氧化还原生物。2016年12月；10: 65–77.
血细胞呼吸测定与骨骼肌和心肌生物能量学相关：线粒体健康微创生物标志物的意义
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丹尼尔·泰瑞尔
一美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆维克森林医学院老年医学和老年医学科Sticht衰老中心和内科
曼尼什·S·巴拉德瓦吉
一Sticht老龄化中心和内科，老年病学和老年医学科，威克森林医学院，美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆，27157
马修·乔根森
b条美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆维克森林医学院比较医学科病理学系，邮编：27157
托马斯·C·注册
b条美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆维克森林医学院比较医学科病理学系，邮编：27157
安东尼·莫利纳
一美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆维克森林医学院老年医学和老年医学科Sticht衰老中心和内科
一美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆维克森林医学院老年医学和老年医学科Sticht衰老中心和内科
b条美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆维克森林医学院比较医学科病理学系，邮编：27157
2016年9月16日收到；2016年9月20日接受。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
摘要
基于血液的生物能量分析策略正在成为系统线粒体功能的潜在报告者；然而，这些测量在多大程度上反映了其他组织的生物能量能力尚不清楚。这项工作的前提是，高代谢活性组织，如骨骼肌和心肌，容易受到系统生物能量能力差异的影响。因此，我们测试了血细胞、单核细胞和血小板的呼吸能力是否与骨骼肌和心肌线粒体的同期呼吸测量评估有关(沙氏氯杆菌)本研究检测了不同年龄和代谢状态的患者。单核细胞和血小板的最大容量与透化骨骼肌的最大氧化磷酸化能力相关（R=0.75，95%置信区间[CI]:0.38–0.97；R=0.51，95%CI:0.05–0.81；分别），分离的骨骼肌线粒体呼吸控制比（RCR；R=0.70，95%CI:0.35–0.89；R=0.64，95%置信区间：0.23–0.98；和分离的心肌线粒体RCR（分别为R=0.55，95%CI:0.22-0.86；R=0.58，95%CI：0.22-0.85）。这些结果表明，基于血液的生物能量分析可用于报告肌肉组织的生物能量能力。在人体研究中，血细胞呼吸测定法是一种很有吸引力的替代方法，可以替代基于组织的线粒体功能评估，因为该方法易于获取，且参与者负担最小。
缩写：ACD，酸性柠檬酸盐葡萄糖；BMI，体重指数；牛血清白蛋白；CP、Chappell-Perry缓冲液；CII，复合物2；EGTA，三甘醇二胺四乙酸；酶联免疫吸附试验；电子传输链；FCCP，羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙；HOMA-IR，胰岛素抵抗的稳态模型评估；MAS、甘露醇和蔗糖缓冲液；最大FCCP连接生物能量容量；MES，2-（N-吗啉）乙磺酸；O2k，Oroboros氧气监测仪2K；氧化磷酸化；PBS，磷酸盐缓冲液；前列腺素E1，前列腺素E1; PmFBs，渗透性纤维束；RCR，呼吸控制率；SD，标准偏差；XF，细胞外流量
关键词：线粒体、生物能量学、血细胞、肌肉、细胞呼吸
集锦
•
非人类灵长类循环细胞和肌肉组织的呼吸测定。
•
血细胞概括了骨骼肌纤维生物能量学的关键方面。
•
血细胞重新合成骨骼肌和心肌线粒体生物能量学。
1.简介
线粒体功能障碍在多种疾病中起着关键作用，尤其是与衰老相关的疾病。因此，线粒体功能评估长期以来被认为具有重要的诊断和预后应用价值。越来越多的证据表明血细胞可以报告系统线粒体功能。糖尿病、动脉粥样硬化和神经退行性变都与多种细胞类型（包括白细胞和血小板）中各种线粒体参数的恶化有关[1],[2],[3],[4]外周血单个核细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板中线粒体DNA（mtDNA）、线粒体酶活性和电子传递链（ETC）活性的变化与死亡率、糖尿病、艾滋病毒、心血管疾病、帕金森病、阿尔茨海默病、癌症、炎症、，认知、亨廷顿病、脓毒症和纤维肌痛[1],[5],[6],[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18]最近，利用细胞呼吸测定法的基于血液的生物能量分析策略与衰老的关键特征有关，如步速、身体功能下降、炎症和抑郁[19],[20],[21].
基于血液的线粒体功能测量可以提供一种特别适合诊断用途的微创检测。此外，这些测量方法非常适合用于大规模临床试验，包括具有连续纵向评估的临床试验，因为与基于活检的线粒体功能测量方法相比，这些方法需要最小的患者负担和成本。基于血液的生物能量分析策略也非常适合用于经常有多种活检禁忌症的老年人。然而，关于这些基于血液的测量是否能够重述在其他组织中进行的线粒体功能测量，我们知之甚少。
