氧化还原生物。2016年12月；10: 108–118.
高压氧诱导大鼠脊髓神经元HSP32的信号通路
中国上海市湘阴路800号第二军医大学潜水与高压医学系
1这些作者为这项工作做出了同等贡献。
2016年8月22日收到；2016年9月3日修订；2016年9月16日接受。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
摘要
脊髓损伤是一种使人衰弱的疾病，迫切需要有效的预防措施。我们之前的工作发现，高压氧（HBO）预处理对刺激潜水后大鼠SCI有显著保护作用，体外研究进一步证明，HBO通过热休克蛋白（HSP）32诱导，保护原代培养的大鼠脊髓神经元免受氧化损伤和缺氧缺糖损伤。在本研究中，进一步研究了潜在的分子机制。结果表明，单次接触HBO可显著增加细胞内活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）水平，并激活MEK1/2、ERK1/2、p38 MAPK、CREB、Bach1和Nrf2。使用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸、p38 MAPK抑制剂或Nrf2基因敲除的预处理神经元可显著逆转HBO对HSP32的诱导，而MEK1/2抑制剂或基因敲除可增强HSP32诱导，ERK1/2抑制剂则无此作用。CREB基因敲除并没有改变HBO诱导的HSP32的表达。N-乙酰-L-半胱氨酸显著抑制MEK1/2、ERK1/2、p38 MAPK和Nrf2的激活。p38 MAPK抑制剂显著抑制Nrf2的活化，MEK1/2抑制剂显著增强Bach1的核输出。结果表明，HBO通过ROS/p38 MAPK/Nrf2通路诱导HSP32表达，而MEK1/2/Bach1通路在该过程中起负调控作用。更重要的是，正如我们所知，这是首次研究表明ERK1/2不是MEK1/2的唯一生理底物。
关键词：高压氧，热休克蛋白32，信号转导，负调控，活性氧
图形摘要
大鼠脊髓神经元中HBO暴露与HSP32表达之间的信号通路。在基础条件下，Bach1与小分子Maf蛋白相关，并通过与ARE结合抑制HSP32基因表达。HBO增加细胞内ROS的形成，从而激活MEK1/2和p38 MAPK。p38 MAPK的激活触发Nrf2从keap1中解离并移位到细胞核，与小Maf蛋白形成异二聚体，并通过与ARE结合启动HSP32基因的转录。同时，MEK1/2的激活抑制了Bach1与小分子Maf蛋白的解离，从而阻止了HSP32基因转录的激增。ARE，抗氧化反应元件；Keap 1，Kelch-like ECH-associated protein 1。
1.简介
脊髓损伤（SCI）是一种不可预测且使人衰弱的疾病，可能是脊柱或胸腹主动脉手术的并发症，也可能是运动或商业潜水相关减压病的结果[1],[2]SCI的病理顺序主要由水肿、炎症、兴奋毒性、缺血再灌注损伤和氧化细胞损伤介导[3],[4]由于脊髓供血不足和脂质含量高，极易被自由基损伤，缺血再灌注损伤和氧化应激是脊髓损伤的两个重要机制[3],[5]许多治疗方法被建议用于预防SCI，包括低温、抗兴奋性毒剂、钙通道阻滞剂、N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂和脑脊液引流，但疗效改善甚微[5]迫切需要新的有效疗法来预防脊髓损伤。我们之前的研究发现，高压氧预处理可显著保护大鼠在刺激潜水后免受脊髓损伤[6]体外研究进一步证明，HBO通过热休克蛋白（HSP）32诱导保护原代培养的大鼠脊髓神经元免受氧化损伤和缺氧缺糖损伤，在HBO暴露后12 h达到峰值[7]本研究的目的是研究HBO诱导原代培养大鼠脊髓神经元HSP32表达的潜在机制。
游离血红素主要通过血红素蛋白的氧化产生，包括血红蛋白、肌红蛋白、神经球蛋白等[8]血红素的中心是一个铁原子，它可以产生从过氧化氢中产生的剧毒羟基自由基[8]除了造成氧化损伤外，游离血红素还可以促进肿瘤坏死因子介导的程序性细胞死亡[8]HSP32是一种应激反应蛋白，也称为血红素氧化酶-1，是游离血红素分解代谢中的限速酶；它将血红素降解为三种产物：一氧化碳（CO）、亚铁和胆绿素[9]除了降解游离血红素和中和血红素造成的损伤外，其最终产物还可以发挥细胞保护作用。已有文献证明HSP32/CO系统可以发挥抗炎和抗凋亡作用[10]血红素释放的亚铁可以通过铁蛋白上调增强细胞抗氧化能力[11]胆绿素和胆红素的有益作用是充当生理抗氧化剂[12].
