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氧化还原生物。2016年12月；10: 78–89.
2016年9月21日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.redox.2016.09.06
预防性维修识别码：PMC5048112
PMID：27697670

雷帕霉素和EF24的协同抗肿瘤活性通过提高活性氧治疗胃癌

陈伟谦,a、，b 邹鹏,a、，c（c） 赵忠伟,b Xi Chen（陈曦）,一 小西凡,b 拉贾马尼坎·维诺特库马尔,一 李翠（音）,一 吴发宗,b 张倩倩,b 广亮,a、，c、，⁎和Jiansong季a、，b、，⁎⁎
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

雷帕霉素的机械/哺乳动物靶点（mTOR）已成为胃癌的一种新的潜在治疗靶点。雷帕霉素和雷帕霉素类似物正在进行临床试验，并在一组癌症患者中产生了临床反应。然而，安全剂量的雷帕霉素单药治疗未能诱导细胞凋亡和肿瘤消退，阻碍了其临床应用。这导致了对更有效的组合方案的探索，以提高雷帕霉素的疗效。在本研究中，我们研究了雷帕霉素和活性氧（ROS）诱导剂EF24在胃癌中的联合作用。我们发现雷帕霉素增加了胃癌细胞内的活性氧水平，并与EF24表现出选择性协同抗肿瘤活性。这种活性是通过激活癌细胞中的c-Jun N末端激酶和内质网应激（ER）通路介导的。我们还发现，抑制ROS积累可以逆转内质网应激，并防止雷帕霉素和EF24联合诱导的细胞凋亡。在免疫缺陷小鼠中使用人类胃癌异种移植物证实了这些机制。总之，我们的工作为胃癌的治疗提供了一种新的治疗策略。这项工作表明，活性氧的产生可能是开发新的癌症治疗联合疗法的一个重要目标。

缩写：4E-BP-1，真核启动因子4E结合蛋白-1；ATF4，激活转录因子4；Bcl2，B细胞淋巴瘤2；C/EBP、CAAT/增强子结合蛋白；cdc-2、细胞周期蛋白依赖性激酶1（细胞分裂周期蛋白2）；CHOP、CAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）同源蛋白；；DCF，二氯二氢荧光素；DCFH-DA，2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯；eIF2，真核生物起始因子2；内质网；异硫氰酸荧光素；JC-1，阳离子碳菁染料；辣根过氧化物酶；JNK，c-Jun N末端激酶；Ki-67，与细胞增殖相关的核蛋白；丙二醛；MDM-2，小鼠双分2；mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点；mTORC，mTOR复合物；MTT，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵；N-乙酰半胱氨酸；S6、S6核糖体蛋白；聚ADP-核糖聚合酶；蛋白激酶RNA-like内质网激酶；PI，碘化丙啶；PI3激酶、磷脂酰肌醇3-激酶；活性氧
关键词：胃癌、雷帕霉素、EF24、氧化应激、细胞毒性、抗肿瘤

集锦

  • •
    雷帕霉素与EF24在胃癌细胞中表现出协同抗肿瘤活性。
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    EF24增强雷帕霉素诱导的活性氧生成。
  • •
    EF24和雷帕霉素联合激活内质网应激和线粒体功能障碍。
  • •
    EF24增强雷帕霉素的疗效体内试验。

1.简介

胃癌是全球第二大癌症相关死亡原因[1]手术是早期胃癌的唯一治疗方法。然而，大多数患者在早期无症状，一半以上的患者被临床诊断为远处转移。此类转移病例大多无法治愈，5年生存率低于10%[2],[3]辅助和靶向化疗在减少疾病复发和提高长期生存率方面表现出显著的益处[4]然而，当前抗癌药物的严重副作用和并发症，包括血液学和胃肠道毒性，是一个重大的临床挑战[5],[6]因此，需要新的药物和/或新的治疗组合来治疗胃癌患者。

雷帕霉素是mTOR复合物1的非ATP竞争性抑制剂，是一种具有抗真菌和免疫抑制活性的细菌大环内酯[7],[8]雷帕霉素及其类似物通过抑制mTOR通路并使重要的下游激酶、p70S6激酶和真核启动因子4E结合蛋白-1（4E-BP-1）失活，证明了其在癌症治疗中的有效性[9]S6K1和4E-BP1的去磷酸化抑制参与细胞周期调节和细胞增殖的基因的表达。雷帕霉素及其类似物在胃癌中均显示出抗肿瘤活性在体外在动物模型中[10]然而，最近的研究结果表明，mTOR抑制剂可使大多数癌症类型的病情稳定，而不是退化[11]因此，有人建议mTOR靶向治疗和其他化疗可用于联合治疗，以在癌症治疗中诱导细胞毒性反应，而不是细胞抑制反应。