在这项研究中，我们研究了单核细胞和血小板线粒体呼吸与肌肉组织线粒体功能评估之间的关系。我们将重点放在骨骼肌和心肌上，因为与年龄相关的生物能量下降被认为在代谢活跃的组织中最为显著，并且基于我们之前的研究结果，基于血液的呼吸测定与人体身体功能和力量的测量正相关[20]例如，据报道，与年轻人相比，老年人的骨骼肌ATP产量、最大生物能量和线粒体含量降低[22]此外，在人类心力衰竭的早期阶段，心脏组织氧化能力和磷酸肌酸/ATP比率降低[23]糖尿病和肥胖症进一步损害[24],[25]这些与啮齿类动物模型的发现类似[26],[27]非人类灵长类动物模型的使用为我们提供了可靠的心脏和骨骼肌组织，以及足够的血液量，以允许分析多种血细胞群。Vervet猕猴容易受到身体成分自然变化的影响[28]，物理功能[29]以及肥胖等慢性病[30]、糖尿病[31]和心脏病[32]因为它们的衰老方式与人类相似[33]本研究使用了一组专门挑选的雌性灵猫，以代表年轻和老年人群的广泛代谢健康状态、胰岛素抵抗以及体重指数（从瘦到胖）。该设计用于最大化动物之间潜在的生物能量差异。
血细胞呼吸与骨骼肌线粒体功能通过两种方式进行比较。外侧血管肌肉纤维渗透并通过高分辨率呼吸测定法进行分析[34]以保持线粒体含量和结构潜在差异的方式检查生物能量能力[35]此外，我们检查了隔离状态下的呼吸控制股外侧肌线粒体[36]确定基于血液的测量是否与内在电子传递链功能的差异有关。使用分离的细胞器进行类似的方法来分析心肌线粒体功能。我们假设，由于血细胞持续暴露于循环因子，如炎症细胞因子、氧化还原应激[37]和最近描述的有丝分裂因子[38]; 已知影响跨组织线粒体功能；单核细胞和血小板的呼吸计量分析将重述系统生物能量容量的差异。
2.材料和方法
2.1. 动物参与者
这项研究包括18只雌性灵猫/非洲绿猴(沙氏氯杆菌)年龄从8.2岁到23.4岁不等。这些猴子最初生活在11至49岁的稳定社会群体中，居住在大约28米的室内外住房单元中2室内和111米2户外有栖木、平台、高架攀爬结构和光滑石头构成的底座。在开始研究之前，18只动物中的7只被转移到了室内住所（成对或单独安置）。所有动物都被喂食标准的猴粮（LabDiet 1538），每周补充5次水果和蔬菜。水是随意提供的。在尸检以及骨骼和心肌组织采集之前，立即从麻醉动物身上获取血样。根据美国兽医协会安乐死小组制定的指南，先用IM氯胺酮（10–15 mg/kg）进行安乐死，然后静脉注射戊巴比妥钠（60–100 mg/kg），以实现深层手术麻醉和放血。所有程序都是根据州和联邦法律、美国卫生与公众服务部以及威克森林医学院动物护理和使用委员会的指导方针批准和执行的。
2.2. 身体质量测量
BMI估计为使用电子卡尺从胸骨上切迹到耻骨联合测量的体重与躯干长度平方的比值（单位：kg/m2)并在尸检前4个月计算，同时在尸检时测量体重[39].
2.3. 胰岛素、葡萄糖和胰岛素敏感性测量
使用来自Alfa Wasserman Diagnostic Technologies（新泽西州西考德威尔）的试剂和仪器（ACE ALERA自动分析仪）测定空腹血糖。胰岛素通过酶联免疫吸附测定法（ELISA；瑞典乌普萨拉，默科迪亚）测定。所有分析均在尸检前4个月在威克森林比较医学临床化学和内分泌实验室进行。胰岛素抵抗稳态模型（HOMA-IR）=（[mg/dL空腹血糖X mIU/L空腹胰岛素]/405）被用作胰岛素抵抗的估计[40].
2.4. 血细胞的分离
将禁食猴子的血液（8 mL）收集到酸性柠檬酸-葡萄糖（ACD）管中（Vacutainer；Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ），并立即进行处理以获得血小板和CD14+单核细胞制剂。血小板和CD14+单核细胞的分离方法与Chacko等人描述的方法类似。[41]简单地说，ACD试管中的全血在500×克室温下制动15分钟。去除富含血小板的血浆，并在1500×离心下分离血小板克用含前列腺素E的磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗10分钟1（PGE1；开曼化学公司，密歇根州安娜堡），并重悬于含有1mM Na的细胞外通量（XF）测定缓冲液（Seahorse Biosciences，North Billerica，MA）中+-丙酮酸，1 mM谷氨酸MAX（纽约州格兰德岛Gibco），11 mMD类-葡萄糖和PGE1（pH 7.4）用于呼吸测定实验。提取浅黄色涂层，在RPMI 1640（Gibco）中稀释4倍，并在15 mL离心管中以1.077 g/mL（Sigma Histopaque®-1077，St.Louis，MO）的密度将其分层到3 mL多糖溶液中，并在700×克30分钟，无制动器。获得浅黄色涂层，在PBS中清洗，并分为2管。根据制造商说明，使用CD14标记的磁性微球（Miltenyi Biotec，San Diego，CA），使用改良的RPMI 1640+无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）培养基，从1个试管中分离出CD14+单核细胞。单核细胞在改良RPMI 1640培养基中洗涤，并在不含PGE1的XF分析缓冲液中重新悬浮，以进行呼吸测定实验。
2.5. 血细胞呼吸测定
每个孔共有250000个单核细胞和25000000个血小板在Seahorse微孔板中进行四次电镀。以前已经描述过使用选定抑制剂和解偶联剂的生物能量分析[42]简单地说，当细胞在XF分析缓冲液中呼吸时，监测基础耗氧率（OCR）测量值，然后依次添加寡霉素（750 nM）、羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯肼（FCCP；1μM）和抗霉素-A+鱼藤酮（A/R；两者均为1μM，均来自Sigma）每次添加后进行测量。在添加FCCP（一种有效的线粒体解偶联剂）后计算最大OCR。FCCP作为一种化学解偶联剂的使用使我们能够估计ETC的最大活性和呼吸可用底物的供应。储备容量计算为MAX和基础OCR之间的差值[43],[44]添加寡霉素（oligo）和添加A/R后测量值之间的差异被报告为泄漏呼吸，基础和寡霉素间的差异是归因于ATP的OCR[45]。血小板呼吸被归一化为mg蛋白，通过Pierce BCA分析测定（纽约州格兰德岛ThermoFisher Scientific）。
