPNP结合状态是在共伴侣存在的情况下结晶的，因此尚不清楚这种状态是否可以通过单独的核苷酸结合获得。阴性EM和SAXS研究表明，在缺乏共伴侣的情况下可以获得AMPPNP结合态，HtpG和hHsp90也对封闭的AMPPNP-结合态进行了取样(Krukenberg等人，2008年;Southworth&Agard，2008年).
在ADP的存在下，HtpG的结构更加紧凑() (Shiau等人，2006年). 在这种紧密状态下，疏水表面被埋藏在蛋白质的核心，这意味着客户端蛋白质的释放方式。紧凑的ADP结合晶体结构最初备受争议，特别是因为SAXS尚未观察到它。然而，最近的阴性染色EM和交联研究表明，HtpG、yHsp90和hHsp90中存在致密ADP状态，这表明该状态与功能相关(Southworth&Agard，2008年). 在真核生物中，只有在存在少量交联剂时才能观察到ADP状态，这突出了构象的瞬态性质。Grp94的交联研究进一步支持了ADP状态的相关性(Chu等人，2006年). 在已知结构中，观察到的交联仅与致密ADP晶体状态兼容。由于SAXS实验的浓度较高，SAXS很可能看不到这种状态。较高的浓度似乎足以破坏致密构象。Hsp90可以自我伴侣，以打开ADP状态回到apo状态，重置构象周期。
这些结构说明了Hsp90惊人的灵活性，NTD在每个状态之间移动约50度，并指向一个保守的构象循环。在核苷酸结合的Grp94的全长晶体结构中观察到一个额外的构象，它是在其他同源物中观察到的开放apo和封闭AMPPNP结合状态的中间产物() (Dollins等人，2007年). Hsp90的结构综合起来表明存在核苷酸依赖的构象循环(). 在此循环中，Hsp90开始处于打开状态，打开角度可变。然后，ATP的添加导致构象转变为更闭合的状态。Grp94晶体结构可以代表延伸状态和闭合状态之间的中间状态，或者Grp94状态可以是催化失活状态。这个循环继续进行，ATP水解并转化为更紧密的状态，此时所有疏水表面都被掩埋，从而释放客户蛋白/协同伴侣。然后，紧凑状态将打开并返回到扩展构象，以再次开始循环。虽然证据表明同系物之间存在保守的构象循环，尤其是HtpG、yHsp90和hHsp90，但与其他同系物（包括Grp94和Trap1）的保守程度仍然是一个悬而未决的问题。
Hsp90的结构表明存在依赖于核苷酸的构象循环。在这个循环中，ATP的结合将构象从开放结构（1）转移到NTD二聚体封闭结构（3）。Grp94晶体结构（2）可代表并沿此路径或非催化构象居中。ADP的水解导致蛋白质进一步致密（4），核苷酸的释放重新启动构象循环。
核苷酸结合导致NTD局部结构变化
虽然晶体结构对应于Hsp90构象的显著变化，但单个畴结构在很大程度上保持保守。Hsp90的灵活性主要来自以NM（NTD和MD之间）和MC（MD和CTD之间）界面为中心的刚体运动。然而，NTD中发生了重要的局部变化，这些局部变化有助于上述全球重组。盖子局部变化最大（残基94-124，Hsp82编号，，紫色），由位于结合囊附近的螺旋-环-螺旋组成，这些运动将Hsp90的核苷酸状态传递给蛋白质的其余部分，尤其是域界面。晶体结构表明，盖子的取向是高度可变的，用人类NTD进行的分子动力学模拟证实，核苷酸结合的最显著的局部变化涉及盖子(科伦坡等人，2008年). 在盖子（L2）的细胞溶质人类Hsp90（hHsp90）环2的一个方向上，参见，蓝色）被置换9º以上进入核苷酸结合囊中，可能阻碍配体的结合(Stebbins等人，1997年). 在hHsp90 NTD的另一种晶体形式和分离酵母（yHsp90）NTD的晶体结构中，L2从结合囊中移开，允许核苷酸结合(，红色）(Prodromou等人，1997年;Stebbins等人，1997年). 在yHsp90全长结构中可以看到盖子的显著不同布置，该结构结合了不可水解的AMPPNP(Ali等人，2006年). 在这种构象中，盖子现在覆盖了核苷酸结合袋，捕获结合的AMPPNP(). 这个盖子的位置也暴露了埋藏在其他盖子构象中的疏水表面，并且这种疏水表面形成了NTD二聚界面的一部分，稳定了封闭的AMPPNP结合状态。内质网同源物Grp94在盖子中有一个独特的5氨基酸插入（残基182-186），导致盖子的结构重排，以响应与其他Hsp90同源物不同的核苷酸(). 虽然盖的位置在核苷酸结合的Grp94中是独特的，但这种构象也导致了一个主要为非极性的大表面的暴露(Immormino等人，2004年)如AMPPNP-结合的yHsp90所示。疏水表面也可作为Grp94中NTD二聚反应的相互作用位点。在没有核苷酸的情况下，Grp94的分离NTD与酵母和人类构象很好地重叠，如（蓝色）(Dollins等人，2005年). 在与核苷酸结合的全长Grp94结构中，盖子变得无序(Dollins等人，2007年).
Hsp90的N末端结构域的变异主要发生在眼睑。所有结构均为Hsp90的N末端结构域，盖子以红色或蓝色突出显示。A） 分离的hHsp90 NTD的两种构象（1YER和1YES）。在一个构象（蓝色）中，环2（L2）延伸到核苷酸结合口袋中。在B）来自全长酵母结构的NTD（2CG9）和C）与ADP结合的Grp94的分离NTD（1TBW）中也可以看到盖子中的大运动。D） 在HtpG晶体中观察到三种额外的盖子构象（2IOR、2IOQ和2IOP）。
盖子的结构变异在细菌同源物HtpG中更为明显。在分离NM结构域的结构中，HtpG（残基96–126）的盖子基本上是无序的(Huai等人，2005年). 从晶体结构中有序的盖子部分可以看出，添加ADP会导致H3和H4部分展开。分子动力学模拟还显示，当ATP结合时，hHsp90的盖子结构丢失。由于与核苷酸的相互作用，盖子失去了α螺旋含量并获得了灵活性(科伦坡等人，2008年). 这与其他GHKL家族成员（如MutL）形成对比，后者的盖子在核苷酸的存在下变得更加有序(Ban等人，1999年). 在ADP-结合的HtpG的不同晶体中可以看到两个额外的盖子位置() (Shiau等人，2006年).
