S-丙炔半胱氨酸通过调节Nrf2-ARE信号通路减轻类风湿关节炎的炎症反应

2.2. 建立关节炎和药物治疗

根据复旦大学医学研究制定的实验动物护理原则和《实验动物护理和使用指南》，本研究中使用的所有动物都得到了人道的护理。体重200–230 g的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠被随机分为五组，每组八只动物。第1组作为载体对照组，在左后爪注射0.1 ml石蜡油。所有其他组均在左后足掌面皮下注射0.1 ml FA，以诱导实验性佐剂诱导性关节炎（AIA）。注射7天后，大鼠开始接受各种药物治疗，持续4周。第2组：分配为AIA。第3-5组：接受SPRC（分别为25、50或100 mg/kg，p.o.）。第29天处死所有动物，并采集各组踝关节标本和血清。样品在使用前保存在−70°C。

2.3. 后爪容积测量

在注射FA乳剂后的第0、5、10和20天，用体积计测量所有动物组的后爪体积（HPV）。对实验大鼠的AIA腿进行检查，并根据Coelho方法计算抑制率[14].

2.4. 细胞培养

FLS MH7A细胞系由张鹏教授（中国科学院，深圳）赠送，细胞购自理研细胞库（日本筑波）。人类急性单核细胞白血病细胞系（THP-1）来自美国型培养物收集中心（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。THP-1和MH7A细胞在罗斯韦尔公园纪念研究所1640培养基（Hyclone）中培养，在5%的CO中添加10%胎牛血清（Hyclene）和1%青霉素/链霉素₂37°C下的增湿大气。

2.5. 细胞活力测定

如前所述，通过MTT试验评估细胞活力[22]简而言之，将MH7A细胞以2×10的密度在96个培养皿中传代⁴细胞/ml，然后培养12h。在与指示浓度的SPRC孵育24小时后，将最终浓度的MTT（0.5 mg/ml）添加到细胞培养物中，并再孵育4小时。然后将二甲基亚砜添加到每个孔中，并使用微孔板阅读器（M1000，TECAN，奥地利股份有限公司，奥地利）测量570 nm处的吸光度。折叠变化最终用于指示数据规范化。

2.6. H（H）₂S浓度测量

H（H）₂如前所述测量S浓度[23]简单地说，将来自不同处理细胞的500μl培养基与250μl 1%乙酸锌混合在试管中。随后，在7.2 mM HCl和FeCl中加入N-二甲基对苯二胺硫酸盐（20 mM，133μl）_三向试管中加入1.2 mM HCl（133μl），并在室温下培养10分钟。为了去除培养物中的蛋白质，将三氯乙酸（10%w/v，250μl）添加到反应中，并通过12000 rpm离心5分钟来造粒蛋白质。用分光光度计（M1000，TECAN，奥地利股份有限公司）测量吸光度（670 nm）强度。H₂根据NaHS（3.125–250μM）的校准曲线计算每个样品的S浓度。

2.7. 酶联免疫吸附法测定血清TNF-α水平

根据制造商的说明，使用市售酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Boatman Biotechnology，Shanghai，China）分析大鼠处死后血浆中的TNF-α浓度。在450 nm的微孔板阅读器（M1000，TECAN，奥地利股份有限公司，奥地利）上读取光密度。结果以pg/ml表示。

2.8. 细胞粘附试验

用BCECF-AM（10μM，Meilune Biotechnology，Dalian，China）在37°C的RPMI-1640中标记THP-1细胞1小时。然后用培养基清洗细胞并离心。将生长在玻璃盖玻片上的MH7A细胞与SPRC（10μM）和PAG（2 mM）孵育1h，然后用IL-1β（5 ng/ml）刺激12h。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次后，标记的THP-1细胞（2×10⁶细胞/ml）接种到MH7A细胞单层上，并在CO中培养1 h₂孵化器。用PBS洗涤去除非粘附THP-1细胞。用荧光显微镜检测细胞粘附。

2.9. 细胞侵袭试验

MH7A细胞的侵袭试验如前所述，并进行了修改[24]用SPRC（10μM）或与PAG一起预处理MH7A细胞1h；然后将细胞重新悬浮，总数为2×10⁵细胞接种在含有1%胎牛血清的300μl培养基中，接种在带有8μm孔径膜的上腔中。将培养基填充到培养箱的下部微孔中，然后在37°C下培养培养箱12小时，以开始迁移。用棉签擦拭未迁移的细胞，固定过滤器，用紫水晶染色并计数。每孔5个随机显微镜视野中迁移细胞的数量以400倍放大率进行计数。实验重复至少三次，每次三次。

