亚硝酸盐介导的巨噬细胞NADPH氧化酶活性降低依赖于黄嘌呤氧化还原酶衍生的一氧化氮，但与S-亚硝化无关

2.2. 细胞培养

小鼠腹腔巨噬细胞（IC-21 ATCC TIB-186；美国型培养物收藏馆，弗吉尼亚州马纳萨斯）在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，2 mmol/l我-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100µg/ml链霉素（均为瑞典斯德哥尔摩赛默飞世尔科技公司生产的产品）以及含5%CO的增湿空气₂温度为37°C。每隔一天更换培养基，并使用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS，不含Ca）对细胞进行传代²⁺/镁²⁺)当汇流达到80-90%时。在实验中，巨噬细胞以500000个细胞/ml的密度接种在平板中，并允许其在一夜之间附着。

2.3. 药物治疗

巨噬细胞的药理学治疗是在不含胎牛血清的RPMI培养基中进行的。去除正常生长培养基后，用DPBS清洗细胞一次。然后用亚硝酸钠（NaNO）培养巨噬细胞₂，10µmol/l），LPS来自大肠杆菌内毒素（0111:B4，10 ng/ml），二乙烯三胺/NO加合物（DETA-NONOate，0.5 mmol/l），N_ω-硝基-我-精氨酸甲酯盐酸盐(我-NAME，1 mmol/l），非布索坦（30 nmol/l。我-在用其他物质治疗前30分钟添加NAME和非布索他。

制备S-亚硝基半胱氨酸（CysNO），1 vol 200 mmol/l我-半胱氨酸（在1 mol/l HCl中）与1 vol 200 mol/l亚硝酸钠（在蒸馏水中）在室温黑暗中孵育30 min。通过添加2体积的1 mol/lK中和溶液₂高性能操作₄（pH 7.4）缓冲液，并在−80°C下保存在等分样品中，直至使用。通过使用消光系数900/（mol*l*cm），根据338 nm处的光吸收测定形成的CysNO的浓度[13]LPS处理或在无血清培养基中培养24小时后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS，含Ca）清洗巨噬细胞两次²⁺/镁²⁺)然后在37°C下用CysNO在PBS中培养15分钟。随后，用PBS清洗细胞两次，并收集用于生物素开关分析（见下文）。

2.4. NADPH依赖性超氧化物生成

如前所述，使用依赖于亮氨酸的化学发光测定NADPH氧化酶的活性，作为依赖于NADPH的超氧化物产生量进行测量[5]在药物治疗后，用DPBS清洗巨噬细胞，并在37°C的DPBS中培养15分钟，将其从培养皿中分离出来。将细胞悬液转移到测量管中，并在37°C下与暗适应的荧光素（5µmol/l）孵育15分钟。通过注入NOX底物NADPH（100µmol/l）开始超氧化物的生成，并使用AutoLumat LB953多管光度计（德国巴德·威尔德巴德Berthold Technologies）每隔3 s测量一次化学发光信号，持续3分钟。以前的研究表明，用天妇罗清除超氧物或用VAS3947抑制NOX孵育可降低细胞培养和组织中约90%的化学发光信号[14],[15]，这表明主要测量了NOX中的超氧化物。此外，在没有添加NADPH的情况下，非特异性荧光素介导的超氧物生成与空白（即仅PBS）类似，因此对结果没有任何显著影响。