如yHsp90 AMPPNP结合结构和Grp94结构所观察到的，盖子区域的重排导致蛋白质中较大的构象重排，例如NTD二聚。由于盖子中的重排，还提出了其他全局构象重排。apo HtpG的全长结构支持这种想法。在这种结构中，盖子采用与NTDβ板正交的独特位置，而不是与其他结构中的β板平行() (Shiau等人，2006年). 这个盖子的构造通过定位残基F123（核苷酸的碱基和糖将位于此处）来阻止ATP结合，从而阻断对结合囊的访问。如果盖子的位置如HtpG的ADP结合形式所示，则在载脂蛋白结构中NTD和MD之间发生空间位阻，这表明核苷酸的结合必然导致盖子紊乱或NTD相对于MD的重排。模拟还表明，盖子区域的局部构象变化与较大的构象变化相耦合。虽然盖子在ATP的绑定上变得更加灵活，但仿真的基本动力学和协方差分析表明，NTD的其余部分随着整个NTD中更强的交互网络而变得更加受限(科伦坡等人，2008年).
构象在调节Hsp90 ATP酶循环中的作用
细胞溶质酵母与人Hsp90的ATP酶循环
虽然结构研究为Hsp90构象循环及其对核苷酸的依赖性提供了令人信服的图片，但关于Hsp90的分子机制以及构象、ATP酶活性和客户激活之间的联系，仍存在许多问题。迄今为止研究的所有Hsp90同源物都具有ATP酶活性，这种活性对Hsp90在细胞中的功能至关重要。ATP酶活性在同系物之间有所不同，但总的来说，这种活性很低，特别是与其他已知酶相比(). ATP酶速率的精确调节也至关重要。具有更快（T22I）或较慢（T101I）ATP酶速率的突变型Hsp90s导致对温度敏感的生长表型，并且无法完全激活糖皮质激素受体（GR）体内(Nathan&Lindquist，1995年;Prodromou等人，2000年). 通过生物化学和结构研究，人们开始了解ATP水解的途径以及调节循环的关键结构因素。
表1
Hsp90同源物在25°C下ATP水解的动力学参数
| 同系物 | K（K）米（微米） | ATP酶速率−1) |
|---|
| hHsp90型一 | 190 | 0.0009 |
| yHsp90型b条 | 100 | 0.0015 |
| HtpG公司c（c）,（f） | 250 | 0.011 |
| 陷阱1d日 | 15.4 | 0.0027 |
| 组94e（电子） | 92 | 0.006 |
从分离的NTD和全长蛋白的晶体结构来看，很明显，在核苷酸存在的情况下，盖子区域的局部构象变化以及导致NTD二聚化的全局变化会发生。仅结构研究并没有揭示构象在调节ATP酶循环中的作用。yHsp90动力学循环的彻底生化表征表明，需要NTD二聚反应才能获得正确的催化构象，这种构象变化决定了水解速度。缺失C末端二聚结构域的突变yHsp90的ATP酶活性显著受损(Prodromou等人，2000年;Richter等人，2001年)支持NTD二聚化在ATP水解中的作用。仅含有一个NTD的Hsp90异二聚体证实了这一点。异二聚体的ATP酶速率是野生型（WT）蛋白质的三分之一(Richter等人，2001年). 该数据和结果表明，速率限制步骤是ATP结合后的构象变化(Hessling等人，2009年;Weikl等人，2000年)提示NTD二聚化是速率限制步骤。最近的一项FRET研究表明，在ATP结合后，会发生缓慢过渡到中间开放状态。如上文所述，这种中间开放状态的特征可能是盖子折叠在核苷酸结合囊上，并暴露出对二聚化很重要的亲水表面。然后，NTD二聚体在第二个缓慢过渡到另一个中间状态时发生。发生最后的构象变化到催化活性状态，然后ATP迅速水解(Hessling等人，2009年). 中间态的结构尚待确定，看看Grp94结构是否如.
yHsp90的进一步生物化学研究已经解剖了NTD的对控制ATP酶速率很重要的区域。N末端和盖子调节NTD二聚化的速率，从而调节ATP水解的速率。去除盖子会消除所有ATP酶活性，但令人惊讶的是，只有一个NTD（无盖子）上没有盖子的异二聚体的ATP酶速率显著增加(Richter等人，2006年). 结构研究表明，盖子可抑制NTD二聚化，而无盖异二聚体活性的增加是由于NTD二聚化的增加(Hessling等人，2009年;Richter等人，2006年). 无盖异二聚体促进的二聚体增加取决于N末端的前24个氨基酸。在封闭酵母AMPPNP结构中，这些残基形成二聚界面。当这24个氨基酸从无盖NTD中删除时，异二聚体的ATP酶活性受到抑制(Richter等人，2006年)可能是因为NTD二聚化位点被破坏。
hHsp90的初步生物化学研究表明，人类蛋白的水解机制与NTD的二聚体完全不同。最近的结构和生物化学研究表明，水解的分子机制在yHsp90和hHsp90之间基本上是保守的，尽管在调节循环方面存在重大差异。一种依赖于NTD二聚体的机制预测了两个NTD之间的合作程度，但hHsp90的初步动力学研究表明，这两个ATP结合位点并不相互作用(McLaughlin等人，2004年). NTD的二聚化和AMPPNP结合状态下盖子的结构也表明ATP在水解过程中被困在结合囊中。核苷酸交换研究证实了yHsp90的这一假设(Weikl等人，2000年)，但在hHsp90中，ATP可以在整个水解循环中自由交换(Richter等人，2008年)质疑ATP酶循环的保守性质。
如上所述，yHsp90和hHsp90在核苷酸存在下的阴性染色EM比较表明，这两个同源物填充了AMPPNP结合的酵母结构中的闭合构象(Southworth&Agard，2008年). 最近的生化研究提供了额外的证据，证明ATP酶机制在yHsp90和hHsp90之间确实是保守的。与yHsp90一样，hHsp90的ATP酶活性需要C末端二聚化和两个NTD的存在(Richter等人，2008年;Vaughan等人，2009年). 去除hHsp90中的盖子也会导致同型二聚体的活性完全丧失，而无盖突变体和WT之间的异二聚体显示ATP酶活性强烈增加(Richter等人，2008年). 正如预期的需要NTD二聚化的机制一样，增加NTD二聚化的点突变也显示酵母和人类Hsp90的ATP酶活性增加(Vaughan等人，2009年).
hHsp90也在EM观察到的开态和闭态之间填充了至少一个中间构象，水解的速率限制步骤是核苷酸结合后的构象变化，进一步支持保守机制的观点(McLaughlin等人，2004年).