我们最近发现，肿瘤细胞中活性氧（ROS）的产生是联合抗肿瘤治疗协同细胞毒性的机制之一[12],[13],[14].活性氧是许多细胞过程的正常副产物，如线粒体代谢和蛋白质折叠[15]与正常细胞相比，癌细胞本身具有较高的活性氧水平，并且由于氧化还原状态不平衡而处于氧化应激状态[15],[16]因此，人们认为癌细胞无法应对额外的氧化应激，并对提高活性氧水平的药物变得敏感[17]以活性氧为靶点是癌症的重要治疗策略，例如三烯醇等癌症药物[18]，紫杉醇[19]和2-甲氧基雌二醇[20]我们以前的研究发现金诺芬和哌龙尿在胃癌细胞中诱导ROS依赖的协同细胞毒性[12]因此，提出了基于活性氧的新型联合治疗策略，以进一步改善胃癌患者的预后。

在本研究中，我们研究了一种基于活性氧的胃癌联合治疗方法，该方法利用雷帕霉素和一种新型姜黄素类似物EF24。EF24被确定为以ROS依赖的方式对癌细胞具有选择性毒性[13]我们目前的研究表明，EF24使胃癌细胞对雷帕霉素敏感在体外通过触发ROS介导的c-jun N末端激酶激活和诱导内质网应激凋亡途径。此外，我们发现雷帕霉素与EF24联合使用可显著降低肿瘤生长体内总之，这些结果表明雷帕霉素联合活性氧诱导剂可能为胃癌治疗提供一种有效的替代方案。

2.材料和方法

2.1. 细胞培养和试剂

雷帕霉素购自Selleck Chemicals（德克萨斯州休斯顿）。姜黄素类似物EF24、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和过氧化氢酶购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。人胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823以及正常人胃上皮细胞GES-1购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）。所有类型的细胞均在添加了10%热灭活胎牛血清（Gibco）、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基（Gibco:Eggenstein，Germany）中培养。抗Bcl-2、Bax、裂解聚ADP核糖聚合酶（PARP）、小鼠双分2（MDM2）、CDC2、细胞周期蛋白B1和GAPDH的抗体来自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）。抗p-mTOR抗体（Ser2448)，p-4EBP1（Thr37/46)、CHOP（CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白）、ATF4（激活转录因子4）、p-JNK（Thr183/提尔185)、JNK、LC3A/B、Beclin-1、p-PERK（Thr981)、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸蛋白酶-3、p-S6（Ser240/244)和p-eIF2α和eIF2β（真核起始因子2）购自Cell Signaling Technology（Danvers，MA）。次级辣根过氧化物酶（HRP）结合抗体是从圣克鲁斯生物技术公司获得的。异硫氰酸荧光素（FITC）-AnnexinV凋亡检测试剂盒I和碘化丙啶（PI）购自BD Pharmingen（新泽西州富兰克林湖）。

2.2. 细胞活力测定

细胞以8×10的密度接种在96个板中三每个孔，允许在含有血清的RPMI培养基中放置过夜。雷帕霉素溶解于二甲基亚砜中，并在1640介质中稀释至最终浓度0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40和80μM。EF24溶解于二甲基亚砜中，并在1640介质中稀释至0.1562、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10和20μM的最终浓度。然后用增加浓度的雷帕霉素或EF24单独或联合处理细胞24小时，然后用MTT法测定细胞活力。

2.3. 细胞凋亡分析

细胞用雷帕霉素处理。EF24或雷帕霉素和EF24的联合用药24小时。NAC或过氧化氢酶预处理（如有指示）进行2小时。然后收集细胞，用FITC-结合的Annexin V和PI标记，并用流式细胞术进行分析。使用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9活性测定试剂盒（Beyotime生物技术研究所，中国北京）测定细胞裂解物中的半胱氨酸蛋白酶9活性。活性水平通过相应细胞裂解物的蛋白质浓度标准化，并表示为处理细胞与对照细胞的百分比。

