两种重组负链RNA病毒载体诱导猴免疫缺陷病毒Gag的细胞免疫应答

rNDV/SIVgag的建设和增长。

利用从rVac/SIVgag病毒感染细胞中分离的DNA，通过PCR获得全长SIV-Gag cDNA。Gag cDNA被克隆到插入先前描述的rNDV/B1 cDNA的P和M基因之间的新转录单位(30)（图。​（图1B）。1B年). NDV聚合酶（5′）的潜在基因工程序列-⁴⁶塔加AAAAA⁵⁵-3′）存在于原始Gag cDNA中。通过使用以下寡核苷酸进行定点突变来消除该基因编码信号：SDM（+），5′-³³GAAAGCAGATGAA公司C类T型G公司通用航空公司G公司AAAATTAGGCT公司⁶²-3′; SDM（−），5′-⁶²AGCCTAATTTT公司C类总费用C类A类G公司TTCATCTGCTTTC公司³³-3′. 引物中沉默的核苷酸变化用斜体表示。通过测序证实了所获得的质粒（pNDV/B1-SIVgag）。重组病毒rNDV/SIVgag随后通过上述方法从pNDV/B1-SIVgag中解救出来(30,38). 使用抗SIVmac p27单克隆抗体55-2F12，通过rNDV/SIVgag病毒感染细胞的间接免疫荧光测定SIV Gag蛋白的表达(17)来自Niels Pedersen，通过艾滋病研究和参考试剂项目、艾滋病项目、国家变态反应和传染病研究所、NIH（浓度为35μg/ml的未稀释杂交瘤培养上清液），然后是异硫氰酸荧光素结合抗鼠免疫球蛋白g（IgG）（1:40稀释；DAKO）。

胚胎卵中rNDV/SIVgag的毒力指数。

为了确定rNDV/SIVgag病毒的毒力指数，测定了受感染胚胎的平均死亡时间（MDT）。连续10倍稀释感染性尿囊液（10⁻⁶到10⁻⁸)在五个胚胎卵子中的每一个中接种，并记录由于最小致死剂量导致胚胎死亡的平均时间。

rNDV/SIVgag在鸡胚中的生长动力学。

将鸡胚接种野生型rNDV/B1或rNDV/SIVgag病毒，每个鸡蛋接种100个PFU。病毒滴度（50%组织培养感染剂量[TCID₅₀])用先前描述的免疫荧光分析法测定感染后不同时间点尿囊液中的存在(30).

启动和加强免疫。

rFlu/SIVgag 3号或rFlu/SIVgag 4号(31)用rNDV/SIVgag病毒免疫小鼠。在初始免疫和强化免疫中，5×10²将rFlu/SIVgag 3号或rFlu/SIVgag 4号PFU滴鼻给小鼠，5×10⁷鼻腔、静脉或腹腔注射rNDV/SIVgag的PFU。第一次免疫后3周给予增强剂。

CD8的制备⁺淋巴细胞。

在最后一次免疫后第5天或第30天收集免疫BALB/c小鼠呼吸道的脾脏、颈部和纵隔引流淋巴结，并用于分离淋巴细胞群。通过研磨将三只小鼠的脾池分离成单细胞悬浮液。通过在37°C的DMEM中使用胶原酶和dispase（1 mg/ml；Boehringer Mannheim）的混合物，将三只小鼠的混合淋巴结分离成单个细胞，并摇晃1h。CD8（CD8）⁺这些制剂中的T细胞与大鼠抗鼠CD8a单克隆抗体（5H10-1；Pharmingen，SanDiego，Calif.）孵育。然后用与抗鼠IgG抗体结合的磁性微球对细胞进行阳性筛选（Polyscience，Warrington，Pa.）。

肽。

ELISPOT分析中使用的肽来自艾滋病研究和参考试剂项目（NIH，马里兰州贝塞斯达）。肽3（DINQMLNCVGDHQAA）和肽4（TNILDVKQGPKEPFQ）分别对应于SIV-Gag的185至199和281至295个氨基酸残基。以前发现这些肽含有SIV Gag-特异性CD8识别的CTL表位⁺BALB/c小鼠的T细胞(31).