观察到的yHsp90和hHsp90的差异在于周期的调节，而不是其潜在机制。hHsp90比酵母蛋白具有更高的激活能，导致更短暂的闭合状态(Richter等人，2008年). hHsp90的阴性EM分析支持这一观点。与yHsp90不同，hHsp90的封闭AMPPNP结合状态只能在存在非常低水平的交联剂的情况下通过EM观察到(Southworth&Agard，2008年). 闭合状态的瞬态性质也解释了hHsp90在水解循环期间无法捕获ATP，以及两个ATP结合位点之间缺乏协同性。yHsp90和hHsp90可能进化出不同的调节水平，因为它们遇到的客户蛋白不同。hHsp90较慢的ATP水解速率可能表明，在人类中，Hsp90客户端需要更长的与Hsp90的相互作用时间才能被完全激活。此外，hHsp90封闭状态的短暂性表明，协同伴侣或其他调节手段在人类中的作用可能比在酵母中的作用更大。
HtpG、Grp94和Trap1的ATP酶循环
细菌HtpG的ATP酶循环特征不太明确，但似乎与yHsp90和hHsp90具有相同的水解机制。如yHsp90和hHsp90所示，HtpG在存在核苷酸的情况下从类似的开放到闭合状态进展(Krukenberg等人，2008年;Southworth&Agard，2008年). 此外，氢-中子交换质谱（HX-MS）实验证明，在封闭状态之前存在一个中间构象，水解反应中的速率缓和步骤是从中间状态到封闭状态的转换。与yHsp90一样，HtpG在周期中捕获核苷酸(Graf等人，2009年)这表明闭合状态比hHsp90观察到的瞬态更少。这得到了负染色EM和SAXS实验的支持，其中在AMPPNP存在的情况下很容易观察到闭合状态(Krukenberg等人，2008年;Southworth&Agard，2008年).
目前尚不清楚ER同源物Grp94或线粒体同源物Trap1是否与其他Hsp90遵循相同的途径。与其他同源物不同，Grp94的ATP结合通过一步机制进行，NTD二聚体尚未直接测量。与其他同系物一样，速率限制步骤是水解或水解前的构象变化，在水解过程中ATP不被Grp94捕获(Frey等人，2007年). 与hHsp90一样，这可能是由于瞬态闭合状态。对于Trap1，水解或构象变化也是速率限制的，与Grp94类似，在水解过程中不捕获核苷酸。基于ATP与Trap1的色氨酸荧光结合是一个两步过程(Leskovar等人，2008年). 鉴于Grp94和Trap1与其他Hsp90的结构和序列相似，似乎最有可能的是整个水解循环在同系物之间是保守的。因此，差异很可能是由于载脂蛋白结构或周期调节的差异造成的。
二聚的重要性
NTD和CTD二聚化是Hsp90功能的必要方面，理解二聚化对Hsp90分子机制的影响至关重要。水解时需要CTD二聚，主要是为了促进NTD的额外二聚，NTD处的二聚需要稳定NTD和MD的催化活性构象。只要两个单体通过交联剂连接，只有CTD缺失的Hsp90保留WT-ATPase活性(Wegele等人，2003年)证明NTD和MD足以催化。缺乏MD的交叉连接NTD的ATP酶活性比WT低100倍(Wegele等人，2003年)，支持MD的催化作用。MD中靠近NTD界面的残留物（催化环，Hsp82残留物375–388）对ATP水解至关重要(Meyer等人，2003年)，NTD二聚作用用于调整催化回路的方向，以便发生水解。完全活性不需要在两个NTD上进行催化，因为含有一个WT NTD和一个不能结合ATP的NTD的异二聚体是完全活性的(Richter等人，2001年)支持NTD二聚化建立催化活性NM构象的假设。
最近的证据证实，两个单体之间的相互作用是获得催化构象所必需的，这种构象可能与酵母AMPPNP结合晶体结构中的构象不同。描述了一种单体的NTD和另一种单体的MD催化回路之间的相互作用网络() (坎宁安等人，2008年). 通过检测一系列yHsp90异二聚体的ATP酶活性，发现含有T22、V23和Y24（Hsp82编号）的环与相对单体的残基L376、L378和R380（MD催化环的一部分）形成疏水网络。通过突变破坏该网络会导致ATP酶活性的丧失。R380对yHsp90的ATP酶活性至关重要(Meyer等人，2003年). 在yHsp90的AMPPNP结合结构中，R380是唯一接触γ-磷酸盐的残基，疏水网络可能有助于稳定这种相互作用。MD模拟通过显示ATP存在下相互作用网络的稳定性，证实了这些疏水接触的重要性(Morra等人，2009年). HX-MS数据进一步支持了中间结构域参与核苷酸结合，该数据表明添加ATP后MD催化环的保护作用增强(Graf等人，2009年). 这种保护作用可以通过残基22-24对相对单体中含有精氨酸的环的堆积来解释().
