《维罗尔杂志》。2004年9月；78(17): 9215–9223.
预防二次感染的潜伏期缺陷γ-疱疹病毒的产生
,1 ,2 ,1 ,2 ,2 ,2 ,1,三，4和1,2,4,5,*
塔米·里卡博
分子和医学药理学系，2医学部，三加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，4Jonsson综合癌症中心，5加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所1
海伦·J·布朗
分子和医学药理学系，2医学部，三加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，4Jonsson综合癌症中心，5加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所1
迪安·马丁内斯·古兹曼
分子和医学药理学系，2医学部，三加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，4Jonsson综合癌症中心，5加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所1
吴廷廷
分子和医学药理学系，2医学部，三加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，4Jonsson综合癌症中心，5加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所1
Leming Tong公司
分子和医学药理学系，2医学部，三加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，4Jonsson综合癌症中心，5加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所1
福曲余
分子和医学药理学系，2医学部，三加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，4Jonsson综合癌症中心，5加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所1
史蒂文·科尔
分子和医学药理学系，2医学部，三加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，4Jonsson综合癌症中心，5加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所1
任荪
分子与医学药理学系，2医学部，三加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，4Jonsson综合癌症中心，5加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所1
分子与医学药理学系，2医学部，三加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，4Jonsson综合癌症中心，5加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所1
*通讯作者。通讯地址：加利福尼亚大学洛杉矶分校分子和医学药理学系，23-170 CHS，加利福尼亚州洛杉矶Le Conte大道10833号，邮编90095-1735。电话：（310）794-5557。传真：（310）825-6267。电子邮件：ude.alcu.tendem@nusr. 收到日期：2004年1月6日；2004年4月22日接受。
摘要
卡波西肉瘤相关疱疹病毒和小鼠γ-疱疹病毒-68（MHV-68）可引起潜在感染，并与各种恶性肿瘤相关。它们是γ-2疱疹病毒亚家族的成员，编码一种复制和转录激活物RTA，这对于阻断潜伏期和启动体外病毒裂解周期是必要和足够的。我们构建了一种过度表达RTA的重组MHV-68病毒。该病毒在体内外具有更快的复制动力学，建立潜伏期不足，在小鼠中表现出减少单核细胞增多症样疾病的发展，并能保护小鼠免受野生型MHV-68的攻击。本研究使用MHV-68作为体内模型系统，证明RTA在控制病毒潜伏期方面起着关键作用，并表明潜伏期是病毒在体内发病的决定因素。
卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV，或HHV-8）和小鼠γ-疱疹病毒-68（MHV-68）是疱疹病毒（鼠疫病毒）γ-2亚家族的成员，具有建立潜伏感染的能力，并与各种恶性肿瘤有关，如卡波西肉瘤和B细胞淋巴瘤(2,4,5,22). 由于体外培养KSHV很困难，并且缺乏直接研究KSHV的体内系统，MHV-68已被用作γ-疱疹病毒感染的体内外模型(15,16). 感染MHV-68的小鼠在B细胞、巨噬细胞和树突状细胞中发生潜伏感染(5,22,27). 在潜伏感染的高峰期，由于脾脏大小和细胞数量的增加，小鼠会发展出一种类似单核细胞增多症的疾病，称为脾肿大(24). 一小部分小鼠也会发生B细胞淋巴瘤(20). 因此，MHV-68可用于研究γ-疱疹病毒在体内的潜伏期和发病机制。
病毒复制和转录激活物（RTA）在革兰病毒中是保守的(7,19,30,31). 众所周知，KSHV RTA和MHV-68 RTA足以从潜在感染细胞中激活各自的病毒(6,12,19,29,30). RTA对体外MHV-68从头感染也是必要的(14,29). 因此，RTA在体外发挥着γ-2疱疹病毒亚家族生命周期的关键调节器的作用。然而，RTA是否控制体内病毒潜伏期的问题尚未解决。为了解决这一问题，我们构建了一种组成型过表达RTA的重组MHV-68病毒（C-RTA/MHV-68）。我们对病毒的体外和体内复制动力学进行了表征，并确定了其在体内建立潜伏期和诱导潜伏期相关发病机制的能力。我们还测试了其保护小鼠免受野生型（WT）MHV-68后续感染的能力。
（2002年卡波西肉瘤相关疱疹病毒及相关病原体国际研讨会、2003年国际疱疹病毒研讨会和2003年卡波济肉瘤相关肝炎病毒及相关毒剂国际研讨会提供了初步数据。）
材料和方法
病毒、细胞和斑块分析。
MHV-68病毒最初从美国型培养物收集（VR1465）中获得。以tw25（GFP/MHV-68）为亲本病毒，通过传统同源重组构建C-RTA/MHV-68(29). RTA基因仅包含150bp的开放阅读框49（ORF49）区域，中心插入终止密码子。该插入物是通过PCR使用pCMVFLAG/Rta结构作为模板生成的(29)以及以下几组引物（黑体字的终止密码子）：pFLAG/FLAG（5′-TCTCATGCATTTGATCTACTGGACTACTAC-3′）和TMR6（−49）R（5′-GAACATGATTGA公司TGAAAT ACTGATCTGTC-3′）；TMR6（−49）F（5′-TTTCA）三氯乙酸ATCAATGTTCCCTAGTATC TATGAC-3′）和pFLAG/polyA（5′-TTCTCGGTACCGATATCGTACCCAATTCAACAG-3′）。这些产物是带有引物R3TR/NotI（5′-TCTCGGTACGCGCCGACAGCGCGACAGTGCTCTGAC-3′）和R4的第三次PCR的模板(30)生成克隆到pFLAG-CMV2的Not1和XbaI位点的插入物，以生成pFLAG/MRTA（−49）。将巨细胞病毒（CMV）启动子、RTA基因盒和来自pFLAG/MRTA（−49）的poly（A）信号克隆到tw76中进行同源重组。如前所述进行病毒感染、病毒生长和斑块分析(30).
Northern和Southern印迹分析。
进行RNA和DNA提取、印迹和探针合成(30). 对于Northern杂交，探针由病毒DNA或细胞DNA的PCR产生的DNA片段制成。对于Southern blot，DNA用SmaI酶切过夜，并通过PCR从病毒DNA和以下引物生成探针DNA：tRNA1（5′-CCGACATCGATGCAAATGTT-3′）和tRNA2（5′-CTACACATGAAAATCCTGTGAG-3′）。如前所述进行杂交、清洗和放射性检测(30). 使用ImageQuant软件（Molecular Dynamics，Sunnyvale，Calif.）对RNA进行量化。
增长曲线。
BHK-21细胞（幼仓鼠肾细胞）接种于2×105单级（感染多重性，5）和1×10的每孔细胞数5多阶段生长曲线的每孔细胞数（感染倍数，0.05）。收集细胞和上清液，冷冻和解冻三次，并进行三次斑块分析。
瞬时转染。
293个T细胞接种在24孔板（105每个孔的细胞数）和总计600 ng DNA，包括5 ng雷尼利亚以荧光素酶构建物为对照，通过磷酸钙法每孔转染。用10 ng 57pLuc转染细胞(11)和4 ng RTA或10 ng M3Luc(13)和5 ng RTA。表达NF-κb p65亚单位的质粒(1)转染到指定的样本中。转染后24小时收获细胞提取物，并如前所述进行分析(1).
