跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
氧化还原生物。2016年12月；10: 90–99.
2016年9月22日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.redox.2016.09.013
预防性维修识别码：PMC5053114
PMID：27710854

阿苯达唑是一种有希望的肿瘤控制分子

卡斯特罗,一 M.R.Kviecinski先生,b条 F.欧里克,一 E.B.帕里索托,一 V.M.A.S.格里涅维修斯,一 J.F.G.科雷亚,一 D.威廉·菲略,c（c）和R.C.佩德罗萨a、，⁎
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

本研究评估了阿苯达唑（ABZ）的抗肿瘤作用及其与调节氧化应激和诱导DNA损伤的关系。目前的结果表明，ABZ可导致小牛胸腺DNA的氧化裂解，表明该化合物可以破坏DNA。ABZ处理降低了MCF-7细胞的活性（EC50=44.9，持续24小时），并抑制MCF-7集落形成（5μM时约67.5%）。细胞内ROS水平随着ABZ治疗而增加（约123%）。抗氧化剂NAC能够逆转ABZ处理的MCF-7细胞的细胞毒性作用、ROS生成和线粒体膜电位的丧失。在ABZ治疗的动物中，埃利希癌生长受到抑制（约32%），生存时间延长（约50%）。用ABZ治疗的动物体内氧化生物标志物（TBARS和蛋白羰基水平）和抗氧化酶（CAT、SOD和GR）活性增加，还原型谷胱甘肽（GSH）耗尽，表明存在氧化应激状态，导致DNA损伤，导致组蛋白H2A变体H2AX磷酸化，并触发凋亡信号，通过增加Bax/Bcl-xL比率、p53和Bax表达证实了这一点。我们认为ABZ诱导氧化应激，促进DNA片段化，触发细胞凋亡，诱导细胞死亡，使该药物成为开发新型抗肿瘤药物的潜在先导分子。

关键词：阿苯达唑、抗肿瘤、细胞凋亡、细胞周期阻滞、DNA片段化、氧化应激

集锦

  • •
    在癌症抑制中检测ABZ氧化还原信号通路。
  • •
    氧化应激可以解释ABZ的抗肿瘤作用机制。
  • •
    ABZ氧化应激调节可用于癌症治疗药物的开发。
  • •
    ABZ可以作为药物重新定位的分子原型。

1.简介

癌症是世界许多地区的一个主要公共卫生问题。在巴西，预计2015年将诊断出约57000例新的乳腺癌病例[1]标准的癌症治疗包括手术、放射、免疫治疗和/或化疗。目前，通过化疗进行癌症管理是治疗恶性肿瘤最有效的策略之一。然而，多药耐药是许多癌细胞对化疗产生耐药性的机制，是成功治疗的一大障碍[2]在这种情况下，癌症诊断增加，缺乏最佳治疗，需要新的治疗方案。另一方面，药物重新定位是药物开发的一项重要的药学战略，因为一旦药物的安全性和药代动力学特征众所周知，重新定位可以更快地降低药物风险。与其他药物开发战略相比，重新定位可以提供更好的风险权衡。此外，与基于新药物发现和开发的药物开发成本相比，该战略在经济上具有吸引力[3].

阿苯达唑（N-（6-丙基磺胺基-1H-苯并咪唑-2-基）氨基甲酸甲酯；ABZ）是一种苯并咪唑衍生物，于1982年作为防腐剂引入[4]ABZ的作用机制与微管抑制和阻止葡萄糖摄取有关，这会导致糖原储备耗尽，并降低易感寄生虫幼虫和成虫阶段ATP的形成。总之，它会导致寄生虫的固定和死亡[5],[6]文献中很少有证据支持ABZ重新定位用于癌症治疗。ABZ对几种肿瘤细胞株具有抗增殖作用[7],[8],[9],[10]评估ABZ重新定位的其他原因可以从以下事实推断出来：靶向改变的癌细胞氧化还原状态是一种新的癌症治疗方法。

癌细胞处于高氧化应激状态，因为它们具有改变的抗氧化防御能力，一些研究人员声称抗癌药物诱导的活性氧（ROS）会导致细胞抗氧化机制和线粒体膜电位的改变，这与诱导程序性细胞死亡有关[11]必须强调的是，ABZ显示出ROS生成增加，从而促进氧化应激[12]这可以作为癌症治疗的方法，考虑到癌细胞逃避凋亡信号[13]此外，由于活性氧作为信号级联的细胞开关的作用，这种特性可能与促癌或抗肿瘤信号通路有关，因此利用氧化还原调节作为一种有趣的抗癌治疗策略[14].

本工作的目的是评估ABZ的抗肿瘤作用，以及与通过氧化切割CT-DNA诱导氧化应激和DNA损伤的关系，MCF-7细胞中的细胞内ROS含量和相关的氧化应激调节，以及用该药物治疗的小鼠Ehrlich腹水中的周期细胞停滞，试图将ABZ描述为癌症治疗中可能的药物重新定位的分子原型。

2.材料和方法

2.1. 化学品和抗体

Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）和抗生素购自Gibco（美国）。阿苯达唑（PubChem CID:2082）、甲氨蝶呤、小牛胸腺DNA（CT-DNA）、琼脂糖、二甲基亚砜、2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、N-乙酰基-我-半胱氨酸（NAC）、5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、牛血清白蛋白（BSA）、溴化乙锭（EtdBr）、蛋白酶抑制剂混合物、过氧化氢、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、谷胱甘肽氧化物（GSSG）、NADPH和肾上腺素，购自Sigma Aldrich（巴西）。磷酸酶抑制剂混合物来自Calbiochem（Merck Biosciences）。抗γH2AX、p53、Bax和Bcl-xL的抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（美国）。抗β-肌动蛋白的小鼠抗体来自Millipore（美国）。HRP偶联抗体的二级抗体和化学发光检测试剂盒来自Millipore（美国）。Immunostep的PI/RNA酶溶液试剂盒（西班牙萨拉曼卡）。

2.2. CT-DNA的氧化裂解

使用CT-DNA（0.5 mM）在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中评估CT-DNA氧化损伤，该缓冲液与10μM阿苯达唑在37°C下孵育24小时。样品在50 mM NaOH和冰醋酸中用1%的2-硫代巴比妥酸处理，并在100°C下培养30分钟。冷却后，在532nm处测量吸光度。对照组含有除阿苯达唑外的所有成分。铁（EDTA）-2:H2O（运行）2用于阳性对照（100μM/10 mM）[15].