MD催化环和相对单体的NTD之间形成疏水相互作用网络。NTD显示为蓝色，MD显示为绿色，CTD显示为棕色。ATP和参与相互作用网络的残基显示为球体，NTD残基显示深紫色，MD残基显示薰衣草色。在展开图中，第二个单体以米色显示。
生化证据和模拟都表明，蛋白质间疏水网络有助于稳定水解活性态，这种构象与酵母AMPPNP结合晶体结构中的构象不同。检测到的NTD环T22F上的突变导致yHsp90的ATP酶活性增加，但该位置的苯丙氨酸会在酵母AMPPNP结合结晶状态中引起空间位阻冲突(坎宁安等人，2008年). 模拟中观察到的交替构象最适合T22F突变(Morra等人，2009年). ATP存在下MD催化环的HX-MS保护增加也支持了这样的观点，即催化构象不是在yHsp90 AMPPNP结合的晶体结构中观察到的构象。
Hsp90中的相互作用网络也必须延伸到NTD和MD之外。CTD二聚作用通过MC界面上的大构象变化促进NTD二聚，从而将Hsp90从开放状态转换为闭合催化状态。MD在载脂蛋白HtpG结晶状态和酵母AMPPNP结合结晶状态之间旋转80°。为了使NTD二聚体发生，核苷酸结合必须在原聚体的整个长度上传播信号。为了支持这一假设，MD对全长Hsp90的模拟发现，添加核苷酸后，NTD和CTD残基之间的通信效率增加(Morra等人，2009年). 有趣的是，虽然ATP和ADP-结合的Hsp90都显示残基在80℃的距离上进行通讯，但每个核苷酸都激活NTD和CTD之间的一组不同的通讯残基，如这些不同的途径可能决定了Hsp90在ATP或ADP存在下的不同构象，进一步的突变研究可以用来阐明每个网络在建立Hsp90构象中的作用。
分子动力学模拟表明，在ATP或ADP存在下，NTD和CTD之间存在不同的远程通信网络。参与远程通讯的残基显示在酵母AMPPNP结合的晶体结构上。NTD显示为蓝色，MD显示为米色，CTD显示为绿色，第二单体显示为灰色。仅在ATP存在的情况下观察到的远距离相互作用显示为紫色。只有ADP存在时才能看到的相互作用以橙色显示。观察到的与ATP和ADP的相互作用以深灰色显示。
Hsp90存在于构象状态之间的动态平衡中
正如所讨论的，Hsp90的结构表明ATP在构象循环中的作用具有确定性机制()与其他伴侣的情况类似。然而，在不同条件下，晶体结构仅呈现出Hsp90构象的静态表征。研究溶液中Hsp90结构或捕捉蛋白质动力学的其他实验表明，与许多其他ATP酶不同，Hsp90本质上是随机的。Hsp90不是由核苷酸结合/水解决定构象，而是存在于不同构象状态之间的动态平衡中，而核酸结合/水解则改变了现有构象之间的平衡。
NTD的MD模拟表明，lid自发地从无核苷酸构象转换为核苷酸结合构象(科伦坡等人，2008年)这表明可能存在连续的构象，核苷酸可以稳定一种构象。动力学研究提供了第一个生化证据，证明Hsp90在核苷酸存在下以混合状态存在，不同构象的相对数量具有同源特异性。对yHsp90 ATP酶循环的分析表明，当ATP结合时，大约80%的分子会转移到假定的闭合状态(Weikl等人，2000年). 阴性染色EM和SAXS提供了与AMPPNP结合的结构证据，yHsp90在酵母AMPPNP结合的晶体结构中主要处于闭合构象，但即使有饱和核苷酸，仍有少量开放构象保留(Southworth&Agard，2008年). 同样的研究表明，AMPPNP-结合的hHsp90大部分仍处于开放状态，只有在低水平交联剂存在的情况下才能观察到闭合状态。动力学研究表明，线粒体Trap1在ATP存在下也主要处于闭合状态（70%）(Leskovar等人，2008年)而Grp94在核苷酸存在的情况下大部分仍处于开放状态（97%）(Frey等人，2007年). Grp94的SAXS数据证实，在存在核苷酸的情况下，Grp94主要处于开放、扩展状态(Krukenberg等人，2008年;Southworth&Agard，2008年).
在构象平衡中观察到的同源特异性差异可能有助于阐明已报道的ATP酶活性的差异。37°C时，yHsp90的ATP酶活性最高，HtpG的活性适中，hHsp90活性最低（C.Cunningham，个人交流）。相对ATP酶速率与溶液中观察到的闭合状态的比例密切相关。对于yHsp90，核苷酸存在下的构象平衡可以通过删除前八个氨基酸（Δ8-Hsp90）而完全转移到闭合状态(Mickler等人，2009年). 与WT相比，该突变体的ATP酶活性增加了一倍，进一步支持了ATP酶速率的差异与溶液中封闭状态的程度有关的假设。
由于这些结果，Hsp90构象循环的新图景必须包括核苷酸存在下开放和闭合状态之间的动态平衡。最近的实验表明，循环更为复杂。如前所述，yHsp90的FRET研究描述了之前描述的开放和闭合状态之间的两个中间状态，根据状态之间的能量屏障的计算，在没有核苷酸的情况下也可以访问所有状态。核苷酸的作用不是决定构象，而是降低状态之间的能量屏障(Hessling等人，2009年;Mickler等人，2009年). 猪Hsp90蛋白的冷冻电镜和SAXS数据(Bron等人，2008年)揭示了载脂蛋白的两种开放构象。一种构象导致结构具有与HtpG apo晶体结构相同的开口角，但NTD以更大的构象形成V型结构。在第二种构象中，由于蛋白质NM结构域的弯曲，NTD相互远离，形成一种被描述为“飞行海鸥”的结构。HtpG在溶液中也具有至少两种apo构象。SAXS研究确定了一种延伸构象，如(Krukenberg等人，2008年)构象与Grp94晶体结构几乎相同（Krukenberg et al，in press）。虽然载脂蛋白状态的确切构象可能不保守，但从细菌到人类，载脂蛋白构象或核苷酸结合构象之间的动态平衡是保守的。体内，由于ATP对Hsp90的亲和力相对较弱，还必须考虑无核苷酸和结合核苷酸状态之间的平衡。
有趣的是，所有观察到的状态似乎都大致呈等融合状态，进一步突出了伴侣循环的随机性。这对于理解激活客户蛋白的能量来源非常重要。目前，这仍然是一个有待进一步探讨的问题。理解协同伴侣和其他调控手段如何影响构象动力学也很重要，尤其是在客户激活的背景下。下一节将讨论共同伴侣在伴侣循环中的作用。
共伴侣在调节Hsp90构象周期中的作用
虽然核苷酸提供了一种影响Hsp90构象的方法，但Hsp90的蛋白结合伙伴也影响其构象动力学。yHsp90和hHsp90存在于与其他称为共伴侣蛋白的蛋白质的大型杂合物中。辅酶对Hsp90的正确功能和调节至关重要体内发现了越来越多的(). 辅色酮也为Hsp90识别不同的客户蛋白提供了一种潜在的方法。已经为孕酮受体（PR）、糖皮质激素受体（GR）和激酶Chk1建立了一组最少的必要的共同伴侣，提供了关于不同共同伴侣的作用和客户蛋白之间特定需求的信息。体外，GR需要除Hsp90外最少数量的共伴侣（仅Hsp70和Hop）来重建类固醇结合活性(Arlander等人，2006年;Dittmar&Pratt，1997年;Kosano等人，1998年). 对于在体外除了Hsp90外，还需要重建PR、Hsp70、Hsp40、Hop和p23(Kosano等人，1998年). 激酶Chk1还需要Hsp90、Hsp70、Hsp40和Hop才能实现最大激活，但与PR不同的是，还需要激酶特异性协同伴侣p50，而p23则不需要(Arlander等人，2006年). 这些共同伴侣需求的差异可能为区分客户蛋白提供了一种机制。