实时PCR。
根据制造商的说明，使用DNeasy组织试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）从脾细胞提取基因组DNA。使用了以下用于MHV-68 M9基因的引物和探针：M9-160F引物（5′-GTCAGGCCCCAGTCCCGTA-3′）、M9-226R引物（5'-TGGCCCTCT ACCTCTGTGA-3′）和M9-179T探针5′-[6-FAM]CACAGGCCTCCCTTTGAGAA[Tamra～Q]-3′（QIAGEN）。反应体积为20μl，每个引物浓度为900 nM，探针浓度为250 nM，Taqman Universal PCR Master Mix（加州应用生物系统公司）。使用Bio-Rad iCycler进行扩增和检测。每个反应不包括模板对照，每个样品分析300 ng DNA，一式两份。通过测量1到10获得标准曲线6在300ng未感染的脾细胞DNA的背景上包含MHV-68基因组的细菌人工染色体的拷贝。检测限为10拷贝/300 ng基因组DNA。
小鼠、肺滴度和再激活分析。
3至4周龄的雌性BALB/c小鼠（马萨诸塞州威明顿市查尔斯·里弗实验室）经鼻内感染每种病毒500个PFU，或模拟感染总体积为20μl的Dulbecco改良Eagle's培养基。我们确定500 PFU是一种大量的病毒，因为我们成功地用1个MHV-68 PFU感染了小鼠，证实了先前的观察结果(23). 通过在1ml Dulbecco改良Eagle培养基中使肺匀浆并进行三次独立的斑块测定来测定肺中的病毒滴度。对于体外极限稀释试验，10三BHK-21细胞每孔接种在96 well板中。采集脾细胞(21)，并对脾细胞进行连续两倍稀释，从10开始6脾细胞，每稀释24孔。7天后，对每个孔进行细胞病变效应（CPE）评估，并按稀释度确定每24孔的CPE百分比。如前所述，进行感染中心分析，包括预成型病毒的评估(21). 预成型病毒检测中的大多数样本产生了0个感染中心，少数样本显示每10个感染中心中有1到2个7脾细胞。
统计分析。
通过对测井曲线上显示CPE的井百分比进行多元回归，分析了极限稀释分析10细胞数/孔，实验效果由细胞数和实验组的相互作用决定。所有其他实验均使用两样本不等方差进行分析t吨测试。
结果
RTA过表达导致体外MHV-68复制动力学加快。
RTA基因（ORF50）的基因组结构包含一个内含子，其中包括ORF49(30). 我们通过删除大多数内含子来构建RTA表达盒，以保留RTA表达，但阻止ORF49的任何表达（图。). 在转录激活和再激活分析中，从该盒表达的RTA与从全长基因组克隆表达的RTA一样活跃，并且比从cDNA克隆表达的更活跃（数据未显示）。该RTA表达盒、CMV启动子和多聚腺苷酸化信号被克隆到tw76中。tw76质粒包含MHV-68基因组左端的序列，用于同源重组。
C-RTA/MHV-68病毒的构建和确认。（A） 该图表示MRTA的结构（−49).星号表示终止密码子插入ORF49的位置，显示了用于形成RTA（ORF50）mRNA的剪接供体（s.d.）和剪接受体（s.a.）位点。（B） 该图显示了MHV-68病毒基因组独特区域左端的结构。箭头表示八个tRNA-like序列（t.1至t.8）。实心黑框表示该区域中的两个ORF，即M1和M2，方向如上所示。条纹框表示末端重复（TR）区域。开放框表示由人类CMV启动子驱动的增强GFP（GFP/MHV-68）或由人类CMV启动子驱动（C-RTA/MHV-68，FLAG/RTA）的表达盒，其方向如上所示。图中显示了用于探测Southern印迹的MHV-68的核苷酸区域（核苷酸51至6298）（如C所示）。（C） 通过Southern印迹法确认C-RTA/MHV-68。病毒基因组左端的SmaI位点用箭头表示。（D） 使用针对全长内源性RTA的探针进行Northern印迹，以确定RTA的过度表达。使用针对H1细胞mRNA的探针，以确保RNA负载相等。（E）使用ImageQuant从面板D的Northern blot测量mRNA水平的定量。对于每个样品，所获得的值被归一化为H1带。
将tw76/RTA质粒线性化并与GFP/MHV-68病毒DNA共转染到BHK-21细胞中（图。). GFP/MHV-68病毒基因组左端含有绿色荧光蛋白（GFP）表达盒(29). 对病毒后代进行GFP表达缺失筛查。经过三轮菌斑纯化后，用与病毒基因组左端杂交的探针进行Southern印迹，确认RTA表达盒的正确插入（图。). 该区域似乎没有任何其他突变。接下来，我们通过Northern印迹证实，RTA转录物被C-RTA/MHV-68过度表达（图。). 这两种重组病毒都保留了内源性RTA基因，该基因在裂解复制过程中受到严格调控并以低水平表达(13). 在感染后4小时检测到RTA转录物，并且在每个时间点，C-RTA/MHV-68感染细胞的RTA转录水平比GFP/MHV-68受感染细胞的高15-20倍（图。).