高压氧（HBO）是一种治疗方式，患者在压力大于一个绝对大气压的压缩室内呼吸100%氧气[13]它是一种安全、临床可行的治疗方式，广泛应用于某些损伤的主要治疗，尤其是急性CO中毒、气性坏疽和减压病[14]。除了增加组织氧气供应外，HBO暴露还可通过略微增加细胞内活性氧（ROS）和/或活性氮（RNS）水平，引起中度氧化应激，从而诱导细胞保护蛋白的表达，增强细胞对有害刺激的耐受性[15]HBO诱导HSP32对器官缺血再灌注损伤（包括心肌）的保护作用已得到充分证明[16]，肝脏[17]，肾脏[18]和原代培养的大鼠脊髓神经元[7].
然而，HBO诱导脊髓神经元HSP32表达的机制尚不清楚。了解其机制对于HBO在医疗实践中的应用以及制定预防SCI的新策略至关重要。
2.材料和方法
2.1. 动物
怀孕的Sprague-Dawley大鼠（14-15天）在使用当天从上海斯莱克实验动物有限公司获得。研究方案由大学动物护理和使用委员会批准，所有实验程序均按照大学指南进行。
2.2. 细胞培养
如前所述，从胚胎第14-15天的Sprague-Dawley大鼠中制备脊髓神经元[7]简单地说，从胚胎中快速解剖脊髓，并在37°C下用预先加热的0.05%胰蛋白酶（Invitrogen，美国）消化18分钟。消化后，将所得细胞悬浮液调节至1.0×106含有10%热灭活胎牛血清（Invitrogen）和10%热灭活马血清（Invirogen）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM，Invitrogen）中的细胞/ml。细胞被镀到聚赖氨酸（分子量30000-70000；美国Sigma）涂层培养板上，密度为1.2×106细胞/孔在6孔板上或0.6×10612孔板上的细胞/孔。4小时后，培养基完全被补充有2%B27补充剂（Invitrogen）、0.5 mM谷氨酰胺（Invit罗gen），100 U/ml青霉素（Invitorgen）和100μg/ml链霉素（Invistrogen。每3天用新鲜培养基替换一半的培养基。
2.3. 高压氧处理
HBO暴露在温度和湿度控制的高压细胞培养箱（OxyCure 3000，OxyHeal®美国健康集团）。如我们之前的研究所述[7]，神经元在280 kPa的高压氧下暴露60 min，这在动物和细胞研究中经常使用，280 kPa是目前临床高压氧治疗中应用的氧分压上限[19]。压缩和减压均在5分钟内完成。为了保持培养物的生理pH值，用含有1.79%CO的氧气冲洗并压缩培养箱2以达到5 kPa的CO分压2。本文中描述的所有压力均为绝对压力。
2.4. 生物-Plex磷蛋白分析
在特定时间点，收集神经元，制备蛋白质裂解物，并根据制造商的方案使用各自的Bio-Plex磷蛋白检测试剂盒（Bio-Rad，USA）检测磷酸化蛋白质的含量。简言之，将50μl细胞裂解物（调节至0.6–0.9μg/ml的浓度）涂布在涂有与抗磷蛋白抗体偶联的珠的96 well滤板中。将平板在室温下在振动台上培养过夜。在经过一系列洗涤以去除未结合蛋白后，将生物素化检测抗体添加到反应中，每个抗体针对不同的表位。这导致在靶蛋白周围形成抗体复合物。然后添加链霉亲和素-藻红蛋白，使其与珠表面的生物素化检测抗体结合。使用Bio-Plex 200系统采集数据，并使用Bio-Prex Manager软件（Bio-Read）进行分析。
2.5. 细胞内ROS和NO生成的测量
分别使用DCFH-DA（ROS荧光探针；中国Beyotime）和DAF-FM-DA（NO荧光探针；Beyotime.）检测细胞内ROS和NO水平。脊髓神经元与DCFH-DA（10μM）或DAF-FM-DA（5μM）在37℃孵育20分钟。在用PBS清洗三次以去除未结合的荧光探针后，培养物暴露于HBO。HBO暴露后立即在荧光显微镜下观察荧光强度（495nm激发波长和515nm发射波长；德国蔡司）。