重组体系还揭示了在整个伴侣循环的不同阶段特定杂合物的形成(). Chk1和PR结合Hsp40开始循环。Hsp40将客户带入了与Hsp70的复杂环境。然后，通过Hop介导Hsp70和Hsp90之间的相互作用，形成最初的Hsp90复合物，从而将客户蛋白转移到Hsp90。对于Chk1，该初始复合物还包括p50。Hsp70与中间络合物分离，形成晚期络合物。对于Chk1，该络合物包括激酶、Hsp90和p50。在此阶段，类固醇激素受体与Hsp90和p23复合。激活的客户蛋白随后从Hsp90复合物中释放出来(Felts等人，2007年;Hernandez等人，2002年;Kosano等人，1998年;史密斯，1993). 中的图表详细介绍了激活所需的最小系统，但已经确定了许多其他共伴侣，并被认为在伴侣循环的调节中发挥着重要作用体内(). 例如，在与Hsp90、GR/PR和p23的复合物中发现了免疫亲和素FKBP52体内; FKBP52还增加GR的激素结合能力，对正确激活PR至关重要体内(Chadli等人，2008年;Riggs等人，2003年).虽然一些共同伴侣，如Hsp70和Hsp40，需要用于客户招募，但其他共同伴侣调节ATP酶活性和Hsp90的构象动力学。
孕酮受体和Chk1激酶激活的拟议伴侣循环。孕酮受体（PR）或Chk1首先与Hsp40结合，然后向Hsp70募集。接下来是一个含有Hsp90、Hop和Hsp70的复合体。对于Chk1，这种中间复合物还包括激酶特异性p50。当Hsp70和Hop解离时，形成成熟的复合物。PR的成熟复合体需要附加因子p23的结合。
啤酒花在构象周期的早期捕获Hsp90
与p23不同，共伴侣Hop在伴侣周期的早期起作用。Hop是一种含有TPR结构域的蛋白质，作为二聚体与Hsp90的C末端MEEVD结合。通过这种相互作用，Hop促进底物从Hsp70转移到Hsp90(Wegele等人，2006年). 虽然Hop和Hsp90之间的主要相互作用是由Hsp90的C末端介导的，但Hsp90其他区域也参与了相互作用。Hop对Hsp90的亲和力随着Hsp90 N末端截短的增加而降低(Richter等人，2003年)表明Hop与Hsp90的相互作用跨越整个单体。相反，最近对啤酒花的生物物理研究表明，Hsp90的MD和CTD足以重述WT-Hop结合(Onuoha等人，2008年). 需要进一步的结构研究来调和这一明显矛盾的证据。
啤酒花在没有核苷酸和有核苷酸的情况下都能与Hsp90结合，尽管有报道称在有ATP的情况下结合略有减少(Grenert等人，1999年). 与p23一样，Hop抑制Hsp90的ATP酶活性，但与p23不同，这种抑制是严格非竞争性的(Onuoha等人，2008年;Prodromou等人，1999年;Richter等人，2003年;Siligardi等人，2004年). p23在闭合构象中稳定了Hsp90，而Hop在开放状态下稳定了Hps90并阻止其转化为闭合状态(约翰逊等人，1998年). Hop和p23通过识别/稳定Hsp90的不同构象，在伴侣循环的不同阶段发挥作用；一旦Hsp90显著填充了闭合状态，p23的亲和力就远高于允许循环进行的Hop的亲和力。与p23一样，Hop对Hsp90的结合亲和力可以通过Hsp90突变体进行调节。正如对Hop结合开放状态的模型所预期的那样，促进闭合状态的突变体对Hop的亲和力降低。Δ8-Hs90和A107N增加了NTD二聚体，与啤酒花的结合不那么紧密(Onuoha等人，2008年;Richter等人，2003年)添加其他可能破坏Hop与Hsp90结合的协同伴侣可以逆转对Hop的抑制。共同伴侣Cpr6和PP5是两种含有TPR的共同伴侣，与Hop竞争结合Hsp90，已被证明可以逆转Hop的抑制作用，为伴侣循环的进展提供机制(Prodromou等人，1999年).
所有这些数据都指向了一种抑制机制，即Hop在开放状态下与Hsp90结合，并阻止其转化为闭合状态。最近的FRET研究证实，在ATP和Hop存在的情况下，Hsp90从开放状态到闭合状态的构象转变不再发生(Hessling等人，2009年). 虽然Hop无疑稳定了Hsp90的开放构象，但Hop结合本身也可能导致Hsp90构象变化，从而增加Hop的抑制电位。SAXS对Hop:Hsp90复合物的研究表明，复合物形成后发生构象变化。回转半径（R克)对于单独的Hsp90和Hop分别为62.2和55.2Å，具有相应的最大原子间距离（D最大值)207年和193年。Hop:Hsp90复合物有一个R克61.5º和D最大值204Å(Onuoha等人，2008年). 与单纯的Hsp90相比，复合物整体尺寸的减小表明构象发生了变化。
p50是一种激酶特异性共伴侣蛋白，它也将Hsp90限制在开放构象中
共伴侣蛋白p50也抑制ATP酶活性并影响Hsp90的构象动力学，但其机制与Hop和p23不同。p50是一种激酶特异性共同伴侣，被认为有助于激酶向Hsp90的转移(Grammatikakis等人，1999年;Lee等人，2002年;Stepanova等人，1996年). 结构域映射表明p50的N末端结构域对结合激酶至关重要，而中间和C末端结构域与Hsp90相互作用(Grammatikakis等人，1999年;Roe等人，2004年;邵等，2003). 生化研究表明，p50与Hsp90以1:1的比例结合，相互作用主要发生在Hsp90的NTD。这种相互作用还需要带电回路，CTD的删除会导致亲和力的损失(Roe等人，2004年;Siligardi等人，2002年;Zhang等人，2004年). 与Hsp90的NTD结合的p50的C末端区域（残基148–348）的晶体结构显示p50的二聚体，但在这种结构中，二聚体界面很小，可能仅由晶体接触产生(Roe等人，2004年). 生化研究表明，p50最初可能会将Hsp90作为单体结合，因为KD类二聚化（80 uM）小于KD类对于复杂地层（4 uM）(Zhang等人，2004年). 如果是这种情况，则结合到每个Hsp90 NTD的一个p50单体的局部浓度增加可能导致p50的二聚化，即使KD类对于p50二聚作用相对较弱。
晶体结构也表明抑制Hsp90 ATP酶活性的机制。p50的R167指向Hsp90的核苷酸结合囊，并与Hsp90（E33）的催化谷氨酸形成氢键。核苷酸仍然结合，但催化水不再用于水解(Roe等人，2004年). 晶体结构还揭示了另一种潜在的抑制方式，其中p50阻止Hsp90从开放状态转换为闭合状态。当p50:Hsp90二聚体对接到yHsp90 AMPPNP结合晶体结构的一个NTD上时，p50与第二个Hsp90 NTD发生空间碰撞(). 此外，在晶体中，p50在Hsp90的两个NTD之间形成二聚体，可能阻止Hsp90向闭合状态的转变(). 当连接到HtpG的全长载脂蛋白晶体形式上时，p50二聚体完美地嵌入Hsp90二聚体的缝隙中，可能以开放构象稳定Hsp90(). 因此，p50可能阻碍闭合状态的形成，并且一旦闭合状态形成就不能结合。利用Hsp90突变体T22I和T101I进行的生化研究证实了p50对Hsp90开放构象的偏好(Millson等人，2004年).