接下来，我们测量了C-RTA/MHV-68与WT-MHV-68（WT/MHV-68）病毒和GFP/MHV-68相比的体外复制能力。在感染后的每个时间点，C-RTA/MHV-68在单步生长曲线中复制到与WT/MHV-68和GFP/MHV-68相似的水平（图。). 相比之下，在多步骤生长曲线中，C-RTA/MHV-68表现出更快的动力学，在感染后36小时，滴度达到WT/MHV-68或GFP/MHV-68的40-66倍（图。). 我们还观察到，C-RTA/MHV-68形成的斑块明显大于WT/MHV-68或GFP/MHV-68（图。). 使用病毒基因阵列检测C-RTA/MHV-68与GFP/MHV-68病毒的基因表达模式。在检测的所有时间点，与GFP/MHV-68相比，C-RTA/MHV-68显著上调了阵列上85个病毒基因中的大多数(13). 因此，C-RTA/MHV-68对RTA的过度表达增加了病毒基因的表达，加速了病毒的裂解周期，从而导致更快的复制动力学和更大的斑块大小。
C-RTA/MHV-68的体外动力学。（A） C-RTA/MHV-68、WT/MHV-68和GFP/MHV-68的单步生长曲线。（B） C-RTA/MHV-68、WT/MHV-68和GFP/MHV-68的多步生长曲线。（C） 三种病毒的菌斑形态。图中的每个孔代表对每种病毒具有类似滴度的BHK-21细胞进行的斑块分析的一个孔。
RTA过度表达会导致体内更快的复制动力学和潜伏期缺陷。
小鼠鼻内感染MHV-68会导致肺上皮细胞的急性感染，感染后13天免疫系统会清除该感染(28). 在感染后14天，病毒在脾B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肺上皮中建立了显著的潜伏感染(5,18,22). 观察到脾脏重量显著增加（脾肿大），这是由脾脏淋巴细胞扩增引起的，与单核细胞增多症类似(24). 基于这些观察结果，我们对C-RTA/MHV-68病毒进行了体内表征。将每种病毒的500个PFU经鼻感染BALB/c小鼠，并在感染后的不同时间从均质肺中测定病毒滴度。感染后第三天，C-RTA/MHV-68的滴度是WT/MHV-68的18倍（图。). C-RTA/MHV-68病毒滴度的下降速度也比WT/MHV-68快，表明C-RTA/MHV-68的清除速度更快。因此，尽管两种病毒的滴度相似，但在体内急性感染期间，C-RTA/MHV-68病毒的整体动力学比WT/MHV-68病毒更快。
C-RTA/MHV-68的体内特性。（A） C-RTA/MHV-68和WT/MHV-68的体内复制动力学。数据是从每个时间点的六只老鼠中编译而成的。虚线，检测限。（B） 比较C-RTA/MHV-68感染小鼠和WT/MHV-68感染小鼠的感染中心分析。实线，每组小鼠的平均值。（C） 比较C-RTA/MHV-68感染小鼠和WT/MHV-68感染小鼠的离体限制性稀释再激活试验。（D） C-RTA/MHV-68感染小鼠和WT/MHV-68感染小鼠病毒基因组的实时PCR定量。虚线，检测限；实线，各组小鼠的平均值。（E） C-RTA/MHV-68感染小鼠、WT/MHV-68感染小鼠和未感染（UI）小鼠脾脏大小的定量。实线，每组小鼠的平均值。在B组到E组的试验中，C-RTA/MHV-68感染小鼠和WT/MHV-68感染小鼠的值之间的统计差异为P（P）< 0.0001. 面板B至E中的所有数据均来自两个独立实验，每个病毒共有10至12只小鼠。