2.6. shRNA感染导致Nrf2、CREB和MEK1/2基因敲除
针对大鼠Nrf2或CREB编码shRNAs的慢病毒载体由Obio Technology Co.，Ltd（中国上海）设计和制造。大鼠Nrf2-和CREB-shRNA的靶序列分别为5′-CACATTCCCCGAGTACAGTGTCTTAA-3′和5′-GCACTTAAGGACCTTTACT-3′，其敲除作用已被证实[20],[21]对于Nrf2或CREB敲除，原代培养的大鼠脊髓神经元在10–30倍感染（MOI）时感染CREB-shRNA-lentivirus、Nrf2-shRNA-lenitivirus或NC-shRNA-lentivirus。对于MEK1/2敲除，分别为大鼠MEK1和MEK2设计了3个靶序列。MEK1的靶序列为Seq1:5′-GCGAGATCATCTGCAT-3′、Seq2:5′-GCAGCTCATGGTACATGCT-3′和Seq3:5′-GGCAGCTAATTGACTCCAT-3′；MEK2为Seq4:5′-GCTCAGGACGACTT-3′、Seq5:5′-GCATCTGCATGGAGCACAT-3′和Seq6:5′-GGAACTAGGCGAGCTT-3′。感染8小时后，用新鲜的完整培养基替换培养基4天，然后再进行进一步实验。通过western blot验证敲除效率。
2.7条。蛋白质印迹
根据制造商的说明，使用细胞核蛋白质提取试剂盒（Beyotime）制备细胞质和细胞核蛋白质。采集总蛋白并在放射免疫沉淀分析裂解缓冲液（Beyotime）中进行裂解。蛋白质样品在8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到聚乙烯二氟醚膜上（Millipore，USA）。用5%（w/v）脱脂乳封闭膜，并在4°C下与针对大鼠HSP32（Abcam，USA）、p38 MAPK（细胞信号技术，USA）、p-p38 MAPK（细胞信号技术）、ERK1/2（细胞信号技术）、p-ERK1/2（细胞信号技术）的兔单克隆一级抗体孵育过夜，CREB（细胞信号传递技术）、p-CREB、Bach1（细胞信号技术）、Nrf2（Abcam）、L-amin B（细胞信号传导技术）或β-actin（细胞信号转导技术）。使用HRP-结合的山羊抗鼠IgG（细胞信号技术）显示蛋白质，并使用Image J软件（美国国立卫生研究院）测量每个带的强度。
2.8. 统计分析
结果以平均值±标准偏差（SD）表示。采用SPSS软件（18.0版）进行统计分析，采用单因素方差分析（ANOVA）和最小二乘法（LSD）。对<0.05被认为具有统计学意义。
3.结果
3.1、。ROS与HBO诱导的大鼠脊髓神经元HSP32表达有关
在本研究中，首次观察了HBO暴露后立即对细胞内ROS和一氧化氮（NO）水平的影响，并使用各自的抑制剂阐明了它们在HBO诱导HSP32表达中的作用。如所示，HBO明显升高细胞内ROS和NO水平(B和F）。用活性氧清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC 5 mM）预处理神经元[22]或一氧化氮合酶（NOS）抑制剂NG公司-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME 100μM）[23]分别明显抑制细胞内ROS和NO的增加(C和H）。为了进一步探讨ROS和NO之间是否存在串扰，我们观察了ROS清除剂对NO生成的影响以及NOS抑制剂对ROS生成的影响。我们发现ROS清除剂NAC对no的生成没有影响，反之亦然(D和G）。接下来，我们研究了ROS和NO在HBO诱导的HSP32表达中的作用。结果表明，NAC能显著逆转HBO对HSP32的上调作用(一） 但L-NAME即使在500或1000μM的较高剂量下也对HSP32的表达没有影响(J） ●●●●。