2.6. 渗透性骨骼肌纤维束的制备
安乐死后立即获得约1g骨骼肌组织。将每个肌肉样品的一部分立即放入冰镇缓冲液X（50 mM K-MES，7.23 mM K2EGTA，2.77 mM蛋糕2EGTA、20mM咪唑、20mM牛磺酸、5.7 mM ATP、14.3 mM磷酸肌酸和6.56 mM氯化镁2·6小时2O、 pH 7.1）用于制备渗透性肌纤维束（PmFBs），如前所述[46]。在放大镜下，使用针尖镊子沿纵轴分离约2-4 mg纤维束，用皂苷（30μg mL）透化−1)在4°C下保持30分钟，然后在冰镇缓冲液Z中清洗（105 mM K-MES，30 mM KCl，1 mM EGTA，10 mM K2高性能操作4，5 mM氯化镁2·6小时2O、 0.5毫克毫升−1BSA，pH 7.4），分析前约15分钟。在每个实验结束时，将PmFBs在双蒸馏H中洗涤2O去除盐，在真空下干燥，并称重。典型的纤维束尺寸为0.2–0.6 mg干重。
2.7. 透性骨骼肌纤维束的呼吸测定
高分辨率O2在含有20 mM肌酸和25μM布利司他丁的2 mL缓冲液Z中进行消耗量测量，以抑制收缩[46]使用OROBOROS Oxygraph-2k（O2k；OROBOROS Instruments，奥地利因斯布鲁克）[34].极谱O2以2s的间隔进行测量，从至少40个数据点计算出稳态呼吸速率，并用pmols表示−1每毫克干重。所有呼吸测量均在37°C和工作范围[O2]约350–180μM。呼吸测量一式两份，如下所示：2 mM苹果酸（泄漏）、5 mM ADP、5 mM丙酮酸、10 mM谷氨酸（复合I OXPHOS底物），然后依次添加10 mM琥珀酸（复合II OXPHOS底物）、1μM细胞色素c以测试线粒体膜完整性，以及1 mM FCCP（MAX）的顺序滴定，和2.5μM抗霉素A+0.5μM鱼藤酮（非线粒体呼吸）。
2.8. 骨骼肌和心肌线粒体的分离
如前所述分离线粒体[36],[47]来自骨骼肌和心肌。对于每只动物，将约50 mg的组织切成小块，再悬浮在含有约1 mg/mL Nagarse的Chappell-Perry缓冲液I（CP I）中。在室温下与Nagarse培养5分钟后，使用配备5 mm Pro快速连接发生器探针的Bio-Gen系列PRO200型均质器（Pro-Science，Inc.，Oxford，CT）进行均质。用等体积的CP I和2倍体积的CP II缓冲液清洗均质组织，方法是在4°C下600×G离心10分钟（Eppendorf离心机5804R，Eppendor AG，德国汉堡）。所得上清液通过奶酪布过滤，滤液以10000×克使用Beckman离心机J2-21M型感应驱动离心机（Beckman-Coulter，Inc.，Brea，CA）在4°C下保持10分钟，以获得线粒体颗粒。首先用CP II进一步清洗颗粒，然后用CP I缓冲液进行清洗。最后，将颗粒悬浮在线粒体测定溶液中（甘露醇和蔗糖缓冲液：MAS；蔗糖35 mM，甘露醇110 mM，KH2人事军官42.5 mM，氯化镁22.5 mM、HEPES 1.0 mM、EGTA 0.5 mM、无脂肪酸BSA 0.10%、pH 7.4）。根据制造商的说明，通过Pierce BCA分析（纽约州格兰德岛赛默飞世尔科学公司）测定纯化的线粒体蛋白。每50 mg样品获得约500μg纯化线粒体的典型产量。
2.9. 分离线粒体的呼吸测定
使用XF24–3细胞外通量分析仪（马萨诸塞州北比勒里卡Seahorse Bioscience）对分离的线粒体进行呼吸测定。罗杰斯等人（Rogers et al。[48]并按照之前的描述使用[36]在研究方案优化期间，比较了使用丙酮酸/苹果酸的络合物1驱动的呼吸和使用琥珀酸/鱼藤酮的络合物2驱动的呼吸。复合物2驱动的呼吸持续较高，与之前的报告类似[48]为了确保足够的样本量和标准化，使用琥珀酸盐和鱼藤酮进行分离线粒体呼吸测定分析。化合物在1X MAS中以10倍于分析所需最终浓度制备。化合物的最终浓度如下：ADP、2μM寡霉素、6μM FCCP和2μM抗霉素A。向每个孔中加入5μg线粒体悬浮液，在2000×克在4°C下保持20分钟，以确保连接。离心后，将450 mL含有琥珀酸盐（10 mM）和鱼藤酮（2μM）的1X MAS轻轻添加到每个孔中，并开始实验。在37°C下进行呼吸测定。主要结果是：由ADP启动的最大状态3呼吸（MAX-A）、由添加寡霉素抑制ATP合成酶诱导的最大FCCP连接呼吸（MAX）和状态4o。呼吸控制比（RCR）计算为MAX-A/State4o（RCR-A）和MAX/State 4o（RCR-F）。
2.10. 统计分析
在进一步分析之前，检查了所有变量的分布。所有变量均符合Shapiro-Wilk检验评估的正态性假设。使用皮尔逊相关系数（R）评估所有变量之间的关联性，并进一步对年龄、体重和HOMA-IR进行单独控制。分析的每个血细胞类型的关联性列表，一些最常见的公布变量之间的回归图在每个相关表后描述。我们选择的回归图显示的是来自渗透骨骼肌纤维的具有复合物I和复合物I+II OXPHOS的每种血细胞类型的最大呼吸，以及来自骨骼肌和心脏组织分离线粒体的FCCP连接的最大呼吸和RCR-F。进行分析（SPSS v22；Armonk，NY）。通过自举生成相关系数的95%置信区间（95%CI）。
3.结果
3.1. 非人灵长类参与者的人口统计和生物能量参数
年龄、体重、BMI、胰岛素、血糖和胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）总结于共研究了18只纯雌性长尾猴，平均年龄为16.4岁。年龄范围为8.4至23.7岁。这些动物的平均体重为4.9公斤。血糖和胰岛素水平平均为127.7 mg/dL和23.7 mIU/L；分别为98.0 mg/dL和13.5 mIU/L；分别表示变化范围很广。HOMA-IR的平均值为6.9，中位数为4.0，表明一些动物存在胰岛素抵抗，而其他动物存在胰岛素敏感性[30]一只动物各组织的代表性生物能量曲线如所示中总结了每种动物的基线生物能量参数.