为了评估C-RTA/MHV-68感染小鼠的潜伏期水平，在感染后20天采集脾细胞。我们通过使用感染中心分析来测定潜伏期，该分析测量了每群B细胞中能够重新激活的潜伏病毒的数量(22). 平均而言，感染C-RTA/MHV-68的小鼠的感染中心比感染WT/MHV-68的小鼠少约68倍（图。). 三只感染C-RTA/MHV-68的小鼠没有感染中心的证据，表明没有可检测到的潜伏病毒。为了证实这一数据，我们对每个样品进行了体外限制稀释再激活试验（图。). 总的来说，结果支持感染中心分析。在该试验中，12只C-RTA/MHV-68感染小鼠中有4只没有显示任何病毒重新激活的证据。最近有报道称，MHV-68的左端基因不稳定，可能导致C-RTA基因盒的丢失(三). 因此，我们从其他八只C-RTA/MHV-68感染小鼠中回收了重新激活的病毒，并通过Southern印迹法检测C-RTA过表达盒。我们确定，三只感染C-RTA/MHV-68的小鼠潜伏感染了保留盒的C-RTA/MHV-68，四只潜伏感染C-RTA/MHV-68和C-RTA盒被删除的重组病毒的混合物，一只潜伏只感染了删除了C-RTA盒带的重组病毒。这一结果表明，删除RTA过表达盒存在强大的选择压力，以便病毒能够建立潜伏期，并进一步支持RTA在调节病毒生命周期之间的平衡方面的作用。
为了确定C-RTA/MHV-68感染的脾细胞明显缺乏再激活是否是由于缺乏潜伏病毒感染或潜伏病毒本身无法再激活所致，我们通过实时PCR定量了每个脾细胞样本的病毒基因组数量（图。). 实时PCR检测的检测限为每300 ng脾细胞DNA 10个拷贝（～105脾细胞）。总的来说，感染C-RTA/MHV-68的小鼠的潜伏病毒基因组比感染WT/MHV-68的小鼠少约20倍。表现出最高基因组拷贝数的C-RTA/MHV-68感染小鼠是潜在感染删除C-RTA过表达盒的重组病毒或具有全长和删除重组病毒混合群的个体。通过实时PCR，只携带C-RTA/MHV-68的小鼠的病毒基因组数量无法检测到。这表明，混合病毒小鼠中较高的基因组拷贝数可归因于删除了C-RTA过表达盒的重组体。我们还对感染后早期时间点的脾细胞DNA进行了实时PCR。C-RTA感染小鼠的潜伏病毒基因组数量无法检测到，或始终低于WT/MHV-68感染小鼠（数据未显示）。这证实了C-RTA/MHV-68在建立潜伏期方面存在缺陷，并且没有在更早的时间点建立潜伏期。因此，RTA的过度表达显著降低了MHV-68建立潜伏期的能力。
由于脾肿大是与MHV-68感染相关的显著病理事件，我们检查了受感染的小鼠是否出现了这种情况。与WT/MHV-68感染小鼠相比，C-RTA/MHV-68感染小鼠的脾肿大显著减轻（图。). 由于潜伏期的建立与脾肿大有关，这些结果与再激活试验的结果相关。因此，C-RTA/MHV-68病毒的致病性明显低于WT/MHV-68病毒，并且潜伏期的建立对于脾肿大的发展是必要的。
潜伏期缺陷型MHV-68保护小鼠免受WT/MHV-68的攻击。