2.3. 细胞毒性、抗增殖试验、细胞内活性氧水平和线粒体膜电位（ΔΨm）测定

人类乳腺癌细胞系MCF-7购自巴西里约热内卢细胞库。细胞在含有10%FBS、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100μg/mL）的DMEM高糖中培养。采用MTT法研究ABZ对细胞活力的影响[16].单元格（104细胞/孔）放置在96 well板上，汇合后暴露于ABZ（0–100μM）24小时。清洗细胞，用MTT（0.5 mg/mL）孵育2 h后，formazan晶体在DMSO中溶解。在550 nm处读取有色溶液。结果显示为浓度EC值50.

评估扩散在体外通过集落形成单位分析。将单细胞（500个细胞）密度的MCF-7细胞放置在六孔板中24小时。之后，用其他非细胞毒性浓度（5和10μM）的ABZ和MTX替代培养基，并再培养24小时。在对照孔中，细胞在仅含0.1%二甲基亚砜的培养基中培养。处理后，用热PBS清洗细胞，并提供新鲜培养基。细胞孵育16天，以菌落形成单位（CFU）计算增殖[17].

根据报告评估了细胞内ROS含量[18]将MCF-7细胞（15000）在37°C的HBSS中加载DCFH-DA（10μM），并孵育30分钟。用新鲜HBSS洗涤去除多余的DCFH-DA。之后，将细胞与ABZ（5-25μM）和甲氨蝶呤（MTX；相同浓度）孵育1小时，用HBSS洗涤两次，然后加入100μl/孔的HBSS。使用多扫描微孔板阅读器在485 nm处测量激发荧光强度，在530 nm处测量发射荧光强度。

使用荧光探针TMRE检测线粒体膜电位。MCF-7细胞（104/well）在荧光96-well板中，汇合后用不同浓度的ABZ（1、10和100µM）、NAC（5 mM）或与NAC相关的ABZ处理细胞。处理6小时后，用HBSS清洗细胞一次，并在37°C下用TMRE（1µM）培养20分钟。细胞用HBSS清洗一次后，使用549nm的激发峰和575nm的发射进行荧光强度测量。

2.4. 小鼠埃利希癌生长抑制

用等基因Balb-c小鼠（20±2 g）腹腔接种艾氏腹水癌，评价ABZ的抗肿瘤作用。动物程序是根据法律要求和当地伦理委员会的批准（CEUA/UFSC PP00784）和法律要求（NIH出版物#80-23，1978年修订）进行的。动物被安置在受控条件下，可以自由获取实验室食物和水。

通过接种5×10进行肿瘤诱导6埃利希癌细胞。24小时后，将小鼠分为3组（n=12）：对照组用生理盐水（50μl）处理。试验组在相同体积的载体（50μl）中给予ABZ 20 mg/kg。MTX（2.5 mg/kg）用于阳性对照[19]ABZ的剂量是根据该药物的最大饱和点预先选择的。接种肿瘤后24小时开始治疗，测量所有动物的腹围（时间零点）。在9天内每24小时重复一次。第十天，测量所有动物的腹围。然后，对每组中的一半进行安乐死，以评估腹水。肿瘤生长使用以下等式确定[20]：肿瘤生长抑制率（%）=100-[（治疗组腰围变化×100）/对照组腰围改变]。每组小鼠（n=6）存活以确定存活时间[21],[22].

2.5. 埃利希癌的抗氧化防御和氧化损伤生物标志物

收集治疗后的艾氏腹水荷瘤小鼠的腹水，并分析一些氧化应激标记物。通过使用硫代巴比妥酸法测量与TBA反应的物质来评估脂质过氧化，如下所述[23]蛋白质的氧化损伤被量化为羰基蛋白质，如下所述[24]。还原型谷胱甘肽（GSH）的含量按以下方法测定[25]过氧化氢酶（CAT）活性通过以下描述的方法动态测定[26]基于H的分解2O（运行）2240nm处吸光度降低。超氧化物歧化酶（SOD）活性是通过监测肾上腺素氧化为肾上腺素红来测定的，如下所述[27]谷胱甘肽还原酶（GR）活性通过测量340 nm处NADPH氧化速率来测定[28].在340 nm处用分光光度法监测反应[29]一般来说，通过Lowry方法测定的蛋白质含量对结果进行标准化[30].

2.6. 埃利希腹水癌细胞的DNA损伤

彗星试验用于评估治疗小鼠肿瘤细胞中的DNA片段[31]将细胞重悬于0.75%的低熔点琼脂糖中，并沉积在由1.5%的琼脂糖薄层覆盖的载玻片的表面上。允许在室温下设置10分钟。将载玻片浸没在裂解溶液（2.5 M NaCl；10 mM Tris；100 mM EDTA；1%Triton X-100%和10%DMSO；pH 10.0）中（2 h），然后在300 mA、8°C、带缓冲液（300 mM NaOH；1 mM EDTA；pH 13）的槽中进行水平电泳20 min。添加中和溶液（0.4 M Tris HCl；pH 7.5）（3次），然后用水冲洗并干燥。在固定溶液（15%TCA；5%ZnSO）中放置10分钟后4; 5%甘油）将载玻片清洗并再次干燥。用溴化乙锭（0.5 mg/mL）对载玻片进行染色，并在荧光显微镜下进行分析。每个核都收到一个从0（未损坏）到4（最大损坏）的任意值[32].

2.7. 埃利希癌细胞死亡评估和细胞周期阻滞

使用吖啶橙（200μM）和溴化乙锭（250μM）溶液（5μl）对腹水（25μl）中的肿瘤细胞进行染色。在显微镜检查之前，将样品与染色混合。细胞（300）在显微镜载玻片上进行可视化和分类。活细胞呈均匀的绿色。早期凋亡细胞呈绿色，细胞核内有明亮的绿点。晚期凋亡细胞也含有溴化乙锭，因此会染成橙色，但与坏死细胞相比，晚期凋亡细胞的细胞核浓缩且常常碎裂[33].