p50的晶体结构与Hsp90结合。A） 在晶体中，p50的C末端区域（红色）和Hsp90的NTD（蓝色）形成异四聚体，p50在Hsp90两个NTD结构域之间形成二聚体。B） p50结合与Hsp90闭合状态的二聚NTD不相容。Hsp90的两个NTD以蓝色和米色显示，它们以酵母AMPPNP结合的晶体状态显示。将p50:Hsp90晶体二聚体对接到一个闭合状态的NTD上，可以发现p50（红色）和第二个Hsp90 NTD（米色）之间的空间位阻。C） 来自A的p50:Hsp90异四聚体与来自脱附细菌晶体结构的两个NTD对齐，这表明了阻断Hsp90闭合的机制。apo结构的一个单体以绿色显示，另一个以米色显示。要使Cdc37绑定到此结构，apo状态的NTD必须像蓝色Hsp90 NTD一样移动。
有趣的是，要使p50与全长载脂蛋白构象结合，必须在Hsp90的NTD和MD之间发生结构重排(). p50:Hsp90复合物的溶液研究也表明，复合物的形成会引起Hsp90的构象变化。根据SAXS测量克和D最大值当p50结合时，hHsp90的减少。R克和D最大值在p50存在的情况下，仅Hsp90的温度分别从64.6和219℃升高到62.7和200℃(Zhang等人，2004年). HX-MS还显示了p50存在时hHsp90保护作用的变化，这与构象变化一致。hHsp90的NTD中的两个肽（77-85和221-235，Hsp90β编号）在p50:Hsp90晶体结构中未受到干扰，在p50存在时显示出增强的保护作用。当p50结合时，与NTD相邻的中间结构域肽的保护作用也会增强。观察到的稳定模式与p50存在下NTD和MD之间增加的相互作用一致，但这种相互作用与apo晶体结构中NM畴取向不兼容(菲利普斯等人，2007年)这意味着p50结合导致Hsp90NM结构域的重排。
Aha1激活Hsp90的ATP酶
与讨论的其他共同伴侣不同，Aha1刺激Hsp90的ATP酶活性(Lotz等人，2003年;Meyer等人，2004年;Panaretou等人，2002年). Aha1主要与Hsp90的MD结构域结合，这种相互作用由Aha1（N-Aha1）的N末端部分介导(Lotz等人，2003年;Meyer等人，2004年;Siligardi等人，2004年). N-Aha1与Hsp90的MD在络合物中结晶(Meyer等人，2004年)在Hsp90上提供Aha1的精确定位。当与闭合晶体结构或开放晶体结构对齐时，Aha1在距离二聚体界面约90°的二聚体裂缝边缘与Hsp90结合(). 凝胶过滤和核磁共振研究表明，Aha1与Hop和p23竞争结合Hsp90(Harst等人，2005年;Martinez-Yamout等人，2006年)，表明Aha1在伴侣循环的多个阶段起作用，破坏其他共伴侣的抑制作用。Aha1可以取代早期复合物中的Hop，取代成熟复合物中刺激ATP酶活性的p23，并允许伴侣循环的继续。
Aha1在裂口边缘结合Hsp90。通过将N-Aha1:MD-Hsp90配合物对接在全长apo（A）和ATP（B）晶体结构上，可以确定Aha1的近似取向。Aha1呈灰色，而Hsp90的一个单体为绿色，另一个为米色。
Aha1通过促进或稳定Hsp90 NM结构域的构象来刺激Hsp90的ATP酶活性，该结构域可优化MD催化环的位置，以进行催化(). 在全长的载脂蛋白晶体结构中，催化环的位置使R380（上述疏水相互作用网络的一部分）与MD的其余部分接触，并从与NTD的接触中移除(). 在封闭的AMPPNP结合晶体状态下，环具有较少的α螺旋结构，导致R380朝向NTD，在NTD处与ATP的γ-磷酸盐接触(和). 尽管在Aha1:Hsp90催化环的复杂部分是无序的，但其取向与在闭合状态下发现的环构象更加一致(). 有趣的是，ATPase速率降低的R380A突变体没有被Aha1激活(Meyer等人，2003年)这意味着R380在Aha1介导的Hsp90激活中至关重要。Hsp90 E381K（位于催化环上）突变体对激活不敏感，进一步强调了催化环在Aha1介导的激活中的重要性，尽管仅突变对ATP酶活性影响很小(Meyer等人，2003年). 所有证据表明，Aha1促进或稳定NTD二聚化后发生的Hsp90构象，并增加MD和NTD之间的相互作用。数据表明，位于NM界面并可能参与域间通信的Hsp90 F349A突变体对Aha1过敏，也支持这一结论(Meyer等人，2003年;Siligardi等人，2004年).