γ-疱疹病毒潜伏期与各种恶性肿瘤的发生有关。因此，γ-疱疹病毒疫苗的目标是在不产生潜在感染的情况下充分防止接触。先前试图通过使用针对单个裂解或潜伏病毒表位的疫苗来预防MHV-68感染，以减少早期潜伏的数量，但未能成功预防潜伏的建立(10,17,25,28). 然而，一种本身没有潜伏期但具有保护性的病毒可能是一种有希望的疫苗候选。因此，我们测试了C-RTA/MHV-68是否可以防止WT/MHV-68的后续感染。小鼠被500个C-RTA/MHV-68 PFU感染或模拟感染。在感染后30天，用500PFU的WT/MHV-68对小鼠进行鼻内激发或模拟激发，并在激发后5天和7天测量肺部的病毒滴度（图。). 感染后7天是小鼠感染500个WT/MHV-68 PFU时肺部急性病毒复制的高峰时间（图。). 提前一个时间点（第5天），因为免疫系统可能能够在挑战性感染中更快地清除病毒。在这两个时间点，之前感染C-RTA/MHV-68的小鼠的病毒滴度达到或低于检测结果（图。). 我们还对激发20天后的脾细胞进行了感染中心分析，发现用WT/MHV-68攻击的C-RTA/MHV-68感染小鼠没有感染中心的证据（图。). 相比之下，受到攻击的模拟感染小鼠平均每10只中有409个感染中心7脾细胞。我们还进行了体外限制稀释试验。用WT/MHV-68攻击的C-RTA/MHV-68感染小鼠没有病毒重新激活的证据。相反，受到攻击的模拟感染小鼠的再激活频率约为1/2×105电池（图。). 然后通过实时PCR分析脾细胞（图。). 与模拟感染和攻击的小鼠相比，受到攻击的C-RTA/MHV-68感染小鼠的潜伏病毒基因组拷贝数显著减少。四只受到攻击的C-RTA/MHV-68感染小鼠中，有三只的病毒基因组拷贝数低于检测结果，所有四只小鼠的潜伏病毒基因组数量与模拟攻击的感染小鼠的数量相似。此外，模拟感染和激发的小鼠比激发的C-RTA/MHV-68感染的小鼠脾肿大明显更多（图。). 因此，C-RTA/MHV-68感染能够保护小鼠免受急性病毒感染、WT/MHV-68潜伏期的建立以及接种后30天潜伏期相关发病机制的发展。
接种C-RTA/MHV-68可预防急性病毒感染和潜伏期的建立。C-RTA/MHV-68感染小鼠或模拟感染小鼠在激发后5（A）天和7（B）天肺中的病毒滴度。模拟感染小鼠和C-RTA/MHV-68感染小鼠的激发值之间的统计差异为P（P）两个时间点均<0.0001。虚线，检测限。（C） 感染中心试验比较C-RTA/MHV-68感染小鼠和模拟感染小鼠在攻击后20天的表现。模拟感染小鼠和C-RTA/MHV-68感染小鼠的激发值之间的统计差异为P（P）= 0.0003. （D） 在激发后20天对脾细胞进行的离体限制性稀释试验。模拟感染小鼠和C-RTA/MHV-68感染小鼠受到攻击后的统计差异为P（P）= 0.0003. （E） 脾细胞中病毒基因组的实时PCR定量。实线表示各组小鼠的平均值。受到攻击的模拟感染和C-RTA/MHV-68感染小鼠的数值之间的统计差异为P（P）= 0.0001. （F） 挑战后20天小鼠和未感染小鼠脾脏大小的定量。模拟感染小鼠和C-RTA/MHV-68感染小鼠受到攻击后的数值之间的统计差异为P（P）< 0.0001. 对于面板A至F，每组有四只小鼠，实线表示每组小鼠数值的平均值。M+WT，模拟感染WT/MHV-68小鼠；C+M、C-RTA/MHV-68感染小鼠及模拟激发；C+WT、C-RTA/MHV-68感染小鼠用WT/MHV-68攻击；UI，未感染小鼠。
然后，我们在感染C-RTA/MHV-68后90天通过激发和模拟激发小鼠来确定保护的持续时间。与之前一样，在攻击后5天和7天，C-RTA/MHV-68感染小鼠受到保护，免受急性病毒感染（图。). 当我们进行感染中心试验或限制稀释试验时，在C-RTA/MHV-68感染小鼠中没有检测到任何活化病毒（图。). 通过实时PCR，来自C-RTA/MHV-68感染小鼠的所有激发样本均低于检测结果，并且这些小鼠的脾肿大程度明显低于模拟感染小鼠的激发样本（图。). 我们分析了挑战后2个月的小鼠，并且C-RTA/MHV-68感染的小鼠被攻击后无法检测到潜伏病毒基因组，而模拟感染的小鼠则被攻击后具有显著水平的潜伏病毒基因（图。). 因此，C-RTA/MHV-68可以对急性病毒复制、潜伏期的建立和WT/MHV-68引起的脾肿大提供长期保护。