使用来自Immunostep（西班牙萨拉曼卡）的PI/RNAse溶液试剂盒，使用制造商建议的程序评估细胞周期停滞。埃利希瘤细胞（5×105)用PBS仔细清洗，制粒，并在冰镇乙醇（70%）中快速浸没固定，剧烈旋转。在−20°C下过夜固定后，用PBS清洗细胞，造粒，再悬浮并用PI/RNA酶溶液培养（室温下15分钟）。最后，用FACSCanto II（BD Biosciences）细胞仪对细胞进行评估。使用流动软件2.5.1处理数据。

2.8. 蛋白质印迹分析

治疗后，用PBS仔细清洗Ehrlich肿瘤细胞，并在添加有1%蛋白酶抑制剂和3%磷酸酶抑制剂鸡尾酒的RIPA缓冲液（50 mM Tris-Cl；pH 7.4；150 mM NaCl；1%NP40；0,25%Na-脱氧胆酸盐和1 mM苯甲基磺酰氟）中溶解。在Laemmli缓冲液（60 mM Tris-Cl；pH 6.8；2%SDS；10%甘油；5%β-巯基乙醇；0.01%溴酚蓝）中变性后，对来自全细胞匀浆的等量蛋白质（25μg）进行SDS-PAGE电泳，然后对硝化纤维素膜进行电印迹。在封闭和清洗后，将膜与一级抗体孵育过夜，再次清洗，然后与二级抗体进一步孵育。主要抗体为：Santa Cruz Biotechnology的多克隆兔抗p-组蛋白H2AX（sc-101696）、Santa Cru Biotechnology的抗p53（sc-6243）、抗Bax的小鼠单克隆抗体（sc-7480）和抗Bcl-xL的小鼠单抗（sc-8392）来自Santa Crux Biotechtology Inc，HRP偶联抗体的二级抗体和化学发光检测试剂盒来自Millipore（美国）。

2.9. 统计分析

体外检测分为三次，并独立重复三次。体内以n=12进行分析。数据记录为平均值±S。E.M.或百分比。数据通过ANOVA检验和Bonferroni检验进行分析。使用GraphPad Prism软件（5.01版）进行比较。p<0.05的值被认为具有统计学意义。

3.结果和讨论

在癌细胞中，抗肿瘤药物与DNA的相互作用导致细胞损伤和靶细胞死亡[34]用ABZ处理的CT-DNA发生氧化损伤(图1)这被认为是积极的，因为DNA损伤可以提供治疗癌症的机会[35],[36]有几个因素可以改变DNA的结构，如紫外线辐射、活性氧和氮物种以及外源性化合物[37].能够在脱氧核糖C4处氧化DNA的药物会导致DNA断裂，从而产生DNA降解产物，例如碱丙烯，这是一种TBA反应产物[38],[39]ABZ处理过度生成ROS，因此能够氧化脱氧核糖C4处的DNA，导致DNA断裂，TBARS检测到DNA断裂，表明ABZ对纯化DNA有直接作用。

图1。

阿苯达唑（ABZ）存在下CT-DNA裂解的评估。通过ABZ（10μM）处理的CT-DNA（500μM）中硫代巴比妥反应物（TBARS）的吸光度来评估分析。阴性对照（NC）：磷酸盐缓冲液。阳性对照（PC）：[Fe（EDTA）]2-/H（H）2O（运行）2数据表示三个独立实验的平均值。与对照组相比，***p<0.001时显著。

ABZ和MTX以浓度依赖的方式抑制细胞活性(图2A） ●●●●。欧盟委员会50该值是根据孵育24小时后进行的实验和EC计算得出的50所得值分别为44.9和45.7μM，表明ABZ和MTX对MCF-7细胞具有很高的细胞毒性。

图2。

阿苯达唑（ABZ）和甲氨蝶呤（MTX）治疗的MCF-7细胞系的评估。（A）体外ABZ和MTX对MCF-7细胞的细胞毒性。欧盟委员会50MTT还原试验在处理24小时（1-100μM）后获得的值。（B） ABZ和MTX分别在5和10μM下处理后，通过集落形成试验评估细胞增殖抑制。（C） 用ABZ和MTX分别在5和25μM浓度下处理1 h后，MCF-7细胞内ROS的含量。数据表示三个独立实验的平均值。数值表示为平均值±S。E.M，n=3.*和***分别表示p<0.1和p<0.001时与对照组未处理细胞相比的统计差异和###表示ABZ和MTX治疗之间的统计差异，分别为p<0.01和p<0.001。

据此，抗增殖评估表明ABZ和MTX处理抑制MCF-7集落形成(图2B） 然而，与MTX相比，相同浓度的ABZ的作用更为显著。ABZ处理后5μM的菌落形成抑制率约为67.5%，10μM时未观察到菌落形成。相同浓度的MTX分别抑制约36%和50%。

ABZ处理后MCF-7细胞内ROS含量增加(图2C） 以集中依赖的方式。这些结果表明，活性氧的过度生成可能参与ABZ处理的MCF-7细胞的细胞毒性作用，因为活性氧可以激活Bax，从而触发凋亡并降低细胞活力[40],[41].