2.10. 细胞内ROS产生、GSH水平、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性

如前所述，使用DCFH-DA检测细胞内活性氧（ROS）生成，并进行了修饰[25]简而言之，用无血清DMEM清洗MH7A细胞，并在37°C下用DCFH-DA（10μM）培养30分钟。然后用PBS清洗细胞，并首先使用荧光分光光度计（M1000，TECAN，奥地利股份有限公司，奥地利）在485 nm和530 nm的激发和发射波长下量化ROS产生的荧光强度。荧光显微镜（卡尔蔡司公司）也可以观察到细胞内活性氧的产生。相对荧光单位归一化为对照细胞。

使用商业试剂盒（Beyotime Biotechnology，中国江苏）测定了还原型谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶和谷胱甘苷过氧化物酶（GPx）的细胞内活性。所有程序均按照制造商的说明进行。

2.11. 明胶酶谱

如前所述，通过明胶酶谱分析MMP-9的明胶溶解活性[26]简单地说，使用了含有1 mg/ml明胶的1 mm厚8%聚丙烯酰胺凝胶。在非还原条件下，将总共20μl的MH7A细胞上清液装入10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶（含1 mg/ml明胶）中并分离。电泳后，将凝胶在2.5%Triton X-100中浸泡30分钟，以去除SDS，并在含有CaCl的Tris–HCl（50 mM，pH 7.5）中培养₂（5 mM）和氯化锌₂（1 mM）在37°C下过夜。考马斯蓝染色后，白色的裂解带表明明胶被MMP-9消化。扫描凝胶，并使用Image J软件分析带的光学密度。

2.12. 全细胞提取物和核组分的制备

对于全细胞提取，细胞用冰镇PBS洗涤两次，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中溶解。离心后（4°C，10分钟，10000克)制备样品进行western blot分析。

为了制备核部分，使用NE-PER提取MH7A细胞的核蛋白^@核和细胞质萃取试剂（赛默飞世尔科技，中国上海）符合制造商的说明。

2.13. 蛋白质印迹分析

如前所述进行Western blot分析[27]分离等量（50μg）的蛋白质并转移到聚二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶粉封闭后，用抗体MMP9、IL-6、ICAM-1、GAPDH、Keap1、Nrf2、SOD1、HO-1和Lamin A/C探测膜，并用辣根过氧化物酶结合山羊抗兔或抗鼠抗体（1:5000，中国上海赛默飞世尔科技公司）孵育。免疫反应蛋白通过增强化学发光进行可视化，信号强度通过Alpha Imager（Alpha Innotech Corp，San Leandro，CA，USA）进行检测和定量。

2.14. 定量实时逆转录聚合酶链反应分析

根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Takara Biotechnology，Dalian，China）从不同处理的MH7A细胞中提取总RNA。使用Takara的逆转录系统对每个样本的RNA（1μg）进行逆转录。使用等体积cDNA作为聚合酶链反应（PCR）模板，通过iCycler-iQ系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）使用SYBR-Green定量PCR试剂盒（Takara Biotechnology，大连，中国）测定mRNA表达水平。人类特异性引物如下：GAPDH（正向：5′-TGTTGGCCATCAATGACCCCTT-3′；反向：5′-CTCACGACGTACTCAGC-3′）；ICAM-1（正向：5′-ATGCCAGACATCTGTCC-3′；反向：5′-GGGTCTCTTATGCCAACA-3′）；IL-6（正向：5′-CCTGAACCTCCAAGATGGC-3′；反向：5′-TTCACAGGCAAGTCCTC A-3′）。相对基因表达通过^△△C类_t吨方法。

2.15. CSE-shRNA慢病毒的产生和感染

特异性短发夹RNA（shRNA）CSE和shRNA对照（CTR）质粒由Zha教授（中国上海复旦大学生物化学与分子生物学系）提供。为了获得慢病毒，使用转染试剂lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）将重组质粒和包装载体pΔ8.2和pVSVG共同转染到293T细胞中。48小时后，用0.45μm过滤器过滤收集培养基中的慢病毒。将慢病毒添加到含有8μg/ml聚brene（Sigma，美国）的培养基中。用荧光显微镜验证慢病毒的感染效率。在MH7A细胞实验中，1×10⁶旋转细胞，然后与50μl浓缩病毒混合。将细胞在37°C下培养4小时。随后，添加MH7A培养基（500μl）以制备感染细胞的悬浮液，并将细胞再培养72小时。为了产生稳定的转染细胞，在培养72小时后添加嘌呤霉素（3μg/ml）。