WT/MHV-68在初次感染后90天激发。C-RTA/MHV-68感染小鼠或模拟感染小鼠在攻击后5（A）和7（B）天肺部的病毒滴度。模拟感染小鼠和C-RTA/MHV-68感染小鼠被激发后的数值之间的统计差异为P（P）两个时间点均<0.0001。虚线，检测限。（C） 感染中心试验比较C-RTA/MHV-68感染小鼠和模拟感染小鼠在攻击后20天的表现。受到攻击的模拟感染和C-RTA/MHV-68感染小鼠的数值之间的统计差异为P（P）< 0.0001. （D） 激发20天后对脾细胞进行体外限制稀释试验。模拟感染小鼠和C-RTA/MHV-68感染小鼠被激发后的数值之间的统计差异为P（P）< 0.0001. （E） 脾细胞中病毒基因组的实时PCR定量。模拟感染小鼠和C-RTA/MHV-68感染小鼠受到攻击后的数值之间的统计差异为P（P）< 0.0001. （F） 挑战后20天小鼠和未感染小鼠脾脏大小的定量。模拟感染小鼠和C-RTA/MHV-68感染小鼠被激发后的数值之间的统计差异为P（P）=0.001。对于面板A至F，每组有五只小鼠，实线表示每组小鼠数值的平均值。（G） 挑战后2个月小鼠脾细胞病毒基因组的实时PCR定量。模拟感染小鼠和C-RTA/MHV-68感染小鼠受到攻击后的数值之间的统计差异为P（P）= 0.05. M+WT，用WT/MHV-68攻击的模拟感染小鼠；C+M、C-RTA/MHV-68感染小鼠及模拟激发；C+WT、C-RTA/MHV-68感染小鼠用WT/MHV-68攻击；UI，未感染小鼠。
MHV-68 RTA的过度表达克服了NF-κB对RTA应答启动子的抑制。
接下来，我们探讨了C-RTA/MHV-68无法建立潜伏期的机制。研究表明，NF-κB的p65亚单位在体外控制KSHV-和EB病毒感染的B细胞系中RTA的表达和功能中发挥作用(1). 抑制NF-κB导致B细胞中的裂解基因表达。相反，NF-κB在允许细胞中的过度表达通过RTA抑制MHV-68的复制和转录激活。研究还表明，RTA的过度表达可以克服体外KSHV和EB病毒RTA应答启动子上p65的抑制(1). 我们确定MHV-68 RTA应答启动子是否也是如此。我们用MHV-68 ORF57启动子（57pLuc）或MHV-68 M3启动子（M3Luc）以及表达MHV-68 RTA或p65的各种质粒转染293个T细胞。这两种启动子都被RTA激活，并且这种激活被p65抑制（图。). 然而，这种抑制可以通过RTA的过度表达来克服（图。). 只需要增加10倍的RTA就可以释放出p65对ORF57启动子一半以上的抑制，只需要增加4倍的RTA就可以克服对M3启动子的类似抑制。因此，我们的模型是，C-RTA/MHV-68过度表达RTA可使病毒克服细胞抑制因子并规避潜伏期的建立。
RTA的过度表达可以克服NF-κB对RTA启动子的抑制。用启动子结构体57pLuc或M3Luc转染293T细胞。将不同数量的RTA和表达NF-κb p65亚单位的质粒与启动子构建物共同转染到所示样品中。
讨论