为了验证抗氧化化合物是否影响ABZ ROS的生成，我们分析了N-乙酰基存在时ABZ的影响-我-半胱氨酸（NAC）。在NAC存在下，ABZ处理的MCF-7细胞中观察到的细胞毒性作用被逆转(图3A） 然而，NAC不能完全消除高浓度ABZ对MCF-7细胞的影响。ABZ处理后细胞内ROS增加(图3B） 在所有治疗中，NAC的存在完全逆转。线粒体膜电位（ΔΨm）的分析表明，ABZ（100µm）的存在降低了ΔΨm(图3C） 但NAC能够恢复这种效果。ΔΨm的缺失使细胞能量耗尽，随后死亡，显示出ABZ ROS产生和细胞凋亡触发的直接影响。

图3。

阿苯达唑（ABZ）和N-乙酰基对MCF-7细胞株作用的评价-我-半胱氨酸（NAC）。（A）体外ABZ（1–100μM）和NAC（5 mM）对MCF-7细胞的细胞毒性。治疗24小时后进行MTT还原试验。（B） ABZ（5、10和15μM）和NAC（5 mM）处理4 h后MCF-7细胞内ROS的含量。（C） ABZ（1–100μm）和NAC（5 mM）处理6 h后MCF-7细胞线粒体膜电位（ΔΨm）的测定。数据表示三个独立实验的平均值。数值表示为平均值±S。E.M，n=3.*和**分别表示p<0.1和p<0.01时与对照组未处理细胞相比的统计差异当p<0.01和p<0.001时，###表示ABZ和NAC治疗之间的统计差异。

这个体内用Ehrlich腹水癌荷瘤小鼠验证抗肿瘤活性的试验表明，ABZ（20 mg/kg）对肿瘤生长的抑制率为32%(图4A） 而MTX（2.5 mg/kg）导致了近55%。此外，MTX和ABZ治疗延长了动物的生存时间(图4B） ●●●●。MTX和ABZ效应之间的差异可能是由于相关的ABZ生物利用度低，因此需要进行药代动力学和结构活性研究，以提高该药物的溶解度。为了验证ABZ抗肿瘤活性以外的机制是否涉及ROS生物信号，使用腹水分析了氧化应激标记物。在这方面，检测到氧化标记物增加，MDA含量比ABZ治疗组高12.9倍，比MTX治疗组高7.2倍(图5A） ●●●●。类似地，羰基蛋白(图5B） 与对照组相比，ABZ（6.4倍）和MTX（2.0倍）也增加了。然而，与MTX相比，ABZ表现出更强的活性氧生成能力。因此，氧化应激的生物标志物与活性氧浓度的变化直接相关[42],[43]当抗氧化防御能力受损或被克服时，氧化应激会增强脂质过氧化和蛋白质羰基的形成[44]在某些情况下，羰基衍生物的形成可能是不可逆的，导致构象变化并降低抗氧化酶的催化活性[45]此外，众所周知，活性氧或氧化剂参与诱导凋亡和坏死[46].

图4。

阿苯达唑（ABZ，20 mg/kg）和甲氨蝶呤（MTX，2.5 mg/kg，阳性对照）对balb-c小鼠Ehrlich腹水癌的抗肿瘤活性。（A） ABZ和MTX生长抑制分析。（B） ABZ或MTX治疗的艾氏腹水癌荷瘤小鼠生存时间增加。数值表示为平均值±S。E.M，n=12。***表示p<0.001时与对照组（生理盐水组）未处理细胞相比的统计差异。

图5。

阿苯达唑（ABZ，20 mg/kg）或甲氨蝶呤（MTX，2.5 mg/kg，阳性对照）治疗的小鼠Ehrlich肿瘤细胞腹水中的氧化应激和抗氧化防御标记物。这种治疗对肿瘤细胞中的（A）脂质（脂质过氧化）和（B）蛋白质（羰基化）以及（C）GSH的消耗造成分子损伤。抗氧化酶活性增加：（D）超氧化物歧化酶（SOD）、（E）过氧化氢酶（CAT）和（F）谷胱甘肽还原酶（GR）。数值表示为平均值±S。E.M，n=12。与对照组（生理盐水组）相比，在*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001时显著##p＜0.01和p＜0.001表明ABZ组和MTX组之间具有显著性。

虽然三肽GSH水平显著降低，但两种药物治疗后，所有抗氧化酶如SOD、CAT和GR的活性均增加。总之，这些发现表明ABZ和MTX治疗引起的氧化应激增加，强调与MTX相比，ABZ表现出更大的效果。

谷胱甘肽含量急剧减少(图5C） 与对照组相比，观察到ABZ（96.77%）和MTX（81.87%），尽管GR活性增加（分别是ABZ和MTX对照组的2.5倍和1.3倍），表明ABZ是一种强大的ROS发生器(图5F） ●●●●。GSH氧化还原系统对减轻氧化应激很重要，在这个过程中，GSH作为一种广泛的自由基清除剂，被转化为氧化谷胱甘肽（GSSG），而GR不断地将GSSG转化回GSH[47]因此，两种处理中观察到的GR活性增加可以通过ROS过度生产来证明，ROS过量生产已知会增加GR活性[48]在这种情况下，我们的结果表明ABZ和MTX都增加了ROS生成，同时GSH耗竭和GR上调。

在癌细胞中，GSH代谢通常上调，这表明癌细胞依赖于GSH代谢[49]因此，癌细胞似乎严重依赖谷胱甘肽还原等价物来维持氧化还原稳态，以应对氧化挑战，而通过限制其合成和/或抑制其氧化还原再循环来操纵谷胱甘苷已被证明是使这种细胞克隆原对细胞死亡增敏的有效方法。GSH氧化还原在多种细胞类型细胞凋亡中的作用[50]说明了使用这种策略抑制肿瘤细胞生长的重要性。

根据[51]SOD和CAT抑制是肿瘤生长的结果，而这两种酶活性的增加对肿瘤抑制很重要。因此，ABZ和MTX被证明是有效的肿瘤抑制剂，可能是因为它们能够上调SOD和CAT活性(图5D和E）。ABZ使SOD活性增加1.64倍，CAT活性增加2.22倍，而MTX分别增加1.13和1.73倍。此外，根据[12]在ABZ诱导的氧化应激的对比研究中，SOD活性的增加将使H升高2O（运行）2细胞内的浓度，这与ABZ处理下发现的高CAT活性一致(图5E） ●●●●。此外，细胞内H相对轻微增加2O（运行）2根据我们的结果，ABZ可以诱导细胞凋亡，并促进ROS生成以及SOD和CAT活性的增加，导致凋亡细胞死亡。MXT诱导SOD和CAT活性，而ABZ显示出更大的酶活性增加。