2.4. 活性氧生成的测量

如前所述，通过流式细胞术测量细胞活性氧水平[13],[14]简单地说，5×105细胞被镀在60毫米的培养皿上，可以贴上过夜。将细胞暴露于雷帕霉素、EF24或两者的组合中指定的时间段。然后用10μM二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA；Beyotime Biotech，中国南通）对细胞进行染色。在活性氧存在下，DCFH-DA氧化为二氯二氢荧光素（DCF）。采用FACSCalibur流式细胞术分析DCF荧光。

2.5. 蛋白质印迹分析

制备细胞裂解物，并通过Bradford试验（加州Hercules Bio-Rad）测定蛋白质水平。蛋白质通过10%SDS-PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯转移膜。在室温下用新鲜制备的5%脱脂乳在TBST中封闭印迹2小时，然后在4°C下与特异性一级抗体孵育过夜。使用HRP结合的次级抗体和ECL底物（Bio-Rad、Hercules、CA）进行检测。使用Image J软件（马里兰州国家卫生研究所）分析免疫反应带的密度。

2.6. 电子显微镜

SGC-7901细胞用载体对照（DMSO，3μL）或雷帕霉素和EF24的联合治疗。NAC和过氧化氢酶预处理进行2 h。处理后，用2.5%戊二醛在4°C下过夜固定细胞。然后在室温下将细胞在1%OsO4中固定60分钟，用1%乙酸铀酰染色，通过分级丙酮溶液脱水，并嵌入epon中。将含有细胞的区域块状安装，切割成70 nm的切片，并用电子显微镜进行检查（H-7500，日立，茨城，日本）。

2.7. 线粒体膜电位（Δψm）的评估

采用JC-1（Thermo Fisher）荧光显微镜观察雷帕霉素和EF24对线粒体膜电位（Δψm）的协同作用。JC-1是一种积聚在线粒体中的阳离子碳菁染料。一旦膜电位发生变化，JC-1就会泄漏到胞浆中。细胞暴露于雷帕霉素和EF24 14h。NAC和过氧化氢酶预处理进行2 h。荧光图像是使用配备了数码相机的尼康外荧光显微镜（尼康，日本）获得的。

2.8.体内异种移植模型

所有动物实验均符合温州医科大学《实验动物护理和使用政策》。动物研究方案由温州医学院动物政策和福利委员会批准（批准文件：2012/APWC/0216）。动物研究协议也遵循美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南（NIH出版物第8023号，1978年修订）。从Vital River Laboratories（中国北京）获得5周龄BALB/c nu/nu雌性小鼠（18–22 g）。动物被安置在恒定的室温下，12小时：12小时的光/暗循环和feda标准啮齿动物饮食。将SGC-7901细胞皮下注射到右侧（5×106100μL PBS中的细胞）。小鼠每天服用5 mg/kgi.p.雷帕霉素1次，3 mg/kgi.p。EF24每天一次，或根据相同的时间表联合使用雷帕霉素和EF24。当肿瘤体积达到40–50 mm时开始治疗三通过测量长度（l）和宽度（w）来确定肿瘤体积，并使用公式V=0.5×l×w2计算体积。研究结束时，处死动物，取出肿瘤并称重，用于蛋白质表达研究。

2.9. 丙二醛（MDA）测定

将来自小鼠的肿瘤样品均质并进行超声处理。然后在4°C下以12000×g离心组织裂解液10 min，以收集上清液。使用Bradford试验测定总蛋白质含量。使用脂质过氧化MDA测定试剂盒（Beyotime生物技术研究所）测定丙二醛（MDA）水平。

2.10. 统计分析

所有实验均一式三份进行分析（n=3）。数据表示为平均值±SEM。免疫反应带的密度使用Image-Jcomputer软件（NIH）进行分析。所有统计分析均使用GraphPad Pro进行。Prism5.0（GraphPad，加利福尼亚州圣地亚哥）。学生的t吨-采用检验和双向方差分析来分析数据集之间的差异。p值<0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1. 大剂量雷帕霉素非选择性降低人胃癌细胞和正常细胞的生存能力

