氧化还原生物。2016年12月；10: 53–64.
能量-氧化还原轴视角下的盐度胁迫：来自海洋潮间带扁形虫的教训
,a、，⁎ ,一 ,一 ,b条和一
乔治娜·里弗拉·英格拉姆
一法国蒙彼利埃大学，UMR 9190 MARBEC，法国蒙彼利埃34095
奥德·诺米克
一Groupe fonctionnel AEO（适应性生态生理学与Ontogenèse），UMR 9190 MARBEC，蒙彼利埃大学，34095 Montpellier，France
伊娃·布隆道·比德
一法国蒙彼利埃大学，UMR 9190 MARBEC，法国蒙彼利埃34095
彼得·拉德纳
b条奥地利因斯布鲁克大学动物研究所和分子生物科学中心
杰汉·赫韦·利格诺
一Groupe fonctionnel AEO（适应性生态生理学与Ontogenèse），UMR 9190 MARBEC，蒙彼利埃大学，34095 Montpellier，France
一Groupe fonctionnel AEO（适应性生态生理学与Ontogenèse），UMR 9190 MARBEC，蒙彼利埃大学，34095 Montpellier，France
b条奥地利因斯布鲁克A-6020因斯布鲁克大学因斯布鲁克动物研究所和分子生物科学中心
2016年8月4日收到；2016年9月20日修订；2016年9月21日接受。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
摘要
在全球变化的背景下，保护生理学研究人员迫切需要了解导致获得应激适应表型的生理机制。潮间带生物不断应对其环境条件的急剧变化，成为研究生理适应的杰出模型。由于这类过程的实施通常需要较高的生物能量成本，因此线粒体/氧化应激方法成为分析全动物反应时最相关的方法。这里我们使用潮间带扁虫木质大口分析盐度适应的生物能量学及其在活性氧/氮物种形成和抵消氧化还原失衡的生理反应方面的后果。水通量和身体体积的测量表明M.利尼亚诺是一种高/等调节因子。研究表明，高盐度是最耗能的条件，线粒体密度增加，呼吸速率增加。这种修饰是以增强超氧阴离子生成为代价的，很可能与高caspase 3上调有关。然而，这些动物通过上调一些线粒体抗氧化酶（如超氧化物歧化酶）的表达，得以在高盐度的环境中生存。相反，低盐度动物的呼吸速率降低，活动减少，一氧化氮生成增加，表明存在一定程度的代谢停滞。在这些个体中观察到二氯荧光素荧光的矛盾增加和谷胱甘肽-S-转移酶pi 1（GSTP1）表达的上调。如果低盐度的动物确实面临代谢抑制，回到海水中可能会导致氧化爆发。我们假设GSTP1的增加可能是一种“氧化应激的准备”，即一种在返回海水时抵消自由基生成的机制。本研究的结果为耐受性生物如何进行亚细胞适应以抵御环境变化提供了新的线索。
缩写：ASW，人工海水；C-H公司2DFFDA，5-（和-6）-羧基-2′，7′-二氟二氢荧光素二乙酸酯；二氯荧光素；二氢噻吩；ΔΨ米线粒体膜电位；NO、一氧化氮；P（P）二氧化碳，下临界第页O（运行）2;P（P）c1，上临界第页O（运行）2; ROI，关注区域；活性氧；RNS，活性氮物种；SW，海水；VO（旁白）2，呼吸频率
关键词：能量平衡、扁虫、活体成像、线粒体膜电位、渗透调节、RNS、ROS
集锦
•
高盐度导致O2·-低盐度时，DCF荧光增强。
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高盐伴随着抗氧化酶如SOD的上调。
•
低盐导致动物进入一定程度的代谢停滞。
•
低盐度也会导致GST-pi上调，为复氧做准备。
1.简介
除其他因素外，位于河口和潮间带环境中的生物经常暴露于环境盐度的高变化中。这些变化在填隙生境中尤其明显，可能会在很短的时间内发生：潮汐影响与夏季常见的高温和强烈蒸发相结合，可能会迅速增加水的盐度。同样，暴雨和/或淡水径流也会大幅降低盐度。因此，盐度是决定潮间带和河口自由生活小型底栖生物种群结构的关键因素[1],[2]为了在这些栖息地中生存，生物体必须成功实施渗透调节机制，以调节其水分含量[1].