2.5. 生物素开关分析

使用生物素开关试验测定巨噬细胞裂解物中的蛋白质S-亚硝化水平，并对原始方案进行了一些修改[16]在黑暗中进行生物素化蛋白的中微子素纯化前的所有步骤。处理后，收集巨噬细胞并在TENT缓冲液（50 mmol/l Tris-HCl pH7.2、150 mmol/l NaCl、1 mmol/l-EDTA、0.1 mmol/l-新铜试剂、1%Triton X-100、蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中通过刮擦进行裂解并在冰上孵育15分钟。可溶性部分通过在10000 g和4°C下离心15分钟获得。使用Bradford蛋白质测定法（Bio-Rad）测定蛋白质浓度，并使用TEN缓冲液（不含Triton X-100的TENT）将样品调节至0.5 mg/ml。游离硫醇被阻断在含有20 mmol/l的4体积HENS缓冲液（250 mmol/lHepes pH 7.7，1 mmol/lEDTA，0.1 mmol/l新铜试剂，1%十二烷基硫酸钠）中秒-甲基甲硫代磺酸甲酯在50°C下搅拌30分钟，每5分钟搅拌一次。在−20°C下用冷丙酮沉淀蛋白质至少30分钟，以去除多余的封闭试剂。为了减少SNO-硫醇并标记产生的SH-残留，将沉淀的蛋白质重新悬浮在含有5 mmol/l抗坏血酸的300µl HENS/mg蛋白质中，并在室温下在1 mmol/l（N-[6-（生物胺基）己基]-3′-（2′-吡啶二硫基）丙酰胺（HPDP-biotin，Thermo Fisher Scientific）存在下培养2 h。丙酮沉淀后，将生物素化蛋白重悬于150µl HENS/mg蛋白中，并通过与NeutrAvidin Plus Ultra Link Resin（Thermo Fisher Scientific）在5体积中和缓冲液（20 mmol/l Hepes pH 7.7、100 mmol/l NaCl、1 mmol/l EDTA、0.5%Triton X-100）中在4°C下过夜孵育进行纯化。广泛洗涤结合蛋白（20 mmol/l Hepes pH 7.7，600 mmol-NaCl，1 mmol/lEDTA，0.5%Triton X-100），在37℃用1 mmol/lβ-巯基乙醇在20 mmol/LHepes PH7.7，100 mmol/lNaCl，1mmol/l EDTA中从树脂中洗脱20 min，并使用Western Blot进行分析。

2.6. 实时PCR

实时PCR检测NOX亚基和黄嘌呤氧化酶（XOR）mRNA表达水平。处理后，在含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液中收集巨噬细胞，并根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit（瑞典索伦金枪鱼，齐亚根）分离总RNA。在纳米滴ND-1000（Thermo Fisher Scientific）上用分光光度法评估RNA纯度和浓度。用高容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）将等量的RNA逆转录为cDNA。使用Power SYBR Green Master mix（Thermo Fisher Scientific）和基因特异性引物，在ABI 7500实时PCR系统上，在总反应体积为20µl的96 well板上进行实时PCR(表1). 使用∆∆Ct法计算平均x倍相对基因表达变化[17]标准化家政基因β-actin的结果。

2.7. 西部印记

在95°C下，在加载缓冲液（62.5 mmol/l Tris-HCl pH 6.8、10%甘油、2%十二烷基硫酸钠（SDS）、0.01%溴酚蓝、0.8%β-巯基乙醇）中变性来自生物素开关分析的蛋白质组分（输入和洗脱蛋白质）5分钟。通过Western Blot检测巨噬细胞中NOX亚单位的蛋白表达。通过在裂解缓冲液（10mmol/l Tris-HCl pH 8，150mmol/l NaCl，5mmol/l EDTA，60mmol/l N-辛基-葡糖苷，1%Triton X-100，蛋白酶抑制剂混合物）中刮擦细胞，然后以10000g离心15分钟来制备全细胞裂解物。使用Bradford蛋白质分析法（瑞典索尔纳Bio-Rad）测定可溶性部分中的蛋白质浓度，并在95°C的加载缓冲液中变性等量的蛋白质5分钟。蛋白质通过电泳在4–20%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）上分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad）上。在含有TBS-T（20 mmol/l Trizma碱，pH 7.6，150 mmol/l NaCl，0.1%吐温-20）的5%脱脂干乳中封闭膜，然后用一级抗体（gp91phox/Nox2，BD Biosciences，瑞典斯德哥尔摩；p67phox，Cell Signaling/BioNordika，瑞典斯德哥尔摩；p22phox、p47phox和XOR，德国海德堡圣克鲁斯）培养膜。使用相应的辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔或抗鼠IgG（细胞信号传导）检测一级抗体。蛋白质条带通过Clarity Western ECL底物（Bio-Rad）可视化，强度通过密度测定法（Image Lab软件，Bio-Ra德）量化。为了确保蛋白质负载量相等，使用Restore™PLUS Western Blot Stripping Buffer（Thermo Fisher Scientific）剥离膜，并在用抗β-肌动蛋白（Santa Cruz）的一级抗体和抗鼠IgG阻断再增殖后剥离膜。通过将结果标准化为持家蛋白β-肌动蛋白来计算平均x倍相对蛋白表达变化。为了比较LPS-和LPS+CysNO处理的细胞之间的S-亚硝化蛋白，分别计算了Nox2和p22phox的SNO-蛋白/输入的相对强度比，并在文中给出（LPS处理组=1）。由于LPS处理强烈影响研究蛋白质的表达，SNO信号通常较弱，因此SNO蛋白质/输入的量化似乎是任意的，在其他组间比较中被忽略，但显示的是代表性的杂交。