高压氧对脊髓神经元细胞内活性氧和一氧化氮水平的影响及其在高压氧诱导的HSP32表达中的作用。在HBO暴露前30分钟，向培养基中添加ROS清除剂NAC（5 mM）或NOS抑制剂L-NAME（100μM）。用免疫荧光法（A-H）检测HBO暴露后即刻细胞内ROS和NO。免疫印迹法检测HBO暴露后12h HSP32的表达。较高浓度下L-NAME的影响（J）。与Air组相比显著性**对<0.01; 与HBO组相比的显著性††对<0.01. 高压氧；热休克蛋白；L名称，NG公司-硝基-L-精氨酸甲酯；NAC，N-乙酰-L-半胱氨酸；NO、一氧化氮；NOS、一氧化氮合酶；活性氧。
3.2. HBO诱导HSP32的信号分子
为了阐明HBO诱导HSP32表达的分子机制，我们检测了可能涉及的信号分子的激活。在HBO暴露后0、6、12和18小时，使用Bio-Plex磷蛋白检测试剂盒筛选9个重要信号分子的磷酸化。如所示细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化在HBO暴露后即刻显著增加，6 h后恢复(D、 F和G）。
高压氧暴露后大鼠脊髓神经元中信号分子的激活。使用Bio-Plex磷蛋白检测试剂盒检测与HSP32诱导相关的信号分子的激活。与Air组相比显著性*对<0.05, **对<0.01. CREB、cAMP反应元件结合蛋白；ERK1/2，细胞外信号调节激酶1/2；p38 MAPK，p38丝裂原活化蛋白激酶。
为了进一步确定ERK1/2、p38 MAPK和CREB的激活规律，我们在HBO暴露后0、0.5、1、2和4h用western blot检测这些信号分子的磷酸化。结果清楚地表明，p38 MAPK、ERK1/2和CREB的磷酸化在HBO暴露后立即显著增加，并在0.5h后恢复(A–C）。核因子E2相关因子-2（Nrf2）是诱导HSP32的重要转录因子[24],[25]，无法通过Bio-Plex磷蛋白检测试剂盒进行筛选。western blot检测HBO后0、1、2、4和6h Nrf2的核转位。HBO暴露刺激脊髓神经元中Nrf2的核积累，并在HBO暴露后4小时达到峰值(D） ●●●●。因此，选择HBO暴露后4小时的时间点来观察信号分子抑制剂对Nrf2活化的影响。
HBO对ERK1/2、p38 MAPK、CREB和Nrf2活化的影响。HBO暴露后，ERK1/2（A）、p38 MAPK（B）、CREB（C）的磷酸化和Nrf2（D）的核转位被证实。与Air组相比显著性*对<0.05, **对<0.01. Nrf2，核因子-E2相关因子-2。
3.3. HSP32的诱导依赖于p38 MAPK和Nrf2的激活，并在“ERK1/2抑制”后增强
通过预处理p38 MAPK和ERK1/2各自的抑制剂，研究其在HBO诱导HSP32中的作用。p38 MAPK抑制剂SB203580显著抑制HSP32的表达(A） 或Nrf2基因敲除(B） 但ERK1/2抑制剂显著增强(A） ●●●●。CREB基因敲除对HSP32的表达无影响(B） ●●●●。western blot验证了CREB-和Nrf2-shRNA慢病毒载体在不同感染倍数（MOI）下的敲除效率，结果表明CREB和Nrf2表达均受到显著抑制，10–30个MOI组之间无显著差异(C和D）。因此，使用10MOI的CREB-和Nrf2-shRNA慢病毒载体的剂量来抑制Nrf2和CREB的表达。这些结果表明，HBO通过激活p38 MAPK和Nrf2诱导HSP32，同时ERK1/2可能是该过程中的负调控因子。