建立潜伏期的能力是疱疹病毒的一个特征。以前的研究表明，KSHV和MHV-68的RTA在潜伏期复制向裂解复制的转换中起着重要作用，并且对体外病毒裂解复制至关重要(6,11,12,14,19,29,30). 这项研究首次证明了RTA能够调节体内潜伏期和溶解复制之间的平衡。在此，我们已经表明，在重组MHV-68中过度表达RTA足以增强病毒复制动力学，严重损害重组病毒建立潜伏期的能力，并降低与体内潜伏期相关的致病性。我们还证明，缺乏建立潜伏期能力的病毒能够保护小鼠免受WT/MHV-68的后续攻击。
我们已经证明，RTA的过度表达会严重影响MHV-68在受感染小鼠脾细胞中建立潜伏期的能力。这是第一次构建出具有组成性溶解性的疱疹病毒。未能建立潜伏期并不是病毒基因组左端的RTA表达盒造成的，因为我们已经构建了多个重组MHV-68病毒，其基因表达盒位于相同的位置，其建立潜伏期的能力不受损害（T.-T.Wu，L.Tong，E.Crabb-Breen，J.Gage，O。Martinez-Maza和Ren Sun，未公布数据）。尽管有一些C-RTA/MHV-68小鼠表现出潜伏感染，但我们能够确定其中一些病毒已经进行了重组并删除了C-RTA过表达盒。这些自然发生在小鼠体内的回复性MHV-68病毒进一步支持了RTA表达与建立潜伏期失败之间的联系。在保留RTA盒的少数小鼠中，可能是C-RTA/MHV-68的CMV启动子在某些细胞中转录不活跃，或者C-RTA基因盒中存在影响RTA表达的小突变。然后我们确定潜伏缺陷型MHV-68病毒是否对WT/MHV-68攻击具有保护作用。在感染后30天和90天，用C-RTA/MHV-68感染和用WT/MHV-68攻击的小鼠受到保护，免受肺部急性病毒复制、脾脏中任何可检测到的潜伏期的建立以及潜伏期相关脾肿大的发展。因此，C-RTA/MHV-68足以引起对WT/MHV-68暴露的保护。
已有研究表明，v-cyclin基因缺失的重组MHV-68在潜伏期的再激活方面不足，作为抵抗WT挑战的疫苗是有效的(23). 我们的策略的优点是，最初接种的病毒株在建立潜伏期方面不足，可以从宿主中清除，并且仍然具有保护性。因此，宿主不会受到潜在γ-疱疹病毒感染引起的并发症，如B细胞淋巴瘤。为了解决可能的重组突变体的问题，我们将在潜伏相关基因中进行突变，以确保即使从病毒中删除RTA盒，病毒也无法建立潜伏。将对MHV-68病毒基因组进行其他改变，如病毒复制减弱，以确保用于疫苗接种的病毒的安全性。
由于革兰病毒之间有大量同源性(26)这种疫苗策略也可以应用于针对人类γ-疱疹病毒（如KSHV）的疫苗。在非洲，卡波西肉瘤是一种地方性疾病，影响人数超过世界其他任何地方(8,9). 针对KSHV的有效疫苗将对降低该病的流行率极为有益。
我们提供了证据表明，RTA是体内MHV-68病毒生命周期的关键调节器。我们还证明，潜伏期建立不足的病毒可以作为预防MHV-68感染的保护性疫苗。由于C-RTA/MHV-68病毒在体内建立潜伏期方面的不足，它也将成为研究潜伏期在γ-疱疹病毒相关发病机制中的作用的宝贵工具。
致谢
这项工作得到了NIH拨款CA83525、CA91791和DE14153的支持；阻止癌症基金会（R.S.）；加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所；USPHS国家研究服务奖GM07185（T.M.R.）；白血病和淋巴瘤学会特别研究员奖（T.-T.W.）。
参考文献
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