2.8. 尿酸测定

尿酸是嘌呤核苷酸代谢的最终氧化产物，由黄嘌呤和次黄嘌呤·XOR催化。在处理24小时后，在巨噬细胞培养基中测量尿酸水平，作为XOR活性的测量。样品与80µmol/l Amplex Ultra Red试剂（Thermo Fisher Scientific）、0.8 U/ml辣根过氧化物酶和2 U/ml尿酸酶在100 mmol/l Tris-HCl（pH 7.5）中在37°C下培养30分钟。在微孔板阅读器中测量荧光信号（激发530 nm，发射590 nm），并根据同一平板上的标准曲线计算尿酸浓度。为了研究有多少尿酸来自XOR，用同样的方法测量了非布索坦（30 nmol/l）处理的巨噬细胞培养液中的尿酸水平。作为对照，以无细胞方法使用2.5 mU/ml纯化XOR酶，并在37°C下与32µmol/l次黄嘌呤（Sigma）、80µmol/l Amplex Ultra Red试剂（Thermo Fisher Scientific）、，在100 mmol/l Tris-HCl中0.8 U/ml辣根过氧化物酶，pH 7.5，含或不含2 U/ml尿酸酶，并存在不同的非布索坦浓度（3、30、300、3000 nmol/l）。在微孔板阅读器中测量荧光信号（激发530 nm，发射590 nm），在没有尿酸酶的情况下测量信号（代表H₂O（运行）₂用尿酸酶从信号中减去产生量）（只产生尿酸衍生荧光信号）。结果显示为非布索坦对非布索坦的抑制率%。

2.9. DAF-FM荧光

细胞渗透性荧光NO指示剂4,5-二氨基荧光素-FM二醋酸盐（DAF-FM-DA）用于检测巨噬细胞中NO的生成。如上文所述，对细胞进行电镀，并在96个板中处理。24小时后，在37°C下用DAF-FM DA（10µM）加载细胞45分钟。然后用DPBS清洗细胞，并将其转移到96 well的黑色板上。荧光信号在微孔板阅读器中测量（激发495 nm，发射515 nm），并表示为我-NAME处理的细胞。

3.2. 亚硝酸盐不会改变NOX2亚基的基因表达

亚硝酸盐如何介导NOX衍生超氧物形成的这种衰减的一种可能机制是通过改变酶的表达。所以，我们研究了活化和非活化巨噬细胞中NOX2亚单位的基因表达水平。LPS处理导致强烈的Nox2诱导，但p47phox不变，p22phox和p67phox水平甚至下降。与单独使用LPS相比，亚硝酸盐对非活化细胞没有影响，并且与LPS一起使用时，不会改变任何分析亚单位的表达水平(图2A–D）。

在单独的窗口中打开

图2

氮氧化物亚基的基因表达。NOX2亚单位NOX2、p22phox、p47phox和p67phox的相对mRNA水平表示为每个基因未激活对照巨噬细胞的倍数变化。数据显示为平均值±SEM，n=6/组，*p<0.05。