一只动物CD14+单核细胞、血小板、骨骼肌分离线粒体、心脏分离线粒体和渗透性骨骼肌纤维的代表性生物能量特征。呼吸被测量为耗氧率（pmol/min/250000细胞[单核细胞]、pmol/min/mg蛋白[血小板]、pmol/min/5µg线粒体蛋白[左股和心脏组织]）和pmol/min/mg干重[渗透性纤维]。在分离的线粒体制剂中，使用琥珀酸盐和鱼藤酮作为底物测量复合物II（CII）呼吸。Ama=抗霉素A，c=细胞色素c，D=二磷酸腺苷，F=羰基-氰基-p-三氟甲基苯腙，G=谷氨酸，M=苹果酸，O=寡霉素，p=丙酮酸，R=鱼藤酮，S=琥珀酸，U=解偶联剂（FCCP）。
表1
| 平均值 | 标准偏差 | 范围 | N个 |
|---|
| 年龄（岁） | 16.6 | 6.1 | 8.4–23.7 | 18 |
| 重量（kg） | 4.9 | 1 | 3.3–6.9 | 18 |
| 体重指数（kg/m2) | 60.7 | 10.5 | 44.6–82.3 | 18 |
| 葡萄糖（mg/dL） | 127.7 | 70.6 | 73.0–319.0 | 18 |
| 胰岛素（mIU/L） | 23.7 | 26.7 | 4.6–114.6 | 18 |
| HOMA-IR公司 | 6.9 | 7.1 | 1.0–27.2 | 18 |
表2
| 平均值 | 标准偏差 | 范围 | N个 |
|---|
| 血小板基底 | 299 | 98.8 | 162.2–435.6 | 17 |
| 血小板寡霉素OCR | 98.3 | 26.4 | 54.4–140.4 | 15 |
| 血小板最大值 | 438.1 | 159.8 | 209.3–699.5 | 17 |
| 血小板非线粒体OCR | 84.4 | 23.3 | 36.1–124.4 | 17 |
| 血小板储备能力 | 139.1 | 78.5 | 27.4–263.9 | 17 |
| 血小板ATP OCR | 198.4 | 77.9 | 76.8–304.0 | 15 |
| 血小板泄漏OCR | 12.2 | 13.5 | −7.2至39.1 | 15 |
| 单核细胞基底 | 79.6 | 37.3 | 39.3–158.8 | 11 |
| 单核细胞寡霉素OCR | 25.2 | 9.4 | 13.7–37.3 | 9 |
| 单核细胞最大值 | 116.2 | 54.9 | 50.6–225.3 | 11 |
| 单核细胞非线粒体OCR | 19 | 12.7 | −8.8至37.9 | 11 |
| 单核细胞储备能力 | 36.6 | 19.6 | 10.7–66.4 | 11 |
| 单核细胞ATP OCR | 48.8 | 24.8 | 19.6–86.5 | 9 |
| 单核细胞泄漏OCR | 4.7 | 10.6 | -20.6至13.9 | 9 |
| 渗透纤维基底 | 34.8 | 9.2 | 23.4–57.8 | 17 |
| 渗透性光纤泄漏OCR | 33.6 | 12.2 | 21.0–67.1 | 17 |
| 可渗透纤维复合物I OXPHOS | 93.9 | 22.7 | 60.1–145.7 | 17 |
| 渗透性纤维复合物I+II OXPHOS | 133.3 | 34.4 | 68.0–197.6 | 17 |
| 渗透性纤维细胞色素C膜完整性 | 132.7 | 35.8 | 63.5–200.3 | 17 |
| 渗透纤维MAX | 157.4 | 33.4 | 116.8–215.7 | 17 |
| 渗透性纤维非线粒体OCR | 12 | 3.8 | 5.1–20.1 | 17 |
| 左股动脉分离线粒体CII寡霉素OCR | 117.4 | 50.8 | 43.0–240.5 | 16 |
| 左股动脉分离线粒体CII状态3 | 581.4 | 247.9 | 162.1–1082.1 | 16 |
| 左股动脉分离线粒体CII MAX | 601.2 | 292.1 | 156.6–1062.0 | 16 |
| 左股动脉分离线粒体CII RCR-A | 5.1 | 1.4 | 2.6–8.4 | 16 |
| 左股动脉分离线粒体CII RCR-F | 5.1 | 1.5 | 2.5–7.5 | 16 |
| 心脏分离线粒体CII寡霉素OCR | 162.6 | 68.2 | 47.2–268.5 | 16 |
| 心脏分离线粒体CII状态3 | 633.4 | 213.9 | 171.9–928.4 | 16 |
| 心脏分离线粒体CII MAX | 669.1 | 225.7 | 265.6–1052.5 | 16 |
| 心脏分离线粒体CII RCR-A | 4.1 | 1 | 2.8–6.8 | 16 |
| 心脏分离线粒体CII RCR-F | 4.4 | 1.1 | 2.8–7.2 | 16 |
3.2. 单核细胞血细胞生物能量学与骨骼肌和心肌线粒体分离物及渗透性骨骼肌纤维的相关性
Pearson相关系数用于比较所有血细胞生物能量学参数与骨骼肌和心肌生物能量学。主要单核细胞生物能量参数与骨骼肌和心肌生物能量学之间的关系总结如下描述这些关系的回归图可以在CD14+单核细胞的最大FCCP相关生物能量容量（MAX）与通过复合物I和II底物驱动的骨骼肌最大氧化磷酸化能力（OXPHOS）显著正相关（R=0.75，CI:0.38–0.97；A） 以及仅用于复合物I的底物（R=0.73，CI:0.33–0.91；B） ●●●●。此外，单核细胞的基础呼吸和储备能力与渗透骨骼肌纤维中的复合物I+II和复合物I OXPHOS显著相关。单核细胞MAX也与骨骼肌分离的线粒体FCCP相关的呼吸控制比率显著正相关（RCR-F；R=0.70，CI:0.35-0.89；D） 但未从骨骼肌或心肌中分离出线粒体MAX(C和E）。同样，单核细胞MAX与ADP-相关呼吸控制率之间也存在较强的正相关关系（RCR-a；R=0.83，CI:0.49-0.97）。单核细胞MAX与心肌分离线粒体的RCR-A也呈强正相关（R=0.55，CI:0.22-0.86）。
CD14+单核细胞生物能量参数与骨骼肌和心肌生物能量学的相关性.单核细胞最大非偶联呼吸和储备能力与呼吸控制比的回归，来自骨骼肌和心肌的分离线粒体的最大非偶联呼吸，以及来自透化骨骼肌纤维的最大氧化磷酸化能力和最大非偶联呼吸。显示了每个关联的皮尔逊相关性和p值。
表3
单核细胞生物能量学与骨骼肌和心肌生物能量学的关系。单核细胞呼吸参数与渗透骨骼肌纤维和分离线粒体生物能量学的皮尔逊相关性和95%置信区间股外侧肌和心脏组织。
| 基本（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%CI） |