我们首先想确定雷帕霉素对胃癌和正常胃细胞生长的影响。我们用不同浓度的雷帕霉素处理细胞，并通过MTT试验进行活性测试。我们发现雷帕霉素降低了BGC-823、SGC-7901和正常GES-1细胞的IC活性50值分别为26.1、33.7和27.9μM(图1A） ●●●●。这些结果表明，雷帕霉素在高浓度下非选择性地降低胃癌细胞和正常细胞的生存能力。当使用较低浓度（对正常GES1细胞无细胞毒性）时，雷帕霉素对胃癌细胞无影响。接下来我们研究了雷帕霉素是否通过诱导细胞凋亡而降低生存能力。为此，我们在雷帕霉素治疗后用Annexin V/碘化丙啶（PI）染色细胞。如所示图1B和C两种胃癌细胞株在雷帕霉素处理24h后均出现凋亡。这种作用具有剂量依赖性，在20µM雷帕霉素下明显发生凋亡。为了证实这些结果，我们测定了SGC-7901和BGC-823细胞中凋亡相关蛋白的水平。我们的结果表明，雷帕霉素处理的细胞中Bax和裂解聚ADP核糖聚合酶（PARP）水平升高，Bcl-2水平降低(图1D和补充图S1B） ●●●●。

图1

雷帕霉素对胃癌细胞和正常细胞具有细胞毒性。(A类)通过细胞活性评估雷帕霉素对人胃癌细胞和正常GES-1细胞的细胞毒性作用。将SGC-7901、BGC-823和GES-1细胞与递增剂量的雷帕霉素（0.31-100μM）孵育24小时。MTT法测定细胞活力。(B类)雷帕霉素（10、20或40μM）处理24 h后，通过Annexin V/PI流式细胞术检测人胃癌细胞的凋亡诱导。(C类)凋亡细胞的量化以总百分比表示[*p<0.05，**p<0.01]。(D类)用雷帕霉素（10、20或40μM）处理20小时的SGC-7901和BGC-823中细胞凋亡相关蛋白的蛋白质印迹分析[Cle-PARP=裂解的PARP；GAPDH=负载对照]。密度定量条形图如补充文件所示。代表性数据来自三个独立的实验。

3.2. 姜黄素类似物EF24通过促进凋亡增加人胃癌细胞对雷帕霉素的敏感性

由于非选择性细胞毒性，我们无法维持剂量强化，从而限制了癌症治疗。因此，目前的研究工作集中在寻找联合疗法，以提高低剂量的癌细胞毒性。最近的研究表明，一种新型姜黄素类似物EF24通过多种机制使癌细胞对抗癌药物敏感[21],[22]其中一个机制是ROS的产生，这在前列腺癌和乳腺癌细胞中已经显示出来[23]因此，我们测试了EF24是否增强雷帕霉素对人胃癌细胞的作用。当浓度为0.5μM时，EF24单独使用不会影响SGC-7901和BGC-823细胞的活性（补充图S1A） ●●●●。然后，我们用浓度增加的雷帕霉素和0.5µM EF24联合治疗胃癌细胞，并检测细胞活力。我们的结果表明，EF24和雷帕霉素联合治疗可选择性增强雷帕霉素对胃癌细胞和非正常细胞（IC）的细胞毒性50=SGC-7901为2.7μM，BGC-823为8.3μM，GES-1为23.8μM；图2A和B）。这一显著发现促使我们了解了联合治疗后生存能力降低的机制。我们使用了低浓度的雷帕霉素（2.5和5.0μM），它仍然抑制mTOR信号通路(图2F和补充图S2B） 但不会产生明显的毒性，从而掩盖潜在的机制。此外，蛋白质印迹分析显示单独的EF24处理对mTOR信号通路没有影响（补充图S2C） ●●●●。我们使用Annexin V/PI染色测定了联合治疗的促凋亡作用，并显示EF24和雷帕霉素处理的细胞凋亡显著增强(图2C和D）。PARP的切割以及Bcl-2和Bax的表达水平证实了这一点(图2E和补充图S2A） ●●●●。我们接下来评估了细胞周期状态，因为胃癌细胞中的细胞活性降低可能是由诱导凋亡和细胞周期阻滞引起的。事实上，我们注意到，在雷帕霉素和EF24（补充图S3A和B）。与这些结果一致，与单独使用雷帕霉素相比，EF24和雷帕霉素处理的胃癌细胞中G2/M期相关因子小鼠双分钟2（MDM-2）、细胞周期蛋白B1和细胞分裂周期蛋白2（Cdc2）的蛋白水平降低（补充图S3C） ●●●●。此外，集落形成分析证实EF24增强了胃癌细胞对雷帕霉素的敏感性（补充图S3D） ●●●●。总之，我们的结果表明，EF24通过促进凋亡和减少细胞生长使胃癌细胞对雷帕霉素敏感。