ELISPOT检测IFN-γ产生细胞。

根据先前描述的方案进行ELISPOT检测抗原特异性CTL(31,51). 简言之，将96孔硝化纤维板（Millipore Corp.，Bedford，MA）涂有100μl磷酸盐缓冲盐水（PBS），每毫升含有5μg抗小鼠γ-干扰素（IFN-γ）单克隆抗体R4（编号R4-6A2；Pharmingen）。在4°C下孵育过夜后，用含有10%FBS的DMEM-高糖培养基（马里兰州罗克维尔市生命科技公司）对微孔进行八次清洗（犹他州洛根市HyClone），并在37°C下培养1小时以上。CD8的两倍稀释系列⁺脾或淋巴结细胞，从5×10开始⁵将每个孔的细胞放入包被孔中，并与10μg肽脉冲的P815细胞共培养。非脉冲P815细胞作为阴性对照。将平板在5%CO中孵育₂培养箱培养30 h。随后，用PBS-Tween 20（0.05%）对平板进行广泛清洗，然后向每个孔中添加0.1 ml 2.5 mg生物素化抗小鼠IFN-γ单克隆抗体XMG1.2（XGX1.2；Pharmingen）/ml。在4°C下培养过夜后，在室温下用过氧化物酶标记的链霉亲和素（1:1000；马里兰州盖瑟斯堡Kirkegaard&Perry Laboratories）培养平板1小时。用PBS-Tween 20和PBS清洗微孔，并添加浓度为1 mg/ml且在50 mM Tris-HCl（pH 7.5）中含有0.015%过氧化氢酶（Sigma）的底物（3,3′-二氨基联苯胺四氢氯化物；Sigma，Saint-Louis，Mo.）。借助显微镜对斑点进行计数。

rNDV/SIVgag病毒在胚胎蛋中的致死性和复制。

为了确定rNDV/SIVgag病毒的毒力指数，对鸡蛋中的MDT进行了测定。rNDV/SIVgag的MDT为146.8小时。相比之下，rNDV/B1的MDT是113小时(1). 我们的结果表明，rNDV/SIVgag在鸡体内具有透镜原性，并且比亲本疫苗株Hitchner B1更弱。然而，尽管复制稍有延迟，但rNDV/SIVgag病毒的滴度与野生型rNDV/B1病毒相当（约10⁸TCID公司₅₀/ml）（图。​（图3三).

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图3。

rNDV/SIVgag在鸡胚中的生长动力学。用100个rNDV/B1或rNDV/SIVgag病毒PFU接种胚胎卵，并在不同时间点（接种后24、48和72小时）采集尿囊液。这些时间点的病毒滴度被确定为TCID₅₀通过免疫荧光分析。简单地说，含有70%至80%融合Vero细胞的96个平板被连续10倍尿囊液稀释液感染（每次稀释4孔）。将细胞孵育2天，然后用含有0.1%Triton X-100的2.5%甲醛固定。使用抗NDV兔血清和异硫氰酸荧光素结合的抗兔IgG观察病毒蛋白。

在用rNDV/SIVgag免疫的小鼠中，对rVac/SIVgag-激发感染的保护。

为了评估rNDV/SIVgag是否诱导SIV-Gag特异性抗病毒细胞免疫反应，我们用该重组病毒免疫BALB/c小鼠。由于SIV不会在小鼠体内复制，我们使用表达SIV-Gag的痘苗病毒作为替代挑战病毒。在这些试验中，先前已经表明，表达外来抗原的痘苗病毒的复制抑制是由CTL介导的(7). 用5×10免疫三组小鼠⁷鼻内、腹膜内或静脉注射rNDV/SIVgag的PFU。免疫接种一次或两次。与rNDV/B1病例一样，免疫小鼠没有显示体重减轻或任何其他疾病迹象，表明Gag基因的插入并没有增加NDV在小鼠中的致病性（数据未显示）。在单次或双次免疫三周后，用rVac/SIVgag或Vac/wt病毒进行挑战性感染。在一项初步试验中，幼鼠通过鼻内或静脉感染痘苗病毒，5天后在肺部、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胰腺和卵巢中测定痘苗病毒滴度。痘苗病毒生长到滴度高于10⁴肺、卵巢和脾脏中的PFU。特别是，病毒通过两种给药途径在肺部复制到高滴度（数据未显示）。然后，我们在攻击后5天测定了rNDV/SIV gag-免疫小鼠肺部的痘苗病毒滴度（图。​（图44).