|---|
| 可渗透纤维： |
| 基础 | -0.43（-0.74至0.03） | -0.42（-0.74至0.03） | -0.33（-0.65至0.17） |
| 综合设施I OXPHOS | 0.74 (0.42–0.91) | 0.73 (0.33–0.91) | 0.60 (0.03–0.91) |
| 复合物I+II OXPHOS | 0.79 (0.49–0.96) | 0.75 (0.38–0.97) | 0.57 (0.06–0.92) |
| 马克斯 | 0.09（-0.51至0.73） | −0.01（−0.59至0.70） | -0.20（-0.67至0.57） |
| 左股CII： |
| 状态3 | -0.24（-0.73至0.55） | -0.24（-0.79至0.63） | -0.23（-0.86至0.67） |
| 马克斯 | -0.20（-0.73至0.55） | -0.18（-0.76至0.56） | -0.13（-0.79至0.62） |
| RCR-A型 | 0.87（0.58–0.96） | 0.83 (0.49–0.97) | 0.69 (0.22–0.98) |
| RCR-F型 | 0.71 (0.30–0.91) | 0.70（0.35–0.89） | 0.62 (0.10–0.89) |
| 心脏CII： |
| 状态3 | 0.06（-0.36至0.68） | 0.09（-0.40至0.64） | 0.14（-0.45至0.64） |
| 马克斯 | 0.16（-0.29至0.85） | 0.19（-0.32至0.82） | 0.22（−0.43至0.74） |
| RCR-A型 | 0.49 (0.14–0.81) | 0.55 (0.22–0.86) | 0.58 (0.28–0.87) |
| RCR-F型 | 0.52（-0.21至0.98） | 0.50（-0.18至0.96） | 0.41（-0.11至0.89） |
3.3. 平台之间的相关性e（电子）利用骨骼肌和心肌中分离的线粒体和渗透性骨骼肌纤维进行生物能量学
血小板生物能量参数与骨骼肌和心肌生物能量学的相关性总结如下血小板MAX与渗透骨骼肌纤维中的复合物I+II OXPHOS显著正相关（R=0.51，CI:0.05-0.81；A） ●●●●。血小板储备能力与透化肌纤维中复合物I+II OXPHOS有关（R=0.61，CI:0.22–0.85）。血小板MAX和储备能力也与渗透性骨骼肌MAX非耦合呼吸显著正相关（分别为R=0.44，CI:0.05-0.74；R=0.58，CI:0.21-0.85）。与单核细胞MAX一样，血小板MAX与骨骼肌分离线粒体的RCR-F和RCR-A显著正相关（R=0.64，CI:0.23-0.89，D类；R=0.53，CI:0.16–0.83；分别）。血小板储备能力也与RCR-F和RCR-A以及骨骼肌分离的线粒体MAX（R=0.59，CI:0.18–0.87）和状态3生物能量能力（R=0.57，CI:0.17–0.80）显著正相关。此外，血小板MAX与心脏分离线粒体的RCR-F和RCR-A显著正相关（R=0.58，CI:0.22-0.85，F；R=0.42，CI:0.03–0.80；分别）。
血小板生物能量参数与骨骼肌和心肌生物能量学的相关性。血小板最大非偶联呼吸和储备能力与呼吸控制比、骨骼肌和心肌线粒体最大非偶联呼气、渗透性骨骼肌纤维最大氧化磷酸化能力和最大非偶联呼气之间的回归。显示了每个关联的皮尔逊相关性和p值。
表4
血小板生物能量学与骨骼肌和心肌生物能量学的关系。血小板呼吸参数与渗透骨骼肌纤维和分离线粒体生物能量学的Pearson相关性和95%置信区间股外侧肌和心脏组织。
| 基本（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%CI） |
|---|
| 渗透纤维： |
| 基础 | -0.06（-0.53至0.42） | 0.10（-0.56至0.57） | 0.27（-0.61至0.74） |
| 综合设施I OXPHOS | 0.19（-0.39至0.67） | 0.34（-0.21至0.72） | 0.45（-0.04至0.79） |
| 复合物I+II OXPHOS | 0.34（-0.25至0.81） | 0.51 (0.05–0.81) | 0.61 (0.22–0.85) |
| 马克斯 | 0.26（-0.29至0.81） | 0.44 (0.05–0.74) | 0.58 (0.21–0.88) |
| 左股CII： |
| 状态3 | 0.05（-0.46至0.64） | 0.32（-0.06至0.64） | 0.57（0.17–0.80） |
| 马克斯 | 0.12（-0.46至0.72） | 0.36（-0.07至0.70） | 0.59 (0.18–0.87) |
| RCR-A型 | 0.40（-0.24至0.87） | 0.53 (0.16–0.83) | 0.56 (0.10–0.87) |
| RCR-F型 | 0.49（-0.18至0.93） | 0.64 (0.23–0.89) | 0.69 (0.35–0.90) |
| 心脏CII： |
| 状态3 | −0.26（−0.66至0.29） | -0.08（-0.53至0.47） | 0.18（-0.31至0.68） |
| 马克斯 | -0.16（-0.61至0.41） | 0.01（-0.48至0.54） | 0.22（-0.31至0.70） |
| RCR-A型 | 0.35（-0.04至0.74） | 0.42 (0.03–0.80) | 0.42 (0.07–0.75) |
| RCR-F型 | 0.56 (0.18–0.86) | 0.58 (0.22–0.85) | 0.46 (0.03–0.81) |
3.4. 单核细胞生物能量学与骨骼肌、心肌和渗透性骨骼肌分离线粒体的部分相关性
单核细胞与渗透性骨骼肌纤维（独立控制年龄、体重和HOMA-IR）之间的部分相关性总结如下当控制体重时，单核细胞呼吸与渗透性骨骼肌复合体I+II OXPHOS之间的相关性不再具有统计学意义，表明生物能量功能与体重之间可能存在相互作用(). 在控制年龄、体重和RCR-F的HOMA-IR后，单核细胞呼吸与骨骼肌分离线粒体之间具有统计显著性的关系减弱。控制体重降低了单核细胞储备能力与复合物I和I+II OXPHOS之间的关联强度，以及分离的骨骼肌线粒体RCR-F和RCR-A。单核细胞生物能量学与心脏分离的线粒体之间唯一持续的关系是在控制体重时单核细胞储备能力和RCR-A之间().