在ABZ调节氧化应激的背景下，ABZ治疗后证实Ehrlich细胞DNA损伤和凋亡细胞死亡增加。测量DNA片段(图6A） 结果表明，ABZ处理的Erhlich细胞DNA损伤强烈（损伤指数为99.5），与MTX（73.0）相比更为明显。这些损伤可能与ABZ促进的活性氧生成增加有关，从而影响DNA细胞。免疫印迹试验证实了这一结果(图6B） 表明ABZ处理增加了γH2AX的含量（与对照组相比增加了5.1倍），其效果再次超过MTX处理（2.5）。细胞死亡结果表明，ABZ诱导的活性氧生成引起的DNA片段损伤可能是凋亡导致细胞死亡增加的原因。凋亡细胞的ABZ显著增加（与对照组相比增加了5.4倍），而活细胞显著减少(图7A） ●●●●。此外，MTX增加了细胞凋亡（与对照组相比增加了5.3倍），提高了坏死率（与对照相比增加了9.2倍），这些反应在ABZ治疗后没有观察到。免疫印迹试验证实了这一结果(图7B） 与对照组相比，ABZ和MTX治疗组p53和促凋亡Bax表达增加，而抗凋亡Bcl-xL表达减少。

图6。

阿苯达唑（ABZ，20 mg/kg）和甲氨蝶呤（MTX，2.5 mg/kg，阳性对照）对Ehrlich腹水癌细胞腹水DNA的影响。（A） 彗星实验测定DNA损伤指数，免疫印迹法测定（B）γH2AX。数值表示为平均值±S。与对照组（生理盐水组）相比，E.M.在***p<0.001时显著###p<0.001表明ABZ组和MTX组之间存在显著性差异。

图7。

阿苯达唑（ABZ，20 mg/kg）和甲氨蝶呤（MTX，2.5 mg/kg，阳性对照）诱导细胞凋亡和坏死。（A） 吖啶橙/溴化乙锭染色检测细胞凋亡。（B） 免疫印迹法检测前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白p53、Bax和Bcl-xL。与对照组（生理盐水组）相比，***p<0.001和*p<0.05时具有显著性#p<0.05表明ABZ组和MTX组之间存在显著性差异。

根据[52]，氧化应激暴露诱导细胞DNA损伤已被证实。γH2AX是组蛋白H2A的变体，在ser139处磷酸化以应对DNA损伤[53]通过这种方式，ROS可以激活p53[54]，根据[49]p53激活后，出现各种促凋亡因子的表达，包括Bax。反过来，Bax激活导致凋亡途径的上游汇聚到细胞自我构建的最后阶段。此外，在无细胞系统中，增加线粒体Bax/Bcl-xL的比率会在仅有BH3的蛋白质tBid存在的情况下诱导Bax活化和线粒体释放细胞色素c[55]此外，p53在异常增殖信号和压力（包括DNA损伤）下控制细胞凋亡[56]我们的结果显示Bax/Bcl-xL的相关性增加，从而证实ABZ诱导线粒体相关的凋亡途径(图7B） 与MTX相比速度更快。Bax/Bcl-xL增加的相关率与p53增加一致，因为p53依赖性凋亡与线粒体细胞色素c释放有关[56].

最后，细胞周期分析(图8A） 表明阿苯达唑和甲氨蝶呤处理的艾氏腹水癌（EAC）细胞与未处理的EAC细胞（对照）相比显示出不同的细胞周期特征。与对照组相比，两种处理都减少了G1期细胞的数量。我们的结果(图8A和B）显示，ABZ除抑制EAC癌G1期阻滞G2/M期外，还如预期的那样，提示ABZ在这种细胞类型中的作用机制似乎与抑制微管蛋白聚合有关[57]在这种情况下，微管（由α微管蛋白和β微管蛋白亚基组成的异二聚体）对于有丝分裂纺锤体的形成和消失是不可或缺的，换句话说，它们负责细胞分裂过程中复制染色体的分离，同时通过抑制微管蛋白聚合或阻止微管蛋白解聚来破坏微管动力学，从而促进细胞周期阻滞在G2/M期[57],[58]MTX分析显示G1期被抑制，S期被阻滞。在这种情况下，MTX对EAC生长的抑制可能与调控途径有关，包括抑制G0/G1-S期细胞周期进展和诱导凋亡[59]以及与生长抑制活动相关的S期阻滞。已经描述了生长抑制、诱导凋亡和S-G2期细胞周期阻滞等作用[60]白藜芦醇处理的HL60早幼粒细胞白血病细胞。因此，[61]表明膀胱癌细胞系生长抑制是通过使用环丙沙星阻止S/G2-M细胞周期和凋亡介导的。

图8。

阿苯达唑（ABZ，20 mg/kg）和甲氨蝶呤（MTX，2.5 mg/kg，阳性对照）对细胞周期调节的影响。ABZ治疗后处于G1、G1、S和G2/M亚期的EAC细胞百分比。与对照组（生理盐水组）相比，**p<0.01和**p<0.001时显著。

4.结论

ABZ调节氧化应激揭示了一种有趣的癌症治疗方法。ABZ促进ROS生成在体外可能是由于这些细胞的增殖和生存能力受到强烈抑制，因此似乎是导致人类乳腺癌细胞死亡的原因。ABZ处理体内也表明与氧化应激途径有关，导致还原型谷胱甘肽水平降低，重要氧化生物标志物和抗氧化酶活性增加，以及促进EAC细胞相对于正常细胞的抗氧化防御系统受损，从而诱导凋亡途径的激活。此外，ABZ能够在体外破坏CT-DNA，而在EAC细胞中，该药物似乎通过诱导DNA片段化参与与DNA损伤相关的表观遗传修饰，以及增加促凋亡蛋白的表达。所有这些作用都被一种重要的抗癌药物所强调体内这表明ABZ是可能用于人类乳腺癌治疗的药物重新定位的分子原型。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

致谢

L.S.E.P.W Castro、F.Ourique、V.M.A.S Grienevicius和E.B.Parisotto获得了巴西高等教育研究院（CAPES）的研究资助。RC Pedrosa（Proc.302404/2011-2）和DWF（Proc.303234/2015-6）获得了巴西国家科学院（CNPq）的研究资助。金属神经毒性实验室组长Marcelo Farina教授和Diones C.Bueno女士为线粒体膜电位研究提供技术支持。