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图4。

用rNDV/SIVgag病毒免疫小鼠的挑战实验。rNDV/SIVgag病毒（5×10⁷PFU）接种一次（一次）或两次（两次）给三组小鼠，每组三只，分别经鼻内、腹腔内或静脉注射。对照组小鼠接种PBS。最后一次接种三周后，小鼠经鼻或静脉感染5×10⁶Vac/wt或rVac/SIVgag病毒的PFU。接种痘苗病毒五天后，处死小鼠，测定肺部痘苗病毒滴度。用1 ml PBS中的均质肺测定CV-1细胞中的痘苗病毒滴度。

通过鼻腔注射rNDV/SIVgag而不是通过静脉注射或腹腔注射单独免疫小鼠，显示出对rVac/SIVgap的抗病毒反应（图。​（图4A），4A级)经鼻（粘膜）和静脉（全身）激发后第5天，肺部rVac/SIVgag病毒滴度降低约1 log即可证明。用rNDV/SIVgag进行第二次鼻内免疫增加了Gag特异性抗病毒免疫水平，导致rVac/SIVgap病毒滴度减少约3 log（图。​（图4B）。4B类). rNDV/SIVgag腹膜内免疫在调节痘苗病毒滴度降低方面效率较低，尤其是在粘膜激发后。最后，静脉免疫只导致双重免疫小鼠全身激发后rVac/SIVgag病毒滴度降低1 log。rVac/SIVgag复制的抑制依赖于Gag的表达，因为当动物受到Vac/wt攻击时，未观察到病毒滴度降低。此外，野生型rNDV/B1病毒对rVac/SIVgag攻击或Vac/wt攻击均未诱导任何保护，如表所示​表11.

因此，我们得出结论，在本研究中使用的所有免疫方案中，rNDV/SIVgag鼻内双重免疫在诱导抗病毒Gag特异性免疫反应方面最为有效，该免疫反应可在小鼠粘膜或全身挑战后抑制rVac/SIVgap病毒的复制。值得注意的是，当在免疫远端部位（例如卵巢）静脉注射疫苗后测量痘苗病毒滴度时，用rNDV/SIVgag进行鼻内双重免疫也会导致rVac/SIVgap病毒滴度的特定降低（约1 log）（数据未显示）。这些结果表明，鼻内rNDV/SIVgag诱导Gag特异性T细胞反应，阻止病毒在肺部和远处器官复制，尽管效率较低。

与rNDV/SIVgag和rFlu/SIVgag 3号联合免疫可增强小鼠的保护性Gag特异性抗病毒反应。

以前有报道称，rFlu/SIVgag 3号和rFlu/SIVgag 4号病毒在小鼠中诱导了强烈的细胞抗Gag免疫反应，并且这种免疫反应通过表达相同抗原的异源病毒rVac/SIVgac的增强剂进一步增强(31). 因此，我们现在确定当两种异源载体用于联合免疫时，rFlu/SIVgag是否能够增强rNDV/SIVgag诱导的免疫反应。为此，使用rNDV/SIVgag或rFlu/SIVgag（3号或4号）病毒对小鼠进行鼻内免疫。启动三周后，用相应的异源病毒增强免疫小鼠。然后在增强后3周用rVac/SIVgag或Vac/wt病毒攻击小鼠。免疫小鼠显示rVac/SIVgag减少，但肺中Vac/wt病毒复制没有减少（图。​（图5）。5). 有趣的是，用rNDV/SIVgag启动并用rFlu/SIVgag 3号增强的小鼠与接受同源启动并增强免疫的小鼠相比，甚至与接受反向免疫的小鼠（即用rFlu/SIVgag3号免疫）相比，对rVac/SIVgac生长的抑制最强，然后接种rNDV/SIVgag。因此，先用rNDV/SIVgag启动免疫，然后用rFlu/SIVgag 3号病毒加强免疫，结果约为10⁶-与PBS对照小鼠相比，激发后第5天rVac/SIVgag滴度降低了两倍（肺部平均滴度为10^2.6与10相比^8.6PFU/ml）（图。​（图5）。5). 相比之下，rFlu/SIVgag 3号启动后，rNDV/SIVgag增加，rVac/SIVgac增长减少了约100倍（平均滴度为10^7.1PFU/ml）（图。​（图5）。5). 当rFlu/SIVgag 4号作为增强剂用于rNDV/SIVgag阳性小鼠时，也获得了类似的结果，尽管其保护水平低于rFlu/SIVgag 3号免疫小鼠（平均滴度为10^4.7PFU/ml）。rFlu/SIVgag病毒之间的效力差异可能代表在相应的Gag序列中存在或不存在最佳CTL表位。如图所示。​图4，4rNDV/SIVgag双重免疫可使rVac/SIVgap复制减少1000倍以上（平均滴度为10^5.3PFU/ml），而rFlu/SIVgag双重免疫只会略微降低rVac/SIVgag的生长（图。​（图5）。5). 这些结果表明，在所测试的主要疫苗接种方案中，先用rNDV/SIVgag启动，然后用rFlu/SIVgag 3号增强，是最有效的疫苗组合，导致高水平诱导针对rVac/SIVgap挑战的保护性抗病毒免疫。rFlu/SIVgag的增效作用取决于Gag抗原的表达，因为野生型流感病毒免疫小鼠后，rVac/SIVgag滴度没有非特异性降低(31).