表5
单核细胞和血小板生物能量学与渗透性骨骼肌生物能量学之间的部分相关性。单核细胞和血小板呼吸参数与左侧渗透骨骼肌纤维生物能量学的部分相关性和95%置信区间股外侧肌控制年龄、体重和胰岛素状态。
| 部分（年龄）
| 部分（重量）
| 部分（HOMA-IR）
|
|---|
| 渗透纤维： | 基础（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%CI） | 基本（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%CI） | 基本（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%CI） |
|---|
| 单核细胞： |
| 基础 | −0.55（−0.83至−0.17） | -0.49（-0.82至0.03） | -0.36（-0.79至0.42） | −0.47（−0.79到−0.14） | −0.46（−0.79到−0.09） | -0.38（-0.78至0.22） | −0.51（−0.85至−0.04） | -0.50（-0.83至0.12） | -0.43（-0.76至0.30） |
| 综合设施I OXPHOS | 0.64 (0.13–0.89) | 0.63 (0.13–0.90) | 0.56（-0.11至0.90） | 0.76 (0.26–0.92) | 0.75（0.26–0.92） | 0.63（-0.03至0.91） | 0.74 (0.16–0.95) | 0.73 (0.13–0.95) | 0.61（-0.15至0.91） |
| 复合物I+II OXPHOS | 0.71 (0.26–0.96) | 0.67 (0.02–0.97) | 0.52（-0.30至0.95） | 0.79（-0.30至0.97） | 0.75（-0.28至0.98） | 0.57（-0.42至0.93） | 0.79 (0.39–0.98) | 0.75 (0.34–0.97) | 0.57（−0.03至0.91） |
| 马克斯 | -0.19（-0.72至0.56） | -0.27（-0.77至0.52） | -0.37（-0.81至0.40） | 0.21（-0.63至0.86） | 0.12（-0.85至0.69） | -0.07（-0.77至0.66） | 0.06（-0.57至0.76） | −0.05 (−0.64−0.68) | −0.25 (−0.81−0.47) |
| 血小板： |
| 基础 | -0.25（-0.72至0.34） | −0.04（−0.59至0.51） | 0.21（-0.40至0.69） | -0.07（-0.71至0.32） | 0.07（-0.58至0.47） | 0.25（-0.40至0.63） | -0.11（-0.51至0.35） | 0.06（-0.42至0.48） | 0.25（-0.43至0.70） |
| 综合设施I OXPHOS | 0.18（-0.40至0.69） | 0.34（-0.22至0.78） | 0.08（-0.14至0.79） | 0.19（−0.39至0.60） | 0.34（-0.20至0.66） | 0.46（-0.09至0.79） | 0.14（-0.48至0.60） | 0.30（-0.27至0.65） | 0.43（−0.15至0.74） |
| 复合物I+II OXPHOS | 0.34（-0.16至0.83） | 0.52（-0.11至0.84） | 0.60 (0.13–0.84) | 0.34（-0.27至0.81） | 0.52 (0.11–0.78) | 0.62 (0.19–0.84) | 0.31（-0.31至0.79） | 0.50（0.01–0.79） | 0.60 (0.19–0.82) |
| 马克斯 | 0.17（-0.36至0.68） | 0.40（-0.05至0.76） | 0.56 (0.12–0.88) | 0.25（-0.36至0.67） | 0.43（-0.05至0.73） | 0.57 (0.15–0.83) | 0.25（-0.29至0.67） | 0.46（-0.02至0.75） | 0.59 (0.18–0.85) |
表6
单核细胞生物能量学与骨骼肌和心肌生物能量学之间的部分相关性。单核细胞呼吸参数与左侧线粒体生物能量学的部分相关性和95%置信区间股外侧肌和心脏组织，控制年龄、体重和胰岛素状态。
| 部分（年龄）
| 部分（重量）
| 部分（HOMA-IR）
|
|---|
| 基本（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%CI） | 基本（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%CI） | 基本（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%CI） |
|---|
| 左股CII： |
| 状态3 | -0.45（-0.94至0.85） | -0.43（-0.94至0.92） | -0.34（-0.94至0.85） | -0.19（-0.81至0.29） | -0.19（-0.80至0.22） | -0.17（-0.74至0.15） | -0.37（-0.87至0.68） | -0.39（-0.87至0.59） | -0.39（-0.91至0.54） |
| 马克斯 | -0.22（-0.90至0.90） | -0.19（-0.87至0.93） | -0.13（-0.88至0.92） | -0.18（-0.78至0.37） | -0.16（-0.76至0.26） | -0.11（-0.68至0.24） | -0.37（-0.88至0.71） | -0.37（-0.91至0.76） | -0.33（-0.95至0.74） |
| RCR-A型 | 0.80 (0.32–0.97) | 0.78 (0.29–0.98) | 0.65 (0.03–0.97) | 0.86 (0.37–0.97) | 0.83（0.36–0.97） | 0.67（-0.11至0.98） | 0.89 (0.57–0.98) | 0.84 (0.45–0.98) | 0.65 (0.02–0.99) |
| RCR-F型 | 0.74 (0.33–0.93) | 0.72 (0.28–0.95) | 0.61（-0.15至0.95） | 0.68 (0.14–0.92) | 0.67 (0.09–0.89) | 0.58（-0.25至0.84） | 0.73（-0.36至0.99） | 0.71（-0.15至0.99） | 0.59（0.04–0.96） |