图2

EF24增强雷帕霉素在胃癌细胞株中的抗肿瘤活性。(A至B)用0.5μM EF24预处理SGC-7901、BGC-823和GES-1细胞，然后暴露于递增剂量的雷帕霉素（0.31-100μM）中24小时。MTT法测定细胞活力。(C类)AnnexinV/PI染色评估EF24增强雷帕霉素诱导的SGC-7901和BGC-823细胞凋亡。(D类)凋亡细胞的定量[*p<0.05，**p<0.01]。(电子)EF24和雷帕霉素联合治疗后凋亡相关蛋白的Western blot分析。(F类)雷帕霉素处理的SGC-7901和BGC-823自噬相关蛋白的Western blot分析。密度定量条形图如补充文件所示。代表性数据来自三个独立的实验。

3.3、。EF24增强雷帕霉素诱导的活性氧（ROS）生成、凋亡和细胞周期阻滞

如前所述，肿瘤细胞中ROS的产生是选择性抗肿瘤治疗协同细胞毒性的基础[12],[24]此外，EF24已被证明能增加前列腺癌和乳腺癌细胞中ROS的生成[23]因此，我们探讨了ROS的产生是否在雷帕霉素和EF24的联合细胞毒性作用中发挥作用。根据二氯二氢荧光素（DCF）的水平评估，雷帕霉素单独以时间和剂量依赖性的方式增加ROS的生成(图3A、 B、和S4系列A） ●●●●。与雷帕霉素或EF24单独处理相比，雷帕霉素（2.5和5.0μM）和2µM EF24协同处理细胞导致ROS水平显著增加(图3C、 D、和S4系列B） ●●●●。当细胞按预期用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）或过氧化氢酶预处理时，未发现DCF信号（ROS水平）增加(图3C-D和S4系列C-S4D）。由于雷帕霉素是mTOR复合物1的抑制剂，因此很难确定抑制mTOR通路是否会干扰雷帕霉素诱导的ROS生成。然而，我们可以评估mTOR途径以获得洞察力。雷帕霉素在治疗后12小时抑制mTOR和下游蛋白4EBP1的磷酸化（补充图S4E） ●●●●。仅在雷帕霉素治疗1小时后，活性氧峰值明显(图3A） 可能表明mTOR通路的抑制与雷帕霉素诱导的ROS积累无关。此外，我们发现，NAC预处理（补充图S4F） ●●●●。然而，清除ROS确实逆转了SGC-7901和BGC-823细胞联合治疗诱导的细胞凋亡(图4A和B）。通过对切割的PARP、Bcl-2和Bax的蛋白质分析也可以证明这一点(图4C） ●●●●。此外，阻断活性氧可阻止联合治疗诱导的G2/M细胞周期阻滞和胃癌细胞中细胞周期相关蛋白MDM-2、细胞周期蛋白B1和Cdc2的下调（补充图S5A–S5C）。这些结果揭示了活性氧在雷帕霉素和EF24联合作用中的重要作用。结果还表明，ROS产生的机制可能独立于mTOR信号蛋白，这提出了其他靶点是否有助于雷帕霉素诱导的氧化应激的问题。

图3

EF24增强雷帕霉素诱导的活性氧生成。(A类和B类)用DCFH-DA染色法检测雷帕霉素诱导的SGC-7901细胞和BGC-823细胞ROS生成(A类)用10μM雷帕霉素处理SGC-7901和BGC-823细胞不同时间段。(B类)用不同浓度的雷帕霉素处理细胞1h。(C类和D类)EF24增强SGC-7901中雷帕霉素诱导的活性氧生成(C类)和BGC-823(D类)单元格。用EF24、雷帕霉素或两者的组合处理细胞1小时。用5 mM NAC预处理2 h可抑制细胞内ROS生成。右条形图显示流式细胞术数据的量化[*p<0.05，**p<0.01]。数据来自三个独立的实验。