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图5：。

用rNDV/SIVgag病毒和/或rFlu/SIVgag病毒免疫小鼠的挑战性实验。rNDV/SIVgag病毒（5×10⁷PFU），每个rFlu/SIVgag病毒（5×10²PFU），或rFlu/SIVgag 3号和rFlu/SIVgag 4号病毒（5×10）的混合物²PFU）经鼻给药给三组小鼠。对照小鼠接种PBS。接种三周后，用rNDV/SIVgag病毒（5×10⁷PFU），每个rFlu/SIVgag病毒（5×10²PFU）或rFlu/SIVgag病毒的混合物（5×10²PFU）。免疫后3周，小鼠经鼻感染5×10⁶Vac/wt或rVac/SIVgag病毒的PFU。接种痘苗病毒五天后，处死小鼠，测定肺部痘苗病毒滴度。

用rNDV/SIVgag免疫后诱导对SIV Gag的细胞免疫反应。

为了量化用rNDV/SIVgag和rFlu/SIVgag病毒免疫的小鼠对SIV-Gag诱导的细胞免疫反应，我们进行了ELISPOT分析。在增强后第5天和第30天获取脾脏、颈部和纵隔淋巴结，以及Gag特异性CD8的数量⁺对每个组织中产生IFN-γ的细胞进行计数，以分析全身和局部细胞免疫。颈部和纵隔淋巴结属于粘膜相关淋巴组织，可排出呼吸道粘膜组织中的CTL(33). CD8（CD8）⁺SIV Gag肽特异性IFN-γ产生细胞(31)在免疫小鼠的脾脏和淋巴结中均检测到，表明rNDV/SIVgag和/或rFlu/SIVgag免疫诱导了针对Gag蛋白的全身和局部细胞免疫反应（图。​（图6）。6). 通过rNDV/SIVgag启动和rFlu/SIVgag增强进行的免疫诱导的IFN-γ产生细胞数量高于疫苗接种的相反顺序（图。​（图6）。6). 这些结果与在rNDV/SIVgag阳性和rFlu/SIVgag阳性小鼠中观察到的rVac/SIVgap复制抑制增加相关（图。​（图5）。5). 尽管Gag-specific CD8的数量有所减少⁺从增强后第5天到第30天，仍能检测到大量产生IFN-γ的细胞，这表明rNDV/SIVgag和rFlu/SIVgag诱导的系统和局部细胞免疫反应至少维持了1个月。

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图6。

SIV Gag肽特异性IFN-γ产生CD8的定量⁺接受初始和增强免疫的小鼠中的T细胞。每组3只小鼠经鼻接种rFlu/SIVgag 3号（5×10）²PFU），rFlu/SIVgag编号4（5×10²PFU）和rNDV/SIVgag（5×10⁷PFU）。在增强后5天或30天采集脾细胞（A）和来自颈部和纵隔淋巴结（B）的淋巴细胞（B）。CD8（CD8）⁺在ELISPOT分析中，选择T细胞并与特定Gag肽脉冲P815细胞孵育。Gag肽3和4用于刺激CD8⁺分别来自rFlu/SIVgag 3号和rFlu/SIVgag 4号病毒免疫动物的T细胞。作为对照，CD8⁺使用来自接种PBS小鼠脾脏和淋巴结的细胞。代表了每百万个细胞中IFN-γ分泌细胞相对于Gag肽的数量。

我们非常感谢Therion Biologicals的Gómez-Yafal，感谢他慷慨提供Vac/wt和rVAC/SIVgag。我们还感谢Richard Cadagan和Neva Morales提供了出色的技术援助。SIV Gag抗体和肽是通过NIH艾滋病研究和参考试剂项目，NIAID，NIH艾滋病司获得的。

这项工作得到了NIH对A.G.-S.和P.P.的部分资助。Y.N.得到了上原纪念生物医学研究基金会（Uehara Memorial Bio-Medical Research Foundation）的资助。