工具书类

1JoséAlencar Gomes da Silva国家癌症研究所（INCA）。Estimate/2014：巴西癌症发病率，见《预防和监测总协调》（Ed.）。结果和评论摘要，《女性乳腺癌》，里约热内卢，INCA，2014年，第35页。
2梁晓杰、陈灿、赵莹、王鹏。利用纳米技术规避肿瘤对化疗的耐药性。方法分子生物学。2010;596:467–488.〈http://dx.doi.org/10.1007/978-1-60761-416-6_21〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
3Ashburn T.T.，Thor K.B.药物重新定位：确定和开发现有药物的新用途。Nat.Rev.毒品迪斯科。2004年；三:673–683.〈网址：http://dx.doi.org/10.1038/nrd1468〉[公共医学][谷歌学者]
4阿普克罗夫特P.，阿普克罗夫J.A.厌氧原生动物中的药物靶点和耐药机制。临床。微生物评论。2001;14:150–164.〈http://dx.doi.org/10.128/CMR.14.1.150-164.2001〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5Bertram G.K.第5版。第55章。伦敦；阿普尔顿和兰格：1992年。驱虫药的临床药理学。收录：普伦蒂斯·霍尔出版部。基础与临床药理学；第748页。[谷歌学者]
6Martin R.J.驱虫药的作用模式。兽医。J。1997;154:11–34.〈http://dx.doi.org/10.1016/S1090-0233（05）80005倍[公共医学][谷歌学者]
7Pourgholami M.H.、Woon L.、Almajd R.、Akhter J.、Bowery P.、Morris D.L.阿苯达唑对肝细胞癌细胞生长的体内外抑制。癌症快报。2001;165:43–49.〈http://dx.doi.org/10.1016/S0304-3835(01)00382-2〉[公共医学][谷歌学者]
8Khalilzadeh A.、Wangoo K.T.、Morris D.L.、Pourgholami M.H.Epothilone-紫杉醇耐药白血病细胞CEM/dEpoB300对阿苯达唑敏感：参与凋亡途径。生物化学药物。2007;74:407–414.〈http://dx.doi.org/10.1016/j.bcp.2007.05.006〉[公共医学][谷歌学者]
9Chu S.W.，Badar S.，Morris D.L.，Pourgholami M.H.阿苯达唑对微管蛋白聚合和耐紫杉醇1A9PTX22人卵巢癌细胞增殖的有效抑制。抗癌研究。2009;29:3791–3796.[公共医学][谷歌学者]
10Patel K.、Doudican N.A.、Schiff P.B.、Orlow S.J.Albendazole使癌细胞对电离辐射敏感。辐射。昂科尔。2011年；6:1–7.〈http://dx.doi.org/10.1186/1748-717X-6-160〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Kaushik N.K.，Kaushik N.，Park D.，Choi E.H.改变的抗氧化系统刺激介电屏障放电等离子体诱导的细胞死亡，用于实体瘤细胞治疗。公共科学图书馆一号。2014;9：e103349。〈http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0103349〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Locatelli C.、Pedrosa R.C.、de Bem A.F.、Creczynski-Pasa T.B.、Cordova C.A.、Wilhelm Filho D.阿苯达唑和甲苯达唑诱导的时间依赖性氧化应激的比较研究。氧化还原代表。2004年；9:89–95.〈http://dx.doi.org/10.1179/135100004225004751〉[公共医学][谷歌学者]
13Salimi A.，Roudkenar M.H.，Sadeghi L.，Mohseni A.，Seydi E.，Pirahmadi N.，Pourahmad J.Ellagic acid，一种多酚化合物，通过直接靶向线粒体选择性诱导ROS介导的CLL患者癌性B淋巴细胞凋亡。生物。2015;6:461–471.〈http://dx.doi.org/10.1016/j.redox.2015.08.021〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Mukawera E.、Chartier S.、Williams V.、Pagano P.J.、Lapointe R.、Grandvaux N.Redox-调节剂靶向人类乳腺癌细胞系中NOX2依赖性IKKε癌基因激酶的表达和增殖。氧化还原。生物。2015;6:9–18.〈http://dx.doi.org/10.1016/j.redox.2015.06.010〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Jun T.，Bochu W.，Liancai Z.槲皮素-锰（II）复合物对DNA的水解切割。胶体表面B生物界面。2007;55:149–152.〈http://dx.doi.org/10.1016/j.colsurfb.2006.11.044〉[公共医学][谷歌学者]
16Mosmann T.细胞生长和存活的快速比色分析：应用于增殖和细胞毒性分析。免疫学杂志。方法。1983;65:55–63.〈http://dx.doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4〉[公共医学][谷歌学者]
17Franken N.A.P.、Rodermond H.M.、Stap J.、Haveman J.、van Bree C.体外细胞克隆试验。《国家协议》。2006;1:2315–2319.〈http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2006.339〉[公共医学][谷歌学者]
18Glorieux C.、Dejeans N.、Sid B.、Beck R.、Calderon P.B.、Verrax J.乳腺癌细胞中过氧化氢酶过度表达导致侵袭性较小的表型和化疗反应的改变。生物化学药物。2011年；82：1384–1390。〈http://dx.doi.org/10.1016/j.bcp.2011.06.007〉[公共医学][谷歌学者]
19Kabel A.M.、Abdel-Rahman M.N.、El-Sisi Ael D.、Haleem M.S.、Ezzat N.M.、El-Rashidy M.A.阿托伐他汀和甲氨蝶呤对实体性埃利希肿瘤的影响。欧洲药理学杂志。2013;713:47–53.〈http://dx.doi.org/10.1016/j.ejphar.2013.04.049〉[公共医学][谷歌学者]
20Farias M.S.、Pich C.T.、Kviecinski M.R.、Bucker N.C.、Felipe K.B.、Da Silva F.O.、Gunther T.M.、Correia J.F.、Rios D.、Benites J.、Valderrama J.A.、Calderon P.B.、Pedrosa R.C。取代的3酰基2苯氨基1，4萘醌嵌入DNA中，通过增加活性氧物种的生成而引起遗传毒性，最终导致细胞死亡。摩尔医学代表。2014;10:405–410.〈http://dx.doi.org/10.3892/mmr.2014.2160〉[公共医学][谷歌学者]