图4

雷帕霉素和EF24的协同作用依赖于活性氧的产生。(A类)NAC或过氧化氢酶预处理使雷帕霉素和EF24在SGC-7901和BGC-823细胞中的协同作用正常化。在雷帕霉素和EF24联合处理24小时之前，用5 mM NAC或2000 U/mL过氧化氢酶预处理细胞2小时。AnnexinV/PI染色检测凋亡细胞。(B类)Annexin V/PI流式细胞术数据的量化[*p<0.05，**p<0.01]。(C类)暴露于雷帕霉素和EF24之前，NAC或过氧化氢酶处理细胞中凋亡相关蛋白的Western blot分析。从三个独立的实验中收集数据，并显示了具有代表性的图像。

3.4. EF24和雷帕霉素联合激活内质网应激和线粒体功能障碍

据报道，活性氧水平的增加和细胞内氧化还原状态的扰动会增加未折叠蛋白的水平并诱导内质网（ER）应激反应[25]因此，我们检测了ER应激相关蛋白的表达，包括CHOP（CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白）、ATF4（激活转录因子4）、eIF2α（真核启动因子）和PERK（蛋白激酶RNA-like内质网激酶）。这里，我们表明，仅用雷帕霉素或EF24处理细胞会轻微诱导内质网应激标记物，而雷帕霉素和EF24联合处理会显著激活内质网-应激途径，如诱导的p-eIF2α、ATF4、p-PERK和CHOP水平所示(图5A和补充图S6A） ●●●●。在该系统中，NAC和过氧化氢酶预处理都完全阻断了联合处理诱导的效应(图5B和补充图S6B） ●●●●。接下来，我们通过电子显微镜检查了联合处理后SGC-7901细胞的内质网形态。与对照组（DMSO处理）SGC-7901细胞相比，雷帕霉素和EF24处理6小时后SGC-7902细胞的ER出现肿胀（箭头所示，图5C） ●●●●。NAC预处理未观察到这种形态变化。这些结果表明，治疗诱导的活性氧在胃癌细胞中介导内质网应激反应。

图5

EF24通过调节ROS水平增强雷帕霉素诱导的内质网应激反应.(A类)雷帕霉素和EF24[p-eIF2α=磷酸化真核启动因子2α；ATF4=激活转录因子-4；p-PERK=磷酸化蛋白激酶RNA-like内质网激酶；CHOP=CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白]。(B类)通过蛋白质印迹分析评估，NAC和过氧化氢酶逆转了联合处理诱导的细胞中的ER应激反应。(C类)雷帕霉素和EF24联合处理对SGC-7901细胞内质网形态的影响。SGC-7901细胞在暴露于5µM雷帕霉素和2µM EF24联合作用6 h之前，预处理5 mM NAC 2 h[×10000或×20000]。密度计定量柱状图如补充文件所示。从三个独立的实验中收集数据，并显示了具有代表性的图像。

除了内质网应激外，线粒体功能障碍也是细胞凋亡调控的核心。线粒体膜电位（Δψm）的丧失对细胞来说是灾难性的，并导致细胞色素C释放到胞浆中[26]。我们使用荧光显微镜来确认联合治疗诱导的凋亡是否与JC-1染料破坏线粒体稳态有关。JC-1是一种阳离子碳菁染料，在健康线粒体中积累，并在线粒体膜完整性受损时泄漏。我们的结果表明，雷帕霉素和EF24联合治疗降低了SGC-7901和BGC-823细胞的线粒体膜电位(图6A） ●●●●。这种线粒体缺陷也与活性氧直接相关，因为NAC预处理细胞可防止膜电位降低。此外，电子显微镜显示NAC减轻了联合治疗引起的线粒体功能障碍，包括肿胀和球体形成(图6B） ●●●●。

图6

雷帕霉素和EF24联合通过ROS/JNK信号通路诱导线粒体功能障碍。(A类)联合使用5µM雷帕霉素和2µM EF24处理细胞后，线粒体膜电位（ΔψM）降低。细胞处理12h，然后用JC-1染色。用NAC或过氧化氢酶预处理细胞时，线粒体功能不明显[JC-1在线粒体中的积累呈红色，未积累的JC-1作为单体呈绿色；标尺=20μm]。(B类)雷帕霉素和EF24联合治疗后NAC对SGC-7901线粒体形态的影响。(C类)EF24增强了雷帕霉素诱导的p-JNK水平。NAC或过氧化氢酶预处理逆转了雷帕霉素和EF24在SGC-7901和BGC-823细胞中12小时联合作用的效果。密度定量条形图如补充文件所示。从三个独立的实验中收集数据，并显示了具有代表性的图像。