根据它们的渗透调节反应，海洋无脊椎动物可以被视为渗透调节器或渗透调节器（反过来又可以是高/等调节器或高/低调节器），这取决于它们是否将其内部液体的渗透压维持在较高、较低或与其环境盐度相同的渗透压下[3]在渗透压调节剂中，血淋巴渗透压的变化反映了外部介质的变化。高盐度下的高/等调节器也是如此，尽管它们在浸泡在稀释海水（SW）中时能够通过高调节过程控制血淋巴渗透压。高/低调节器将其内部介质的渗透压保持在相对恒定的水平，与环境盐度无关，因此在较高盐度浓度下低调节，在稀释SW中高调节。小型动物有机体（如自由生活的扁形动物）缺乏循环系统，该系统负责处理所有生理调节，以应对细胞内离子浓度的变化，这分别导致在经历低或高光子应激时的初始全身肿胀或脱水。这些机制通常涉及有机渗透物和衍生物的积累或分解代谢，这些有机渗透物或衍生物有助于细胞内渗透压，并控制水和离子在膜上的流动。许多工作描述了不同生命阶段的渗透调节能力和机制，例如。[4],[5]根据营养状况，例如。[6],[7]甚至在不同化学或物理压力的影响下，例如。[8],[9]很少有研究调查小型底栖生物的渗透调节，主要集中于线虫[1],[10],[11]基本上忽略了扁形虫模型。审核人[12],[13],[14],[15].
许多出版物都描述了无脊椎动物渗透调节的能量成本，这些出版物通常通过测量呼吸速率来解决这一机制，例如。[16],[17]这种呼吸的一部分导致为渗透调节过程提供燃料所需的ATP生成，并不可避免地导致线粒体水平上活性氧和氮物种（ROS/RNS）的形成。尽管这些化合物在细胞内环境稳定中发挥着必要的作用，但它们也因其对蛋白质、脂质甚至核酸等细胞化合物的有害影响而闻名。这些反应，通常被称为“氧化应激”（OS），可以通过上调抗氧化防御功能部分抵消，这是另一个需要额外能量消耗的活跃过程。然而，很少有研究探讨环境盐度变化对线粒体活性、自由基生成和抗氧化防御管理的影响[18],[19]，很少有人试图确定这些过程与渗透调节之间的联系，例如。[20],[21]鉴于最近的研究表明，整个动物的呼吸频率不一定代表能量代谢，这个问题至关重要[22].
本研究集中于能量-氧化还原轴，以了解动物在不断变化的环境中面对环境盐度变化的生理和行为反应，其中潮间带生物受到越来越多的高、低渗冲击。我们使用了一种新的研究模型，即上部潮间带自由生活扁形虫，木质大口（裂口目：大型口目）[23]这是一个研究对环境变化的生理适应的有趣物种[24]也是一个很好的模型，用于从性别选择到各种研究[25]干细胞研究[26]，老化[27]或生物粘附[28]我们的主要目标是分析高或低渗应激如何影响动物能量平衡、线粒体功能以及ROS/RNS水平，从而评估获得适应表型的成本以及这些动物用清除酶对抗ROS过度产生的能力。该模型是一个小而透明的生物体，通过应用活体成像技术，为研究高、低渗电击对自由基形成和线粒体功能的影响提供了独特的机会体内.