Aha1与Hsp90结合导致MD催化回路中的重排。A） N-Aha1（灰色）与Hsp90（绿色）MD在络合物中结晶。以红色显示的催化环在晶体结构中部分无序。B） 与Aha1:Hsp90复合物相比，apo全长结构（米色）中的催化环具有更多的α-螺旋结构，催化所需的R380（以棒状显示）与apo结构中的MD形成接触。C） 在封闭的AMPPNP结合晶体结构中，紫色显示的催化环将R380定向于NTD，在NTD中与ATP的γ-磷酸盐相互作用。Aha1:Hsp90复合体中的环结构与闭合状态下的环结构密切相关。
虽然从这些研究中可以清楚地看出，NM结构域的NTD二聚和重排对于Aha1对Hsp90的影响很重要，但尚不清楚Aha1是否在形成后简单地稳定催化构象，或者Aha1的结合是否导致Hsp90构象的改变而导致催化。FRET最近的一项研究表明，Aha1直接诱导yHsp90的结构变化。Aha1结合导致NTD和MD之间构象变化的快速加速，类似于无盖Hsp90突变体的加速，这表明NTD二聚体增加。FRET结果还表明，Aha1结合允许Hsp90在核苷酸结合后绕过第一个构象中间体，从而导致第二个NTD二聚体中间体的积累(Hessling等人，2009年). 考虑到Hsp90的动力学性质，它很可能对动力学路径上的所有状态进行采样，Aha1的结合将平衡转移到催化活性构象，从而提高Hsp90 ATP酶的活性。
控制Hsp90构象循环的替代方法
如上所述，共伴侣为Hsp90的构象周期提供了一个优雅的调节层，这种调节对于细胞溶质酵母和人类Hsp90正常功能至关重要。然而，细菌HtpG和ER同源物Grp94没有已知的共同伴侣。鉴于这种额外水平的调控对胞质酵母和人类蛋白质的重要性，HtpG和Grp94极有可能开发出超越核苷酸结合效应的替代调控手段。虽然HtpG或Grp94的这种调节尚未得到很好的定义，但已经提出了一些可能的机制。
最近的工作证明了pH值在控制HtpG构象中的作用（Krukenberg等人，出版）。不同pH值下的SAXS研究表明，载脂蛋白HtpG主要存在两种构象状态，一种扩展状态和一种类似Grp94的状态，并且优化了这两种状态之间的平衡，使两种构象的最大水平出现在生理pH值。两个方向上的pH值变化会显著改变两种构像的相对数量。如前所述，这些状态似乎在客户蛋白的结合中起着不同的作用。在柠檬酸合成酶聚集分析中，只有Grp94样状态能够阻止柠檬酸合合成酶的聚集（Krukenberg等人，正在出版）。利用pH值控制Hsp90的构象似乎是一种独特的细菌特性。体内细菌可以利用pH平衡作为传感器，在代谢应激时调节HtpG的构象。也有可能，微调的构象平衡仅用于在不含c-ochaperones的情况下优化两种构象的水平，并且每个构象结合客户蛋白的特定子集。
控制Ca构象的另一种机制2+建议对Grp94进行绑定。因为ER起着Ca的作用2+储存细胞器，钙的作用2+对Grp94的功能进行了研究，研究将Grp94定义为钙2+结合蛋白(Macer&Koch，1988年;Van等人，1989年). 表面等离子共振研究表明钙2+结合改变Grp94的构象(Ying&Flatmark，2006年)以及研究钙的作用2+关于肽与Grp94结合的结论是，二价阳离子导致Grp94的构象变化，促进肽的结合(Biswas等人，2007年). 与pH和HtpG、Ca一样2+结合可以为Grp94提供一种手段，使其能够访问/稳定结合特定客户蛋白的替代构象。钙2+也可用于在压力下调节Grp94构象。需要进行更直接的结构研究，以确定这些构象变化的确切性质和程度。
客户蛋白结合与Hsp90构象的关系
Hsp90的构象动力学无疑与客户蛋白的激活直接相关。Hsp90的变化很可能导致客户蛋白本身的结构改变。作为另一种调节水平，客户蛋白本身也可能影响Hsp90的构象。客户引起的Hsp90变化可能是Hsp90区分各种客户的一种方法。鉴于特定客户蛋白激活方式的差异，即PR与Chk1，将该信息从客户转移到Hsp90至关重要。虽然客户蛋白与Hsp90之间相互作用的确切性质在很大程度上仍是一个谜，但有新的证据支持这一观点。客户端蛋白改变Hsp90构象的一些初步证据来自于对p50:Hsp90复合物稳定性的研究。仅由Hsp90和p50形成的复合物对高盐浓度敏感，但当添加激酶时，复合物变得耐盐(Hartson等人，2000年). 激酶结合可能导致Hsp90、p50或两者的结构重排，使复合物具有抗盐性。客户端结合改变Hsp90构象的可能性并不是激酶独有的特征。GR的配体结合域刺激hHsp90的ATP酶速率(McLaughlin等人，2002年)这表明GR使人类Hsp90的种群向封闭催化状态转移。这与数据很好地相关，数据表明hHsp90的基础ATP酶比率如此低，因为它不显著填充闭合状态。数据表明，啤酒花抑制刺激速率，但对基础速率几乎没有影响，进一步支持了这一结论(McLaughlin等人，2002年)在GR存在的情况下，p23更显著地抑制hHsp90(McLaughlin等人，2002年)而不是缺席。测试其他客户蛋白刺激Hsp90 ATP酶活性的能力将非常有趣。如果客户之间存在差异，这将支持ATP酶刺激是Hsp90识别特定客户蛋白的一种方法的假设。客户结合影响Hsp90构象的最直接证据来自阴性染色EM对p50:Hsp90:Cdk4复合物的三维重建(沃恩等人，2006年). 重建显示了由两个Hsp90单体、一个p50单体和一个Cdk4激酶单体组成的不对称络合物。Hsp90二聚体的构象类似于封闭的AMPPNP结合态，但NTD没有二聚化。一个NTD向后铰链远离另一个，p50在两个NTD之间绑定。Cdk4与复合体的外边缘相互作用。该激酶与Hsp90 MD接触，似乎是C叶，N叶与一个Hsp90 NTD和p50接触。上述先前的研究表明，p50与Hsp90以1:1的络合物结合，该络合物被锁定在与载脂蛋白晶体结构更密切相关的构象中。为了调和这些结果，有人建议激酶最初结合p50的二聚体，该复合物被招募到Hsp90形成对称复合物。然后发生结构重排，取代一个p50单体，导致EM观察到的不对称络合物() (沃恩等人，2006年). 还需要更多的研究来测试这一假设途径，并确定p50和Cdk4对Hsp90构象的个别影响。虽然p50和Cdk4都可能影响Hsp90的构象，但当两者结合时，很可能对Hsp90动力学产生协同作用。了解这些构象变化如何影响激酶的结构也很重要。从两个p50单体结合到一个单体的复合物转变为单体可能是激活客户端的关键步骤。为了验证这个假设，进一步的结构研究结合在体外需要进行激酶活化检测。