ERK1/2、p38 MAPK、CREB和Nrf2在HBO诱导的大鼠脊髓神经元HSP32表达中的作用。在HBO暴露前30min，向培养基中加入p38 MAPK抑制剂（SB203580，10μM）或EKR1/2抑制剂（U0126，10μM），并在HBO接触后12h用western blot检测HSP32的表达（A）。用shNrf2、shCREB或载体转染神经元，如材料和方法部分western blot（B）检测对HSP32表达的影响。给出了shCREB（C）和siNrf2（D）在不同MOI值下的击倒效率（C，D）。与Air组相比具有显著性**对<0.01; 与HBO组相比有显著性差异，††对<0.01. MOI，感染的多重性。
3.4. MEK1/2-ERK1/2在HBO诱导HSP32表达中的作用
为了证实ERK1/2在HBO诱导的HSP32表达中的负调控，观察了另一种ERK1/2抑制剂SCH772984的作用。出乎意料的是，结果显示SCH772984的抑制未能改变HBO诱导的HSP32表达(B） 尽管它显著抑制ERK1/2的激活(A） ●●●●。
ERK1/2直接抑制剂SCH772984对HBO诱导HSP32表达的影响。在HBO暴露前30分钟，用SCH772984（10μM）预处理神经元。HBO暴露后立即检测ERK1/2的磷酸化（A），12h后检测HSP32的表达（B）。与Air组相比显著性**对<0.01; 与HBO组相比有显著性差异，††对<0.01.
虽然U0126经常被用作ERK1/2抑制剂，但其实际靶点是有丝分裂原激活的细胞外信号调节激酶1/2（MEK1/2），这仅仅是因为MEK1/2-ERK1/2通常被认为是一种整合的信号通路[26],[27]，而SCH772984是ERK1/2的直接抑制剂。为了证实MEK1/2参与HBO诱导的HSP32表达，我们观察了MEK1/2在HBO暴露后0、0.5、1、2和4小时的激活以及另一种MEK1/2抑制剂曲美替尼或MEK1/2敲除的影响。如所示MEK1/2的磷酸化在HBO暴露后立即显著增加，并在0.5小时后恢复(A） 曲美替尼显著增强HSP32的表达(C） 通过抑制MEK1/2激活(B） 和MEK1/2基因敲除(A–C）也显著增强HBO暴露后HSP32的表达(D） ●●●●。
MEK1/2抑制对HBO诱导的HSP32表达的影响。在HBO暴露（A）后检测MEK1/2的磷酸化。在HBO暴露前30min用U0126（10μM）或曲美替尼（10μM）预处理神经元，在HBO接触（B）后立即检测MEK1/2的磷酸化，在HBO-接触（C）后12h检测HSP32的表达。与Air组相比显著性**对<0.01; 与HBO组相比的显著性††对<0.01. MEK1/2、丝裂原活化和细胞外信号调节激酶；序列，序列。
MEK1/2敲低对HBO诱导HSP32表达的影响。如材料和方法部分所述，用载体shMEK1（Seq1、Seq2和Seq3）或shMEK2（Seq4、Seq5和Seq6）转染神经元。通过检测MEK1和MEK2 mRNA转录水平（A，B）证实了转染效率。western blot观察shMEK1（Seq 2）和shMEK2（Seq 4）对MEK1/2（C）表达和HSP32（D）表达的联合作用。与Air组相比显著性**对<0.01; 与HBO组相比有显著性差异，††对<0.01.