3.3. 亚硝酸盐调节LPS激活巨噬细胞中NOX2亚单位的蛋白表达

由于mRNA水平并不总是反映细胞中蛋白质的丰度，我们还分析了活化和非活化巨噬细胞中NOX2亚单位的蛋白质表达。LPS刺激细胞导致Nox2、p22phox、p47phox和p67phox显著增加。而膜结合亚单位Nox2和p22phox的水平不受亚硝酸盐的影响(图3A、 B），与单独LPS相比，LPS加亚硝酸盐处理的细胞中细胞溶质亚单位p47phox和p67phox的表达显著降低(图3C、 D）。

在单独的窗口中打开

图3

NOX亚单位的蛋白表达。NOX2亚单位NOX2、p22phox、p47phox和p67phox的相对蛋白质水平表示为每种蛋白质的非激活对照巨噬细胞的倍数变化。数据显示为平均值±SEM，n=8/组，*p<0.05。

3.4. 亚硝酸盐不介导NOX2亚基的S-亚硝化

半胱氨酸残基的S-亚硝化被描述为影响许多蛋白质活性的翻译后修饰。因此，我们研究了亚硝酸盐衍生NO是否介导膜结合NOX2亚基的S-亚硝化，从而降低LPS激活巨噬细胞中NOX的活性。在用LPS处理的细胞中，Nox2和p22phox的一部分都进行了S-亚硝化（Nox2的SNO-蛋白/输入1和p22phox的相对强度比1；详情见方法）；然而，与亚硝酸盐同时孵育24小时并没有增加这一比例（SNO-蛋白/输入的相对强度比为0.9（Nox2）和0.9（p22phox））。相反，与NO-donor CysNO进行短时间培养（15分钟）后，Nox2和p22phox都发生了明显的S-亚硝化反应（Nox2的相对强度比SNO-蛋白质/输入3.3，p22phux的相对密度比6.5），这表明这些蛋白质在某些条件下能够进行S-亚硝化(图4A） ●●●●。NO和其他活性氮物种的释放机制和动力学因不同类型的NO-供体的分解和特定条件或催化剂的要求而异[18]因此，在LPS存在下，巨噬细胞与缓释NO-受体或DETA-NONOate孵育24小时，这导致Nox2的S-亚硝化水平与亚硝酸盐相似，而p22hox没有S-亚硝酸化(图4B） ●●●●。特别是内源性NO合成酶（iNOS）的诱导形式在巨噬细胞LPS激活时产生大量NO。为了排除这种大量iNOS衍生NO在检测S-亚硝化水平时掩盖亚硝酸盐作用的可能性，用我-NAME阻止所有NOS亚型。然而，即使在NOS抑制期间，单用LPS和LPS加亚硝酸盐处理的细胞之间也没有差异(图4C） ●●●●。综上所述，这些结果表明，在巨噬细胞LPS激活期间，亚硝酸盐减少超氧物生成的能力并不是由Nox2或p22phox的S-亚硝化作用介导的。

在单独的窗口中打开

图4

氮氧化物亚基的S-亚硝化。显示了S-亚硝化蛋白（SNO）和Nox2和p22phox的输入。用LPS、LPS加亚硝酸盐和快速释放NO供体（a）、缓慢释放NO供质体（B）或NOS抑制（C）处理细胞后，分析S-亚硝化作用。显示了独立实验的代表性结果。

我们感谢Annika Olsson、Carina Nihlen和Annette Ebberyd（卡罗琳斯卡研究所生理药理学系）的杰出技术贡献。这项工作得到了瑞典研究委员会（M.C.，E.W.和J.O.L）（第521-2011-2639号挪威克朗）、瑞典心肺基金会（M.C.和J.O.L）（第20110589和20140448号挪威克朗）、斯德哥尔摩市议会（ALF，第2014-2015号挪威克朗）的资助，以及卡罗林斯卡研究所（M.C）的KID资助（第2415/22012-225号挪威克朗和第2-3707/2013号挪威克朗）。