| 心脏CII： |
| 状态3 | 0.06（-0.55至0.80） | 0.10（-0.55至0.74） | 0.14（-0.63至0.69） | 0.13（-0.42至0.82） | 0.18（-0.47至0.89） | 0.26（-0.51至0.82） | 0.11（-0.47至0.76） | 0.16（-0.50至0.82） | 0.22（-0.67至0.85） |
| 马克斯 | 0.17（-0.44至0.90） | 0.20（-0.43至0.87） | 0.22（-0.50至0.81） | 0.22（-0.34至0.83） | 0.26（-0.46至0.88） | 0.31（-0.60至0.89） | 0.24（-0.26至0.78） | 0.29（-0.35至0.85） | 0.33（-0.61至0.90） |
| RCR-A型 | 0.32（-0.40至0.90） | 0.42（-0.32至0.91） | 0.53（−0.05至0.87） | 0.53（-0.33至0.91） | 0.61（-0.10至0.94） | 0.66 (0.27–0.97) | 0.45（-0.27至0.93） | 0.51（−0.18至0.98） | 0.54（-0.53至0.99） |
| RCR-F型 | 0.36 (−0.77−0.93) | 0.36（-0.78至0.94） | 0.33（-0.77至0.92） | 0.57（-0.44至0.96） | 0.57（-0.51至0.97） | 0.48（-0.39至0.95） | 0.52（−0.01至0.96） | 0.51（-0.26至0.97） | 0.42（-0.37至0.92） |
3.5. 血小板生物能量学与骨骼肌和心肌分离线粒体及渗透性骨骼肌的部分相关性
血小板与骨骼肌和心肌中分离的线粒体和渗透性骨骼肌纤维之间的部分相关性独立控制年龄、体重和HOMA-IR，总结如下：使用偏相关法独立控制年龄、体重和HOMA-IR后，血小板储备能力与渗透性骨骼肌复合体I+II OXPHOS和MAX非耦合呼吸显著正相关(). 心脏分离线粒体之间的关系减弱，但在控制体重和血小板基础、MAX时，血小板储备与RCR-A保持相关，而在控制HOMA-IR时，储备与RCR-F呈正相关().
表7
血小板生物能量学与骨骼肌和心肌生物能量学之间的部分相关性。血小板呼吸参数与左侧线粒体生物能量学的部分相关性和95%置信区间股外侧肌和心脏组织，控制年龄、体重和胰岛素状态。
| 部分（年龄）
| 部分（重量）
| 部分（HOMA-IR）
|
|---|
| 基本（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%CI） | 基础（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%CI） | 基本（95%置信区间） | 最大值（95%置信区间） | 储备（95%置信区间） |
|---|
| 左股CII： |
| 状态3 | 0.05（-0.52至0.67） | 0.34（-0.02至0.69） | 0.59 (0.20–0.85) | 0.03（-0.68至0.55） | 0.30（-0.32至0.62） | 0.57 (0.07–0.80) | −0.02（−0.54至0.59） | 0.28（-0.13至0.66） | 0.56 (0.10–0.84) |
| 马克斯 | 0.26（-0.32至0.75） | 0.51 (0.11–0.81) | 0.67 (0.29–0.92) | 0.10（-0.61至0.59） | 0.35（-0.24至0.67） | 0.58 (0.12–0.84) | 0.02（-0.52至0.62） | 0.30（-0.18至0.74） | 0.55 (0.05–0.90) |
| RCR-A型 | 0.23（-0.27至0.83） | 0.42 (0.04–0.81) | 0.53 (0.03–0.83) | 0.43（-0.19至0.85） | 0.58 (0.18–0.86) | 0.63 (0.21–0.89) | 0.29（-0.31至0.84） | 0.44 (0.00–0.80) | 0.51（-0.05至0.84） |
| RCR-F型 | 0.56 (0.08–0.93) | 0.70（0.39–0.91） | 0.71 (0.37–0.92) | 0.50（-0.09至0.93） | 0.67 (0.29–0.91) | 0.73 (0.45–0.91) | 0.36（-0.25至0.91） | 0.55 (0.08–0.86) | 0.64 (0.25–0.86) |
| 心脏CII： |
| 状态3 | -0.27（-0.68至0.28） | -0.05（-0.53至0.44） | 0.21（-0.25至0.65） | -0.26（-0.60至0.11） | −0.08（−0.46至0.31） | 0.18（-0.21至0.53） | -0.24（-0.70至0.40） | −0.04（−0.58至0.54） | 0.23（-0.30至0.70） |
| 马克斯 | -0.13（-0.61至042） | 0.06（-0.48至0.55） | 0.26（-0.23至067） | -0.16（-0.53至0.21） | 0.01（-0.41至0.37） | 0.22（-0.21至0.58） | −0.10（−0.60至0.40） | 0.08（-0.48至0.55） | 0.30（-0.24至0.71） |
| RCR-A型 | 0.16（-0.49至0.60） | 0.29（-0.41至0.71） | 0.34（-0.28至0.77） | 0.35（-0.16至0.71） | 0.43（-0.13至0.84） | 0.42 (0.01–0.77) | 0.29（-0.36至0.74） | 0.37（-0.27至0.84） | 0.37（-0.15至0.79） |
| RCR-F型 | 0.46（−0.01至0.78） | 0.49（-0.02至0.80） | 0.39（-0.10至0.73） | 0.56（-0.10至0.90） | 0.58（−0.09至0.87） | 0.46（-0.07至0.80） | 0.60 (0.21–0.84) | 0.62 (0.24–0.88) | 0.48 (0.08–0.80) |
4.讨论
线粒体功能障碍是许多疾病的主要驱动因素，尤其是与衰老相关的慢性疾病，包括肥胖[47]、糖尿病[24]和心力衰竭[25]线粒体功能障碍可能由多种机制介导，如异常的有丝分裂[12]，氧化应激[49],[50]或线粒体DNA异质性[51]这些途径中缺陷的累积效应最终影响线粒体氧化磷酸化，这可以通过分析细胞或分离线粒体的耗氧速率来评估[52].