接下来，我们想确定我们观察到的细胞和分子变化的潜在信号机制。线粒体依赖性细胞凋亡与c-Jun N末端激酶（JNK）改变Bcl-2蛋白有关[14],[27]我们的研究表明，雷帕霉素和EF24联合治疗可诱导活性氧依赖的Bcl-2抑制和Bax诱导。因此，联合治疗有可能通过JNK活化诱导细胞凋亡。事实上，与单一雷帕霉素或EF24处理相比，雷帕霉素和EF24处理细胞增加了JNK的磷酸化，而清除活性氧则完全抑制了联合处理诱导的JNK磷酸化(图6C和补充图S7A） ●●●●。总之，这些结果表明，联合治疗可诱导胃癌细胞中ROS依赖性JNK活化和线粒体功能障碍。

3.5. EF24增强雷帕霉素的疗效体内

为了证实我们有希望的联合治疗结果，我们评估了雷帕霉素和EF24的协同作用体内通过在免疫缺陷裸鼠中进行人类胃癌异种移植。正如预期的那样，经雷帕霉素、EF24或两者联合治疗后，对SGC-7901肿瘤小鼠的治疗显示出抑制生长(图7). 如肿瘤重量所示，雷帕霉素和EF24联合治疗的小鼠对肿瘤生长的抑制作用最大(图7A） 和肿瘤体积(图7B–7C）。未发现任何治疗对体重的影响(图7D） ●●●●。心脏、肾脏和肝脏组织的组织病理学分析也表明，雷帕霉素与EF24联合使用不会导致显著毒性(图S8). 最后，我们决定是否体内雷帕霉素和EF24对胃癌生长的抑制也涉及ROS的产生和细胞凋亡。肿瘤组织裂解物进行western blot分析以检测caspase-3和PARP激活。我们的结果显示，雷帕霉素和EF24联合治疗的小鼠中p-eIF2α、裂解caspase 3和PARP水平显著升高(图7E和G）。我们还发现，联合治疗增加了肿瘤组织中脂质过氧化产物（MDA）的水平(图7F） 表明ROS产量增加。虽然脂质过氧化产物（MDA）的测定对ROS水平没有特异性，但可以作为氧化应激的指标[28]缺乏对活性氧水平的特定生物标记物的检测可能是本研究的局限性。此外，细胞增殖标记物Ki-67的免疫组织化学染色显示，雷帕霉素和EF24联合治疗的肿瘤中Ki-67阳性细胞显著减少(图7G） ●●●●。综上所述，这些结果都表明EF24可以协同雷帕霉素的治疗作用体内通过提高ROS水平和诱导细胞凋亡。

图7

EF24增强雷帕霉素在人胃癌异种移植物中的抗肿瘤活性。裸鼠体内注射SGC-7901细胞。然后用雷帕霉素、EF24或两者的组合治疗小鼠。肿瘤重量图示(A类)和肿瘤体积(B类和C类)[*p<0.05，**p<0.01]。(D类)所有治疗组的体重均无差异。(电子)肿瘤标本中凋亡相关蛋白的Western blot分析显示p-eIF2α水平，PARP和caspase3裂解水平（每组随机分析2只小鼠）。(F类)肿瘤组织中氧化应激标记物MDA的水平溶解[*p<0.05，**p<0.01]。(G公司)肿瘤切片用细胞增殖标记物Ki-67和凋亡标记物裂解caspase3染色[比例尺=50μm]。从每组5只小鼠中收集数据，并显示代表性图像。

4.讨论

尽管检测和管理有所改进，但胃癌仍是癌症死亡的主要原因之一。由于mTOR途径中蛋白质的失调已在许多类型的癌症中被报道，mTOR是一个有吸引力的治疗靶点。包括雷帕霉素及其类似物去氟莫司、依维莫司和替米罗莫司在内的mTOR抑制剂正在进行治疗多种癌症的临床试验[29]有些已经被批准用于转移性肾细胞癌[30],[31]然而，单用mTOR抑制剂治疗晚期胃癌仅产生适度的治疗活性[32]耐药性的出现进一步阻碍了雷帕霉素及其类似物的临床应用[33]本研究和其他研究的结果表明，胃癌细胞对低剂量雷帕霉素具有耐药性，而高剂量雷帕霉素对癌细胞和正常细胞都具有细胞毒作用。因此，联合癌症治疗可能提供更具协同作用的抗癌效果和更少的系统毒性[34]在本研究中，我们研究了新姜黄素类似物EF24与雷帕霉素联合治疗人类胃癌的效果。我们的研究结果表明，EF24使胃癌细胞对雷帕霉素诱导的选择性生长抑制和凋亡诱导敏感。此外，我们的研究表明，EF24通过ROS介导的ER应激激活和胃癌细胞线粒体功能障碍介导这些效应。