2.16. 小干扰RNA转染

为了将Nrf2小干扰RNA（siRNA）导入MH7A细胞，在转染前将细胞以30–50%的融合率放置在6孔板上。将单个siRNA（30 nM）、脂质体RNAiMAX和Opti-MEM混合并在室温下孵育5 min siRNA–将脂质体RNAiMAX复合物添加到细胞中24 h，转染后用新鲜血清DMEM培养基替换培养基。Nrf2 siRNA和加扰siRNA购自GenePharma Co.Ltd（中国上海）。本研究中使用的人类Nrf2 siRNA序列如下：意义：5′-CGCUCAUUACAACUAGAUTT-3′；反义：5′-AUCUAAGUUGUAACUGAGCGTT-3′。转染后72小时进行实验。通过western blot分析评估Nrf2的敲除。

3.2. SPRC抑制单核细胞粘附和MH7A细胞迁移

我们首先研究了SPRC对THP-1细胞与IL-1β激活的MH7A细胞粘附的影响，这是关节炎的关键炎症过程。如所示图2A、 IL-1β刺激MH7A细胞12 h后，THP-1细胞的粘附性显著增加，SPRC（10µM）处理显著减弱。接下来，我们检测了在IL-1β暴露之前，未经或经SPRC（10µM）处理的MH7A细胞的迁移潜能。如所示图2B、 IL-1β显著诱导MH7A细胞迁移。SPRC（10µM）也抑制IL-1β诱导的MH7A细胞迁移。有趣的是，SPRC对THP-1细胞与IL-1β激活的MH7A细胞粘附的影响以及PAG预处理逆转了MH7A的迁移(图2A和B）。综上所述，我们的结果表明，SPRC通过调节内源性CSE/H，有效地抑制THP-1细胞与MH7A细胞的粘附和MH7A的迁移，至少在一定程度上是这样的₂S通路。

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图2

SPRC抑制IL-1β诱导的THP-1细胞粘附和MH7A细胞迁移。将MH7A细胞与SPRC（10μM）或与PAG（2 mM）预孵育1h，再与IL-1β刺激12h，并按照以下描述分析THP-1在MH7A上的粘附和MH7A的迁移第2节（A）有代表性的图像显示，通过荧光显微镜（放大100倍）检测到细胞粘附。（B） MH7A细胞迁移的代表性图像和定量分析（放大200倍）。数据表示为三次试验的平均值±SEM。^***第页<0.001与。IL-1β刺激细胞。^###第页<0.001与。SPRC处理的细胞。

3.3. SPRC调节IL-1β刺激的MH7A细胞内氧化还原平衡

为了阐明SPRC对IL-1β诱导的细胞损伤的保护作用，测定了细胞内ROS的产生、SOD1的表达以及GSH、过氧化氢酶和GPx的活性。如所示图3A、 IL-1β刺激显著增加细胞内ROS的生成，SPRC预处理以浓度依赖的方式显著改善了这一点。此外，SPRC处理显著提高了细胞间抗氧化能力，SOD1表达上调证明了这一点(图3B） 和过氧化氢酶活性(图3C） ，GPx(图3D） 和GSH(图3E） 在IL-1β刺激的MH7A细胞中。PAG还消除了SPRC介导的SOD1的表达以及IL-1β刺激的MH7A细胞中过氧化氢酶、GPx和GSH的活性(图3C） ●●●●。这些结果表明，CSE/H₂S通路参与了SPRC介导的MH7A细胞内氧化还原平衡。

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图3

SPRC调节IL-1β刺激的MH7A细胞内的氧化还原平衡。（A） 用SPRC（10μM）或与PAG（2 mM）一起预处理MH7A细胞1 h，然后用IL-1β（5 ng/ml）刺激24 h，并按照第2节.H型₂O（运行）₂刺激作为阳性对照。显示了细胞内ROS生成的代表性图像和定量分析（控制集为1）。用指示浓度的SPRC或与PAG一起预处理MH7A细胞1 h，用IL-1β（5 ng/ml）刺激24 h，并按照第2节条形图显示了SOD1（B）的表达和过氧化氢酶（C）、GPx（D）和GSH（E）的活性的定量分析，GAPDH用作蛋白质印迹分析的负载对照。数据表示为三次试验的平均值±SEM。^*第页<0.05,^**第页<0.01,^***第页<0.001与。IL-1β刺激细胞；^###第页<0.001与。SPRC处理的细胞。

3.4. SPRC调控CSE表达和内源性H₂S生产

确认CSE/H的参与₂SPRC抗炎活性中的S通路、CSE表达和H₂分析了MH7A细胞的硫生成。我们的结果表明，SPRC（10μM）或半胱氨酸（CYS，10μML（左）-型氨基酸转运蛋白1抑制剂，LAT1）(图4A） ●●●●。SPRC（10µM）处理6 h后，h显著增加₂MH7A细胞中的S水平(图4B） ●●●●。此外，慢病毒CSE shRNA敲除策略沉默了CSE表达。如所示图4C、 慢病毒CSE shRNA转染，但不干扰shRNA，显著降低了MH7A细胞和IL-1β刺激的MH7A电池中的CSE。如所示图4D–F、SPRC（10µM）或NaHS（外源H₂S供体，100µM）治疗显著减弱IL-1β诱导的ICAM-1和MMP-9表达。然而，慢病毒CSE shRNA转染上调了IL-1β诱导的MMP-9表达。敲除CSE反馈增加IL-1β刺激的MH7A细胞中CBS的表达。总之，我们的结果清楚地表明，SPRC通过调节内源性CSE/H在MH7A细胞中发挥抗炎活性₂S通路。