肌肉线粒体生物能量学在肥胖、糖尿病和肌肉减少症等多种疾病中发挥着重要作用[53],[54],[55]虽然肌肉呼吸测定法大大提高了我们对线粒体生物能量学的机械理解，但在大规模临床试验或针对活检禁忌症患者（如体弱的老年人）的研究中，此类测量可能会带来过度负担。近年来，血细胞线粒体功能与各种疾病状态和疾病之间的潜在关系受到了关注[56]本研究直接探讨循环细胞的生物能量特征是否与骨骼肌和心肌线粒体功能测量的关键方面相关。我们报告的主要发现是，血细胞最大呼吸与渗透性肌纤维束中氧化能力的多项指标呈正相关。完整血细胞和肌纤维的呼吸能力都包含内在氧磷能力和线粒体含量对整体生物能量能力的累积影响。有趣的是，我们还发现单核细胞和血小板的最大呼吸能力与呼吸控制有关，这是线粒体耦合的可靠测量方法，在分离的骨骼肌和心肌线粒体中进行测量[57]这些结果表明，考虑到线粒体含量和网络活性的潜在差异以及固有ETC功能，血细胞呼吸与整体生物能量功能的差异有关。总的来说，这份手稿中报告的研究结果支持这样一种假设，即血细胞呼吸测定可以重述系统生物能量容量的关键读数，并提供肌肉代谢健康的最小无创指数。未来需要进行纵向研究，以确定生物能量能力如何随着时间和疾病的发生/发展而在组织间发生变化。
本研究的主要优势在于，在一个具有良好表型的非人类灵长类动物模型中，将基于血液的生物能量谱与呼吸分析相比较，以分析新分离组织中的渗透性肌纤维和分离线粒体，该模型在年龄和代谢健康方面具有高度可变性。Kavanagh等人研究了代谢健康和不健康的雌性女贞猕猴，并公布了葡萄糖（分别为60.5 mg/dL和104.7 mg/dL）、胰岛素（分别为20.8 mIU/mL和26.5 mIU/mL）和HOMA-IR（分别为3.04和6.76）的平均值。这些值与我们在相同年龄段的队列中测得的值相似，尽管用于本研究的代谢多样性动物队列中的变异性更大[30]Chacko等人发表的单核细胞（83.9 pmol/min/250k细胞）和血小板（199.4 pmol/min/2500万细胞）的耗氧率与我们的研究中测量的值相似，非人类灵长类动物的渗透性纤维与其他人发表的人类结果相似[41],[58]类似地，分离的骨骼肌和心肌的呼吸控制比与Park等人在人类心脏和骨骼肌中描述的呼吸控制比相似。（5.3±0.7，3.2±0.4）和其他[59],[60],[61]总之，我们认为我们在本研究中报告的呼吸速率与其他研究组之前的报告一致。
应该注意的是，在测量不同组织和循环细胞中的线粒体功能时，存在基本的方法学差异。这限制了我们报告的各种读数之间逻辑上可以进行的比较。血细胞保持完整，以进行呼吸测量评估；然而，骨骼肌纤维是用温和的洗涤剂渗透的，这种洗涤剂对主要存在于质膜中但不存在于线粒体膜中的胆固醇酯具有特异性[62]本研究中使用的分离线粒体制剂侧重于固有ETC特性，而非线粒体对呼吸能力的潜在贡献或线粒体含量的差异。考虑到这些方法上的差异，最直接的比较是血细胞和肌肉纤维的呼吸能力。事实上，我们发现，即使在控制了多个协变量后，这些指标也显著正相关。为了比较完整血细胞与分离的肌肉线粒体的呼吸能力，我们认为RCR代表了内在ETC功能的适当测量。Brand和Nicholls提出，当使用分离线粒体时，RCR是一种可靠的功能测量方法，因为它高度依赖于组织和底物，并且随着氧化磷酸化的任何改变而改变[57]单核细胞和血小板呼吸与分离线粒体的RCR之间的关系表明，血细胞中较高的总呼吸也可能与线粒体的内在耦合有关，而与肌肉中的线粒体含量无关。未来使用渗透性血细胞和分离血细胞线粒体的研究可能有助于澄清这些关系。本研究的局限性在于，我们仅报告了分离线粒体制剂中复杂II驱动呼吸的数据。未来的研究应该比较分离的线粒体和透化血细胞中复合物I和复合物II驱动的呼吸。
很明显，一系列疾病表现为线粒体功能的改变；无论是遗传性线粒体病因学、急性中断（如缺血再灌注）还是慢性疾病（如与衰老相关的许多疾病）。最近的研究表明，与健康对照组相比，术后单核细胞的基本和最大生物能量功能降低[63]研究还表明，糖尿病肾病患者外周血单个核细胞的储备能力和最大呼吸量降低，有证据表明循环线粒体DNA升高可能先于细胞代谢功能障碍[64],[65]在这里，我们证明基于血液的细胞呼吸测定与两种测量骨骼肌呼吸测定的常用方法产生的生物能量测量值相关。这些发现为未来临床试验和可靠线粒体诊断的发展提供了潜在应用。单核细胞和血小板细胞呼吸与骨骼肌和心肌呼吸相关。血小板分离简单、快速，并能可靠地产生高产量，使这些细胞成为未来开发临床诊断工具的有力候选细胞。未来仍需对不同血细胞群之间生物能量测量的可靠性进行比较，未来的研究应调查特定循环因素的影响，如循环线粒体DNA、氧化还原应激、细胞因子、，以及血液细胞生物能量功能的其他可能线粒体损伤相关分子模式。此外，在衰老常见的各种疾病状态下，血细胞生物能量学如何改变，以及它们如何受到促进健康衰老的干预措施（包括减肥和锻炼）的影响，仍有待确定。
基金
这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持[P30-AG21332，P30-AG049638，R21-AG051077，RR019963/OD010965]；和美国退伍军人事务部[VA 247-P-0447]。
披露
提交人未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。
作者贡献
D.J.T.、M.S.B.、T.C.R.和A.J.A.M.策划了这项研究。D.J.T.对血细胞和骨骼肌纤维进行分离和呼吸测定。M.S.B.对分离的线粒体进行线粒体分离和呼吸测定。D.J.T.和M.S.B.分析了结果。D.J.T.和A.J.A.M.与M.S.B.、M.J.J.和T.C.R.一起撰写了手稿。
致谢
我们感谢Heather Gregory、John Stone、Tara Chavanne、Margaret Long和Karin Murphy帮助收集和运输样本以及帮助进行呼吸测定，我们感谢Edward Ip博士对统计方法的投入。
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