21Kaplan E.L.，Meier P.不完全观测的非参数估计。美国统计协会。1958;53:457.〈http://dx.doi.org/101080/01621459.1958.10501452〉 [谷歌学者]
22Gupta M.、Mazumder U.K.、Rath N.、Mukhopadhyay D.K.决明子甲醇提取物对埃利希腹水癌的抗肿瘤活性。J.乙烯利。2000;72：151–156。〈http://dx.doi.org/10.1016/S0378-8741(00)00227-0〉[公共医学][谷歌学者]
23Ohkawa H.，Ohishi N.，Yagi K.通过硫代巴比妥酸反应测定动物组织中的脂质过氧化物。分析。生物化学。1979;95:351–358.〈http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(79)90738-3〉[公共医学][谷歌学者]
24Levine R.L.、Garland D.、Oliver C.N.、Amici A.、Climent I.、Lenz A.-G.、Ahn B.-W.、Shaltiel S.、Stadtman E.R.[49]氧化修饰蛋白质中羰基含量的测定。方法酶学。1990;186:464–478.〈http://dx.doi.org/10.1016/0076-6879（90）86141-H〉[公共医学][谷歌学者]
25Beutler E.、Duron O.、Kelly B.M.血液谷胱甘肽测定的改进方法。J.实验室临床。医学。1963;61:882–888.[公共医学][谷歌学者]
26Aebi H.[13]体外培养的过氧化氢酶。方法酶学。1984;105:121–126.〈http://dx.doi.org/10.1016/S0076-6879(84)05016-3〉[公共医学][谷歌学者]
27Misra H.P.，Fridovich I.超氧化物阴离子在肾上腺素自氧化中的作用和超氧化物歧化酶的简单测定。生物学杂志。化学。1972;247:3170–3175.[公共医学][谷歌学者]
28Carlberg I.，Mannervik B.【59】谷胱甘肽还原酶。方法酶制剂。1985;113:484–490.〈http://dx.doi.org/10.1016/S0076-6879(85)13062-4〉[公共医学][谷歌学者]
29Habig W.H.、Pabst M.J.、Jakoby W.B.谷胱甘肽S-转移酶。巯基酸形成的第一个酶步骤。生物学杂志。化学。1974;249:7130–7139.[公共医学][谷歌学者]
30Lowry O.H.、Rosebrough N.J.、Farr A.L.、Randall R.J.用福林酚试剂测量蛋白质。生物学杂志。化学。1951;193:265–275.[公共医学][谷歌学者]
31Singh N.P.、McCoy M.T.、Tice R.R.、Schneider E.L.，一种简单的定量单个细胞中低水平DNA损伤的技术。实验细胞研究。1988;175:184–191.〈http://dx.doi.org/10.1016/0014-4827(88)90265-0〉[公共医学][谷歌学者]
32Ross G.M.、McMillan T.J.、Wilcox P.、Collins A.R.单细胞微凝胶电泳分析（彗星分析）：技术方面和应用：癌症研究所第五届LH Gray Trust研讨会报告，1994年。穆塔特。物件。1995;337：57–60。〈http://dx.doi.org/10.1016/0921-8777(95)00007-7〉[公共医学][谷歌学者]
33Kasibhatla S.、Amarante-Mendes G.P.、Finucane D.、Brunner T.、Bossy-Wetzel E.、Green D.R.吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色检测细胞凋亡。CSH协议。2006;三:4493.〈http://dx.doi.org/10.1101/pdb.prot4493〉[公共医学][谷歌学者]
34Bischoff G.，Hoffmann S.DNA-药物治疗中药物的结合。货币。药物化学。2002;9:321–348.〈http://dx.doi.org/10.2174/0929867023371085〉[公共医学][谷歌学者]
35Lord C.J.，Ashworth A.DNA损伤反应和癌症治疗。自然。2012;481:287–294.〈http://dx.doi.org/10.1038/nature10760〉[公共医学][谷歌学者]
36Hosoya N.、Miyagawa K.，癌症治疗中针对D.N.A.损伤反应。癌症科学。2014;105:370–388.〈http://dx.doi.org/10.1111/cas.12366〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
37Mikhed Y.，Görlach A.，Knaus U.G.，Daiber A.通过影响基因表达、表观遗传途径和DNA损伤/修复来调节基因组稳定性。氧化还原生物。2015;5:275–289.〈http://dx.doi.org/10.1016/j.redox.2015.05.008〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Ciriolo M.R.、Peisach J.、Magliozzo R.S.《博莱霉素与细胞核和纯化DNA相互作用的比较研究》。生物学杂志。化学。1989年；264:1443–1449.[公共医学][谷歌学者]
39姜强，肖恩，石鹏，朱瑜，郭姿。具有氧化机制的人工金属核酸酶的设计。协调。化学修订版。2007;251:1951–1972.〈http://dx.doi.org/10.1016/j.ccr.2007.02.013〉 [谷歌学者]
40Portt L.、Norman G.、Clapp C.、Greenwood M.、Greenwood M.T.《抗凋亡和细胞存活：综述》。Biochim生物物理学。《学报》。1813;238–259:2011.〈http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamcr.2010.10.010〉[公共医学][谷歌学者]
41Ryter S.W.、Kim H.P.、Hoetzel A.、Park J.W.、Nakahira K.、Wang X.、Choi A.M.氧化应激中细胞死亡的机制。抗氧化剂。氧化还原信号。2007;9:49–89.〈http://dx.doi.org/10.1089/ars.2007.9.49〉[公共医学][谷歌学者]
42Barker C.W.、Fagan J.B.、Pasco D.S.通过氧化应激下调分离肝细胞中P4501A1和P4501A2 mRNA的表达。生物学杂志。化学。1994;269:3985–3990.[公共医学][谷歌学者]
43Ahmad I.，Pacheco M.，Santos M.A.酶和非酶抗氧化剂作为对安圭拉在原位港口水域暴露后吞噬细胞诱导的损伤的适应。生态毒理学。环境。安全。2004年；57:290–302. 〈http://dx.doi.org/10.1016/S0147-6513〉(03)00080-0. [公共医学][谷歌学者]