Hsp90:p50:Cdk4复合物形成的建议模型。最初，激酶Cdk4与p50的二聚体结合。然后将该复合物招募到Hsp90的二聚体中，形成对称复合物。发生构象重排，p50的一个单体被取代，导致EM观察到的不对称复合物。
小分子也改变了Hsp90的构象
如前所述，Hsp90的构象动力学对其正常功能至关重要。此外，多层调控影响构象，表明Hsp90构象动力学的小分子抑制剂可能是伴侣功能的有效抑制剂，为Hsp90相关疾病提供重要的治疗方法。目前，大多数小分子Hsp90抑制剂与ATP竞争结合，而不是设计来影响Hsp90的构象。然而，有迹象表明，这些抑制剂中的一些不仅通过阻断核苷酸的结合发挥作用，还通过将Hsp90的构象转变为不能与客户蛋白结合的状态发挥作用。
正如对占据核苷酸结合囊的小分子所预期的那样，抑制剂结合导致Hsp90盖子的局部变化(Immormino等人，2004年;Stebbins等人，1997年). 抑制剂格尔德霉素（GA）的结合导致Hsp90的盖子构象(Stebbins等人，1997年)类似于分离的apo-hHsp90 NTD的构象(，红色）。这种构象不同于核苷酸结合复合物中的盖子状态，在这种复合物中，疏水表面可用于NTD二聚体。抑制剂诱导的NTD局部变化很可能与Hsp90二聚体整体结构的变化有关。GA结合盖构象表明GA和核苷酸对Hsp90的整体结构有非常不同的影响。
体内，GA与Hsp90的结合导致客户蛋白的不稳定和降解(Mimnaugh等人，1996年;Schulte等人，1995年;Whitesell等人，1994年). 在大多数情况下，失稳是由于对激酶v-src和bcr-abl所观察到的Hsp90：客户端复合物的破坏(An等人，2000年). GA还破坏了p23的绑定(An等人，2000年;Sullivan等人，1997年)进一步表明抑制剂改变了Hsp90的正常构象。p23:Hsp90复合体的破坏表明GA倾向于在开放状态下结合Hsp90。有证据表明，预制p23:Hsp90复合物的抑制性低于游离Hsp90，进一步证实了这一说法。GA还增加了Hsp90下拉菜单中Hop和Hsp70的存在(An等人，2000年;Sullivan等人，1997年). 虽然GA与Hsp90的开放构象结合，但这种构象与载脂蛋白Hsp90构象不同。根据SAXS测量，GA导致R降低克Hsp90的(Zhang等人，2004年). 在HX-MS实验中，GA的衍生物DMAG和类似GA的抑制剂Radicol导致Hsp90所有三个域中酰胺质子的保护发生变化(菲利普斯等人，2007年). 与载脂蛋白相比，Radicol还增加了Hsp90的蛋白酶敏感性(Nishiya等人，2009年).
其他通过替代机制发挥作用的小分子抑制剂似乎也会导致Hsp90内的整体构象变化。新生霉素是一种与Hsp90的CTD结合的小分子抑制剂(Marcu等人，2000a;Marcu等人，2000b;Soti等人，2002年). 与GA和radicol一样，新生霉素抑制Hsp90与客户或p23复合物的形成，但与GA不同，它也降低了Hsp90对与CTD结合的含有TPR的共同伴侣的亲和力(Allan等人，2006年;Yun等人，2004年). 这些Hsp90复合物的破坏表明新生霉素导致Hsp90内的结构重排，这与GA的变化不同。绿茶中的活性成分表没食子酸儿茶素（ECGG）也直接与Hsp90结合，并作为AhR拮抗剂。与干扰Hsp90与AhR的相互作用相反，ECGG通过稳定Hsp90和AhR之间的相互作用发挥作用(巴勒莫等人，2005年). 所有这些化合物都表明，用小分子影响Hsp90的构象是开发未来治疗方法的可行策略。
结束语
结构动力学在Hsp90的功能中起着重要作用，理解完整的构象系综对于定义Hsp90分子机制至关重要。在ATP酶水解循环中会发生较大的构象变化，构象状态并不是严格由结合核苷酸决定的。相反，核苷酸结合改变了在没有核苷酸的情况下取样的状态之间的构象平衡。体内由于与ATP的弱相互作用，Hsp90还将同时对核苷酸结合态和非结合态进行采样。对于细胞溶质真核生物Hsp90，协同伴侣通过改变平衡来调节Hsp90的构象状态，而微调的调节对于正确的伴侣功能至关重要。其他水平的调控以翻译后修饰的形式存在，如磷酸化和乙酰化，但这些影响的确切性质尚不清楚。其他修改也需要进行调查，以确定其在调节Hsp90中的重要性。破坏Hsp90的构象动力学为治疗癌症、潜在血管疾病和阿尔茨海默病的新疗法提供了一个有吸引力的靶点，目前临床试验中的抑制剂显示出改变Hsp90构象的迹象，从而破坏客户蛋白的结合。
虽然在过去几年中，对Hsp90的机制有了更清晰的了解，但仍存在许多悬而未决的问题，需要调查。首先，客户蛋白与Hsp90相互作用的确切性质在很大程度上没有特征，了解客户蛋白结合如何影响Hsp90的构象以及反之亦然至关重要。这些信息对于理解Hsp90的构象变化如何与客户蛋白的激活相关至关重要。另一个悬而未决的问题是重塑客户蛋白所需能量的来源。由于ATP酶活性较低，并且与发生的构象变化没有强烈耦合，因此不清楚驱动Hsp90构象变化的力来自何处以及客户蛋白中发生的任何后续变化。此外，不同同系物之间存在重要差异，每个同系物唯一地决定了不同条件下每个构象的相对数量。了解平衡是如何建立的，以及改变平衡的功能后果将为Hsp90的分子机制提供关键信息。最终，对Hsp90及其动力学和相互作用的更详细了解将为开发更具针对性的治疗方法铺平道路。
致谢
我们要感谢乌尔里克·博彻、蒂莫西·斯特里特和丹尼尔·索斯沃思对手稿的有益讨论和批判性阅读。