2.材料和方法
2.1. 动物培养和实验治疗
文化M.利尼亚诺（DV-1线）[29]在人工SW（ASW）中饲养（海盐，Sigma S-9883）（35 ppt）。动物被放在培养皿中，上面有硅藻曲线Nitszchia之前在吉拉德F/2培养基（Sigma G0154）中培养至少3周。硅藻和蠕虫培养物均保持在室温（RT，20°C）下，光周期为16:8小时（昼夜）。本研究中使用的所有动物均为成年动物，因此大小和年龄同步（<1.5个月大）。
我们考虑了4个不同的盐度值，在初步实验中没有观察到死亡率：5 ppt、15 ppt、35 ppt（此处视为对照条件）和55 ppt。除基因表达分析外，所有动物均暴露于环境中6小时，其中处理延长至24小时，以确保诱导应激相关mRNA丰度的显著变化[30],[31],[32]所有分析均在ASW中进行。
2.2. 体积测量
平均长度为0.8 mm，M.利尼亚诺个体太小，无法通过普通技术测量渗透压。因此，通过体容量测量间接推断出体内渗透浓度，这是这些或类似生物体（如自由生活线虫）的常见程序[33]使用配备徕卡DC300F相机的徕卡Diaplan显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar，德国），使用≈200µm深的载玻片（如Schärer等人。[83])和3µl培养基，全部用盖玻片覆盖。这些条件确保了标准化测量，动物在显微镜下只能在X-Y轴上移动，同时保持焦点[34]每个个体在盐度变化之前（T=0）和之后每隔五分钟（T=5到T=60分钟）进行成像。考虑到这是一个2D测量，肌肉收缩可能会引起区域变化（与水分无关），因此在可能的情况下，动物在走动时会被拍照。出于同样的原因，为每只动物和时间点拍摄了三张照片。使用ImageJ软件（NIH，Rasband WS）计算动物总面积。对于每种实验蠕虫，使用三张相应的图片对动物总面积进行平均。数值表示为与35 ppt时的尺寸相比的相对体积（T=0）。因此，大于1和小于1的值分别表示身体体积的增加或减少。
2.3. 动物活动
用Mitotracker Deep Red 633（Ex:633 nm；Em:660 nm）对五只先前适应不同盐度的动物进行染色，以便于追踪动物。在分析之前至少1小时，将荧光团添加到浓度为0.33µM的实验培养基中，并保存在该培养基中直到实验结束。在与体容量分析相同的条件下分别观察动物。使用共焦旋转盘W1 Andor和配备Neo sCMOS相机的倒置显微镜尼康，以200毫秒的频率对他们进行单独扫描2分钟。这项技术以及深红色染色的使用被用来将激光对动物活动的影响降到最低。使用ImageJ软件对生成的图像进行叠加，然后导入Imaris并使用“Imaris Track”模块（BitPlane）进行分析。使用“Imaris Track”软件的不同功能计算考虑的所有参数（例如平均或最大动物速度）。
2.4. 呼吸测量
实验动物从其原始培养物中分离出来，并在ASW中禁食约15小时，以避免营养应激的影响[35]由喂食的动态行为以及相关过程的生理成本所导致。按照上文所述进行测量[24]，稍有改变：简单地说，将20只动物分组（在其相应的盐度中）浸泡在玻璃微量滴定板的各个孔中（德国美因茨米克罗格拉斯化学技术公司），该玻璃微量滴定盘以前配备有氧气传感器点（OXSP5，传感器代码SD7-545-214）（德国亚琛Pyro-Science GmbH）。将每个微孔填充至其最大容量（100±0.5µl），以避免形成气泡，并用18×18 mm盖玻片密封微孔，在盖玻片周围放置硅，以确保气密性。光电二极管校准为100%O2在空气饱和水中的溶解度和0%O2水。后者是使用新制的80 mM Na通过化学方法实现的2SO公司三解决方案。使用四通道光纤氧气计（FireSting，Pyro-Science GmbH）测量每个微腔内的氧气浓度，并通过Pyro-Oxygen Logger软件进行记录。所有测量都是在含氧充分的水中开始的（>98%），呼吸被记录为下降的函数第页O（运行）2随着时间的推移。同时进行四次测量（包括空白，不含动物），每隔3s记录数据。在适应不同的实验盐度6小时后，允许动物呼吸，直到每个微腔中的氧气完全消耗完毕（4-6小时取决于环境盐度），并评估盐度对低氧管理的依赖性影响。临界氧分压(P（P）c（c）)定义如下[36]，使用下面描述的方程式进行计算[37].无论盐度如何，上临界值第页O（运行）2(P（P）c1)和较低临界值第页O（运行）2(P（P）二氧化碳)检测到的M.利尼亚诺动物以氧气调节的方式呼吸[24]也就是说，其中氧气消耗率（VO2)保持恒定，与环境O无关2浓度。VO（旁白）2使用以下值计算值：P（P）c1和P（P）二氧化碳，根据环境盐度进行校正，表示为nmol O2小时−1印度独立电力公司−1.