活性氧在肿瘤发生中起着关键作用。与正常细胞相比，癌细胞表现出较高的活性氧水平和较高的抗氧化活性[35].活性氧水平升高也会使癌细胞对进一步增加活性氧和氧化应激的药物更加敏感[17]最近的研究还表明，联合治疗的协同活性氧依赖性细胞毒性是肿瘤细胞特异性的[12]我们之前的研究表明，EF24抑制硫氧还蛋白还原酶活性并诱导ROS介导的胃癌细胞凋亡[13]因此，我们假设EF24可能是一个有趣的组合治疗靶点。我们发现雷帕霉素还以剂量和时间依赖性的方式诱导细胞内活性氧的积累。此外，EF24作为ROS诱导剂，增强雷帕霉素在胃癌细胞中的抗肿瘤活性。为了确定活性氧在雷帕霉素和EF24联合治疗中的重要性，我们使用了两种活性氧清除剂。我们的研究结果表明，NAC和过氧化氢酶完全减弱了雷帕霉素和EF24在胃癌细胞中的协同抗肿瘤作用。此外，我们发现ROS生成与mTOR信号通路无关，因为ROS清除剂无法使雷帕霉素对mTOR的抑制正常化。此外，雷帕霉素产生活性氧的时间与mTOR通路的抑制并不一致。需要进一步研究以确定活性氧的生成机制以及雷帕霉素的直接氧化还原相关靶点。

为了应对氧化应激，未折叠或错误折叠的蛋白质的积累触发了一种称为内质网应激的细胞适应性过程[36]正常情况下，内质网应激被设计为具有保护作用，因为它会关闭蛋白质合成并增加分子伴侣的产生[37]然而，持续的内质网应激导致CHOP介导的细胞凋亡[38]我们的研究结果表明，雷帕霉素和EF24联合治疗可诱导内质网应激蛋白p-PERK、p-eIF2α和ATF4。我们还注意到ER应激特异性凋亡级联蛋白CHOP在胃癌细胞中的诱导作用。重要的是，通过雷帕霉素和EF24联合处理，NAC和过氧化氢酶清除ROS可消除ER应激激活途径。这表明雷帕霉素和EF24治疗的抗癌作用至少部分由ROS依赖性ER应激凋亡途径介导。

过多的ROS生成可导致线粒体功能障碍，降低线粒体膜电位，并释放细胞色素C[39]激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶随后诱导PARP的蛋白水解裂解，最终导致细胞凋亡。我们的研究表明，雷帕霉素和EF24联合使用可显著降低SGC-7901细胞线粒体膜电位（Δψm）。此外，我们发现，通过NAC和过氧化氢酶阻止ROS积累可以逆转雷帕霉素/EF24治疗诱导的线粒体功能障碍，表明ROS生成可能是线粒体缺陷的上游调节器。总之，我们的结果强调了联合治疗诱导的氧化应激与内质网应激和线粒体功能障碍有关，这可以增强雷帕霉素和EF24在胃癌细胞中的协同抗癌作用。

总之，我们报道了EF24协同增强雷帕霉素的抗癌作用，突出了胃癌的新治疗途径。我们发现EF24主要增强了雷帕霉素在胃癌细胞中的抗癌活性通过ROS依赖性内质网应激与线粒体功能障碍和凋亡诱导。此外，我们验证了雷帕霉素/EF24组合对肿瘤生长的协同抑制作用体内使用异种移植瘤模型。综上所述，我们提出证据表明，雷帕霉素与EF24联合应用可作为治疗人类胃癌的潜在联合疗法。

利益冲突披露声明

作者透露没有潜在的利益冲突。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金（81622043、81503107、81672305和81573657）、浙江省自然科学基金资助项目（LY13H160022和LY16H310011）和温州科技项目（2014Y0344）的支持。

脚注

附录A与本文相关的补充数据可以在在线版本中找到，网址为doi:10.1016/j.redox.2016.09.006.

附录A补充材料

补充材料

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文章来自氧化还原生物学由以下人员提供爱思维尔