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图4

内源性H的调节₂SPRC的S有助于IL-1β刺激的MH7A细胞的抗炎活性。（A） 在与BCH预孵育1 h后，MH7A细胞经SPRC或CYS处理24 h。条形图显示了CSE表达的定量分析；数据表示为三次试验的平均值±SEM。^***第页<0.001与。未处理细胞；^&&第页<0.01与。SPRC处理细胞；^#第页<0.05与。CYS处理的细胞。（B） 用SPRC（10μM）孵育MH7A细胞指定时间，曲线图显示了H的定量分析₂培养基中的S水平。数据表示为三次试验的平均值±SEM。^***第页<0.001与。未处理细胞；（C） 慢病毒打乱shRNA或CSE shRNA转染MH7A细胞；代表性图像示出了CSE的消声效率。GAPDH被用作负荷控制。（D） 用慢病毒CSE shRNA或打乱的shRNA转染MH7A细胞，然后用IL-1β刺激24 h，有或没有SPRC（10μM）或NaHS（100μM）。Western blot结果显示MMP-9、ICAM-1和COX-2表达的定量分析；数据表示为三次试验的平均值±SEM。^*第页<0.05,^**第页<0.01,^***第页<0.001与。IL-1β刺激细胞；^%第页<0.05与。NaHS处理的细胞。

3.5. SPRC通过激活Nrf2信号诱导MH7A细胞HO-1表达

保持高水平HO-1是一种很有希望的预防炎症和关节炎的策略[28]。如所示图5A和B，SPRC孵育12 h，浓度依赖性地诱导IL-1β刺激的MH7A细胞中HO-1和Nrf2蛋白的表达，而IL-1β单独对HO-1和Nrf2的表达没有显著影响。然而，经PAG预处理后，SPRC介导的HO-1和Nrf2表达被消除。SPRC处理时间依赖性诱导CSE表达。与CSE表达增加相一致，SPRC治疗也能诱导Nrf2表达并降低Keap1表达(图5C） ●●●●。此外，SPRC介导的Nrf2蛋白表达水平的增加导致Nrf2核移位增加(图5D） ●●●●。然而，siRNA沉默Nrf2可阻断SPRC介导的Nrf2表达，同时HO-1和SOD1表达减少，ICAM-1和COX-2表达增加(图5E） ●●●●。

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图5

SPRC通过激活Nrf2信号在MH7A细胞中诱导HO-1表达。（A） 用SPRC（0.1–10μM）或与PAG联合处理MH7A细胞1h，然后用IL-1β（5 ng/ml）刺激24h；western blot结果和Nrf2和HO-1表达的定量分析。数据表示为三次试验的平均值±SEM。^*第页<0.05,^**第页<0.01,^***第页<0.001与。IL-1β刺激细胞；^###第页<0.001与。SPRC（10μM）处理的细胞。（B） 将MH7A细胞与10μM SPRC孵育指定时间；显示了Nrf2、CSE和Keap1表达的western blot结果和定量分析。数据表示为一式三份实验的平均值±SEM。^*第页<0.05,^**第页<0.01,^***第页<0.001与。非刺激细胞；（D） 用SPRC（1或10μM）和PAG（2 mM）预处理MH7A细胞1h，然后用IL-1β（5 ng/ml）刺激4h；分别显示了Nrf2在胞质和核级分中的蛋白质印迹结果和定量分析。GAPDH和Lamin A/C分别用作细胞溶质和核组分的负荷控制，数据表示为三次实验的平均值±SEM。^*第页<0.05,^**第页<0.01,^***第页<0.001与。未刺激细胞。（D） 慢病毒干扰siRNA或Nrf-siRNA转染MH7A细胞，与SPRC（10μM）孵育后用IL-1β（5 ng/ml）刺激24 h；代表性图像显示了Nrf2的沉默效率以及HO-1、SOD1、ICAM-1和COX-2的表达。GAPDH被用作负载对照，数据来自一式三份的实验。

我们感谢张鹏教授赠送MH7A细胞，感谢查喜良教授赠送靶向CSE的shRNA质粒。这项工作得到了国家自然科学基金资助项目（编号：81330080、81173054、81573420和81470164）的支持；上海市教育委员会重点实验室项目（No.ZDSYS14005）；上海市科学技术委员会（No.14JC1401100）。