2.5. 线粒体参数
在4种实验盐度条件下，线粒体密度（ρ米)线粒体膜电位（ΔΨ米)活性氧的产生是使用所谓的“活体成像技术”进行测量的，包括使用特定染料和体内通过荧光显微镜进行可视化。在本研究中，所有分析均使用Leica DM 2500共焦显微镜（Leica Microsystems）进行。每个治疗组使用10只动物进行所有实验，所有40名个体的整个实验方案至少重复两次，以确保结果的重复性。本研究中的染料（见)单独使用，以避免它们之间的任何可能干扰。我们还确保每种染料的盐度和荧光之间没有干扰。仅发现5-（和-6）-羧基-2′，7′-二氟二氢荧光素二乙酸酯（C-H2DFFDA），如前所述，荧光随盐度增加而增加[20]因此，对该染料应用了校正系数。
表1
| | | | | 励磁
| 排放
| |
|---|
| 染料 | 最终混凝土。使用量（µM） | 孵育时间（min） | Ind/批次 | N次重复（总次数/次） | λ1（纳米） | λ2（纳米） | PMT1（纳米） | PMT2（纳米） | 计算 |
|---|
| C-H公司2DFFDA（乙醇） | 10.6 | 30 | 10 | 2 (20) | 488 | – | 510–550 | – | 最大强度 |
| | | | | | | | | |
| 二氢乙硫酸氢钠（DHE）（DMSO中） | 4 | 30 | 10 | 3（30） | 405 | 488 | 400–440 | 620–660 | PMT2/PMT1比率 |
| DAF-2DA（DMSO中） | 8 | 30 | 10 | 3 (30) | 488 | – | 505–525 | – | 最大强度 |
| JC-10（DMSO中） | 5 | 30 | 10 | 3 (30) | 488 | 488 | 500–550 | 560–600 | PMT1/PMT2比率 |
| MitoTracker深红色633（DMSO中） | 0.33 | 60 | 10 | 3 (30) | 633 | – | 640–680 | – | 最大强度 |
| MitoSOX（DMSO中） | 5 | 30 | 10 | 2 (20) | 510 | – | 560−600 | – | 最大强度 |
在每次实验之前，通过调整阈值来抑制自身荧光。通过进行短时间（<5 s）的低分辨率（256×256像素）扫描以调整焦距，使光漂白最小化，然后以512×512像素的分辨率进行单次扫描以进一步量化。所有图像均使用Leica LAS Lite软件（Leica Microsystems）进行处理，如中所述[24]（请参见)：对于非比例染料，在检查其垂直于身体纵轴、与最大荧光强度区域重合且始终在动物头部对齐后，通过绘制每只动物5–10个横断面进行量化在里面[24]]. 对于比例染料，如二氢乙硫铵（DHE）和JC-10，使用尺寸为40±0.88µm的感兴趣区域（ROI）进行量化2.