3.5. HBO和MEK1/2抑制剂增强了Bach1从细胞核的输出
在基本条件下，BTB和CNC同源性1（Bach1）是细胞核中HSP32基因表达的阻遏物。检测HBO和MEK1/2抑制对Bach1细胞核和胞浆分布的影响。HBO暴露显著增加了Bach1在细胞核外的易位，并在HBO暴露后4-6小时达到峰值(A） ●●●●。由于4小时组和6小时组之间没有显著差异，因此选择HBO暴露后4小时的时间点来观察MEK1/2抑制对Bach1易位的影响。结果表明，MEK1/2抑制显著增强了Bach1从细胞核的输出(B） ●●●●。
HBO和MEK1/2抑制剂对Bach1细胞核和胞浆分布的影响。western blot（A）检测HBO暴露后Bach1在细胞核和胞浆中的分布。在HBO暴露前30 min用U0126（10μM）预处理神经元，并在HBO接触后4 h检测其分布（B）。与Air组相比显著性**对<0.01; 与HBO组相比有显著性差异，††对<0.01.
3.6. ROS、MEK1/2、p38 MAPK和Nrf2的关系
ROS清除剂NAC用于揭示ROS在HBO激活MEK1/2、p38 MAPK和Nrf2中的作用。在HBO暴露后4h立即检测MEK1/2和p38 MAPK的磷酸化，并检测Nrf2。NAC显著抑制MEK1/2、p38 MAPK和Nrf2的激活(A–C）。MEK1/2和p38 MAPK是转录因子Nrf2的常见上游信号分子。为了阐明它们之间的关系，我们测定了MEK1/2抑制剂（U0126）和p38MAPK抑制剂（SB203580）对Nrf2活化的影响。结果表明，只有SB203580而没有U0126抑制Nrf2的激活(F） ●●●●。还探讨了MEK1/2和p38 MAPK通路之间的关系。如所示D和E，MEK1/2抑制剂和p38 MAPK抑制剂均未对彼此的激活产生任何影响，表明这两条通路之间没有串扰。SB203580通过抑制p38 MAPK对其底物的激活作用而起作用，但不改变p38 MAPK的磷酸化（15）。如所示E、 SB203580抑制后p38 MAPK磷酸化无变化。
ROS、MEK1/2、p38 MAPK和Nrf2的关系。在HBO暴露前30分钟，用ROS清除剂（NAC，5 mM）、MEK1/2抑制剂（U0126，10μM）或p38 MAPK抑制剂（SB203580，10μM）预处理神经元。western blot检测MEK1/2（A，D）、p38 MAPK（B，E）的磷酸化和Nrf2（C，F）的细胞核移位。与Air组相比显著性**对<0.01; 与HBO组相比有显著性差异，††对<0.01.
4.讨论
我们以前的研究表明，通过诱导HSP32或HSP70，HBO可能是预防SCI的有效措施[6],[7]本研究结果表明，HBO诱导HSP32是通过ROS/p38 MAPK/Nrf2信号级联，同时存在MEK1/2/Bach1介导的负调控途径。
HSP32是一种受多种转录因子调节的高度诱导蛋白，Nrf2和Bach1已成为HSP32基因表达的主要调节因子[25]在基础条件下，Nrf2通过与细胞骨架相关蛋白Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）的结合存在于细胞质中，Bach1与小分子Maf蛋白相关，通过与抗氧化反应元件（ARE）的结合抑制HSP32基因的表达[25]激活后，Bach1与小分子Maf蛋白分离并转移到细胞质中。同时，Nrf2与keap1分离并转位到细胞核，与小分子Maf蛋白形成异二聚体，并通过与ARE结合启动HSP32基因的转录[25]已知许多化学和环境刺激物，包括其底物血红素、重金属、紫外线、过氧化氢、脂多糖和亚砷酸盐都会诱导HSP32[28]这些能够诱导HSP32的化学和环境刺激物的一个共同特征是其亲电化学和ROS和/或RNS的生成，这可能导致氧化应激并激活Bach1和Nrf2[25],[29].