44StepićS.、Hackenberger B.K.、Hackennerger D.K.、Velki M.、Lonćarić。硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）和蛋白质羰基水平（PC）指示的氧化应激对鲤鱼（Cyprinus carpio）乙氧基resurufin-O-deethylase（EROD）诱导的影响水-空气-土壤调查。2012;223:4785–4793.〈http://dx.doi.org/10.1007/s11270-012-1234-1〉 [谷歌学者]
45Parvez S.、Raisuddin S.蛋白质羰基：淡水鱼Channa punctata（Bloch）暴露于氧化应激诱导杀虫剂的新生物标记物环境。毒物。药学。2005;20:112–117.〈http://dx.doi.org/10.1016/j.etap.2004.11.002〉[公共医学][谷歌学者]
46Vairetti M.、Ferrigno A.、Bertone R.、Richelmi P.、BertèF.、Freitas I.凋亡与坏死：大鼠肝细胞复温期间谷胱甘肽介导的细胞死亡。Biochim生物物理学。《学报》。1740;367–374：2005年。〈网址：http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2004.11.022〉[公共医学][谷歌学者]
47Yao J.K.，Leonard S.，Reddy R.精神分裂症患者谷胱甘肽氧化还原状态的改变。数字化信息系统。标记。2006;22:83–93.〈http://dx.doi.org/10.1155%2F2006%2F248387〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
48Frasier C.R.、Moukdar F.、Patel H.D.、Sloan R.C.、Stewart L.M.、Alleman R.J.、La Favor J.D.、Brown D.A.谷胱甘肽还原酶和运动预适应中的氧化还原依赖性增加：NADPH氧化酶和线粒体的作用。心血管研究。2013;98：47–55。〈http://dx.doi.org/10.1093/cvr/cvt009〉[公共医学][谷歌学者]
49周德，邵立，斯皮茨D.R.第1章-正常和肿瘤干细胞中的活性氧物种。高级癌症研究。2014;122:1–67.〈http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-420117-0.00001-3〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
50Circu M.L.、Aw T.Y.活性氧物种、细胞氧化还原系统和细胞凋亡。自由基。生物医学。2010;48:749–762.〈http://dx.doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2009.12.022〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51Gupta M.、Mazumder U.K.、Kumar R.S.、Sivakumar T.、Vamsi M.L.M.邦杜氏Caesalpinia bonducella对瑞士白鼠艾氏腹水癌的抗肿瘤活性和抗氧化状态。药学杂志。2004年；94:177–184.〈http://doi.org/10.1254/jphs.94.177〉[公共医学][谷歌学者]
52Shiloh Y.，Ziv Y.ATM蛋白激酶：调节细胞对基因毒性应激的反应，等等。自然修订版分子细胞生物学。2013;14:197–210.〈http://doi.org/10.1038/nrm3546〉[公共医学][谷歌学者]
53Vijayakurup V.、Carmela S.、Carselo D.、Corrado T.、Srinivas P.、Gopala S.咖啡酸苯并[kl]黄原木脂素与DNA相互作用诱导结肠癌细胞的DNA损伤和凋亡。生命科学。2012;91:1336–1344.〈http://doi.org/10.1016/j.lfs.2012.10.013〉[公共医学][谷歌学者]
54Ditch S.，Paull T.T.ATM蛋白激酶和细胞氧化还原信号传导：超越DNA损伤反应。生物化学科学趋势。2012;37:15–22.〈http://doi.org/10.1016/j.tibs.2011.10.002〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
55Liu F.T.，Goff L.K.，Hao J.H.，Newland A.C.，Jia L.线粒体Bax/Bcl-XL比率的增加诱导人类白血病K562细胞系中Bax活化。细胞凋亡。2004年；9:377–384.〈http://doi.org/10.1023/B:APPT.0000025815.78761.5c〉[公共医学][谷歌学者]
56Benchimol S.p53依赖性凋亡途径。自然细胞死亡分化。2001;8:1049–1051.[公共医学][谷歌学者]
57Arora S.，Wang X.I.，Keenan S.M.，Andaya C.，Zhang Q.，Peng Y.，Welsh W.J.新型微管聚合抑制剂，具有强大的抗增殖和抗肿瘤活性。癌症研究。2009;69:1910–1915.〈http://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-08-0877〉 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
58Shin J.W.、Son J.Y.、Kang J.K.、Han S.H.、Cho C.K.和Son C.G.瓜蒌块茎提取物通过抑制HepG2细胞中的微管蛋白聚合诱导G2/M期阻滞。J.乙烯利。2008;115:209–216.〈http://doi.org/10.1016/j.jep.2007.09.030〉[公共医学][谷歌学者]
59Qin C.，Morrow D.，Stewart J.，Spencer K.，Porter W.，Smith R.，Phillips T.，Abdelrahim M.，Samudio I.，Safe S.抑制乳腺癌细胞生长的新型过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARgamma）激动剂：1,1-双（3′-吲哚）-1-(第页-取代苯基）甲烷。摩尔癌症治疗。2004年；三247-60. [公共医学][谷歌学者]
60Joe A.K.、Liu H.、Suzui M.、Vural M.E.、Xiao D.、Weinstein I.B.白藜芦醇在几种人类肿瘤细胞系中诱导生长抑制、S期阻滞、凋亡和生物标记物表达的变化。临床。癌症研究。2002;8:893–903.[公共医学][谷歌学者]
61Aranha O.、Wood D.P.，Jr.、Sarkar F.H.环丙沙星介导的膀胱移行细胞癌细胞生长抑制、S/G2-M细胞周期阻滞和凋亡。临床。癌症研究。2000;6:891–900.[公共医学][谷歌学者]
文章来自氧化还原生物学由以下人员提供爱思维尔