众所周知，适度的氧化应激是HBO诱导的细胞保护蛋白的基础，它可以增强细胞对有害刺激的耐受性[15]本研究首先使用DCFH-DA观察HBO暴露后HBO对细胞内ROS和NO水平的影响[30]和DAF-FM DA[31]分别是。结果表明，HBO暴露后，细胞内ROS和NO水平立即明显升高，NAC或L-NAME可对其产生抑制作用。DCFH-DA是检测细胞内ROS最广泛使用的探针。然而，它与多种活性氧反应，因此在本研究中，HBO暴露后特定活性氧增加尚不清楚[32],[33]。除了引起氧化应激外，细胞内ROS和NO还可以作为信号分子，在某些情况下，它们可以相互调节产生[34],[35]然而，在当前的实验场景中，没有发现它们之间的交互作用。
因为ROS和NO是HSP32的两种成熟诱导物[25],[36]，进一步观察其在HBO诱导的HSP32表达中的作用。结果表明，ROS而非NO参与了HBO诱导的HSP32表达。在人类脐静脉内皮细胞中也有类似的发现[37].
最近的研究表明，HSP32的诱导需要激活多种信号通路，包括Akt、ATF-2、BCR-Abl-2、MEK1/2-ERK1/2、JNK、p38 MAPK、STAT3、NF-κB、CREB和Nrf2[25],[38]除这些信号分子外，在缺氧条件下，HIF-1α是HSP32基因表达的另一个重要调节因子，然而，在正常氧张力或高氧环境下，HSP32会迅速降解[25]为了阐明HBO和HSP32在脊髓神经元表达之间的信号通路，观察了上述信号分子的激活及其上下游关系，揭示了HBO诱导的HSP32表达是通过ROS/p38 MAPK/Nrf2通路介导的。
本研究中一个重要且有趣的发现是发现HSP32的负调控机制与正诱导途径同时起作用，这一发现进一步突出了MEK1/2通过非ERK1/2途径发挥作用。现有数据表明，ERK1/2的激活在HSP32的调节中起着主要的积极作用[25],[39]ERK1/2是MEK1/2唯一已知的生理底物[26].U0126是MEK1/2的特异性抑制剂，通常用于抑制MEK1/2-ERK1/2级联的激活[27],[40]据我们所知，这是第一个发现MEK1/2可能通过ERK1/2以外的途径发挥作用。
MEK1/2是如何抑制HBO诱导的HSP32表达的？Bach1是ARE调节基因包括HSP32的主要抑制转录因子[25]暴露于HBO后，细胞核向细胞质的易位增加，而MEK1/2抑制进一步增强了这种易位。这表明Bach1是介导MEK1/2下游负调控的核因子。然而，MEK1/2和Bach1之间是否存在其他分子需要进一步研究。
越来越多的数据表明，尽管HSP32具有细胞保护功能，但血红素代谢物的激增也会导致神经细胞死亡[41],[42]MEK1/2负调控通路的存在可能是脊髓神经元的自我保护机制。同时，本研究结果表明，所有细胞液信号分子的激活均在0.5 h内发生并恢复，Nrf2和Bach1的激活持续6 h以上，在我们之前的研究中，HSP32的激活表达持续30 h以上，峰值出现在12 h[7].负调控可能在激活暂停中起关键作用。这在体内的生理意义值得进一步研究。
总之，本研究揭示了HBO通过ROS/p38 MAPK/Nrf2途径诱导原代培养大鼠脊髓神经元HSP32表达是由MEK1/2/Bach1介导的负调控同步的，而MEK1/2的作用不是通过ERK1/2发挥的，ERK1/2通常被视为其唯一的生理底物。
作者贡献
WGX构思了这项研究，设计了实验，并编辑了手稿。GYH、JLD和LX进行了实验并撰写了手稿。HJY和JJX对数据进行了分析和解释。所有作者都批准了手稿的最终版本。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（No.81171873）的资助。非常感谢Peter Buzzacott博士帮助准备手稿。
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