不同环境盐度条件下动物随时间的相对体容量。对于每个时间点，与不同字母相关的值显示出它们之间的显著差异。
2.6. RNA提取和转录水平量化
动物在蠕虫固定前48小时从其原始培养物中提取，以避免肠道内容物对基因表达分析的任何可能干扰。M.利尼亚诺暴露于不同的实验盐度下24小时，然后对4只动物池进行溶解，并使用NucleoSpin®RNA XS柱（德国杜伦市Macherey-Nagel）并按照制造商的指南提取其总RNA。在提取过程中，通过无RNase DNase I处理去除基因组DNA。在15µl无RNase水中洗脱纯总RNA。使用配备RNA纳米芯片的安捷伦生物分析仪2100评估RNA浓度和完整性（安捷伦科技，加利福尼亚州，美国）。使用M-MLV逆转录酶（Invitrogen，法国）进行逆转录。
使用回声®将525液体处理系统（美国加利福尼亚州Labcyte Inc.）、0.75µl LightCycler-FastStart DNA Master SYBR-Green I™Mix（德国曼海姆罗氏）、0.015µl每个引物（0.2µM最终浓度下正向和反向）、0.22µl超纯水和0.5µl cDNA分配到384孔反应板中。每个样品一式三份。qPCR条件如下：在95℃下变性10 min，然后重复扩增45个周期（95℃，15 s），杂交（60℃或62℃，根据所用引物对，5 s）和延伸率（72℃，10 s），最后在40℃下步骤30 s。采用熔融曲线程序控制扩增特异性。在qPCR中使用超纯水作为无模板对照。效率在1.61到2.04之间。底漆的设计基于木霉属转录组组装（版本MLRNA131024）[38]所用每个基因的引物序列如所示.
表2
| 基因首字母缩写 | 基因名称 | 序列ID数据库MLRNA131024 | 引物序列5′至3′正向/反向 | 扩增子长度（bp） | 退火温度（°C） | 放大效率 |
|---|
| 环氧化酶5b | 细胞色素c氧化酶亚基5B | RNA1310_41945 | CGCCTGCTAGACCGTCC/CTGACGGTACCACGG | 112 | 60 | 1.94 |
| casp3基因 | 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 | RNA1310_1479.1号 | GCCAGAGACTCCAGCCC/CTGCGTCTCCTGGCAG | 208 | 62 | 2.04 |
| 谷胱甘肽硫转移酶P1 | 谷胱甘肽S-转移酶pi 1 | RNA1310_29579.1 | TTCGGTGCCAGGAAGAATCT/CCCATTTAAAGATGCGA | 89 | 60 | 1.61 |
| 管理层1 | 微粒体谷胱甘肽S-转移酶1 | RNA1310_49001.2号 | ATGTGCTGCCGTTTGTACTG/CCTACTGGCGGCAAGATTC公司 | 98 | 60 | 1.83 |
| prdx6型 | 过氧化物还原酶6 | RNA1310_35269号 | ACCAGGCCTTGATCTTCA/TGTCAATCTGAAGCCGGAGT公司 | 229 | 60 | 1.94 |
| prdx1型 | 过氧化物酶原1 | 核糖核酸1310_28865.2 | CGCGGCCTGTTCATCATCAA/GCTTGTCGGTGAACTGGAAG | 124 | 60 | 1.73 |
| 草皮2 | 超氧化物歧化酶2，线粒体 | RNA1310_30405号 | 美国食品药品监督管理局 | 101 | 60 | 1.81 |
| rpl12型 | 核糖体蛋白L12 | RNA1310_36703号 | GACAAGGTTAACGAGCCTC/TATAGCAGCGGTGTCAA | 81 | 60 | 1.87 |
| gm2a标准 | GM2神经节苷脂激活剂 | RNA1310_42438号 | CATCACCTGCCCGAGATTC/TCTCAATGCGCTCAGC公司 | 132 | 62 | 1.75 |
2.7. qPCR数据分析
共测试了6个看家基因，以确定我们分析的最适当参考：α-微管蛋白大号，β微管蛋白浴缸，β-肌动蛋白行动b，3-磷酸甘油醛脱氢酶加德夫，核糖体蛋白L12rpl12型和GM2神经节苷脂激活剂gm2a标准.我们的分析确定，最后两个基因在表达稳定性和Ct值方面最合适，并且gm2a标准已经被强调为一个很好的参考基因M.利尼亚诺盐分胁迫下[39]根据Vandesompele等人的建议[40]，通过使用每个样本的2个参考基因的Ct值的几何平均值，并将目标基因归一化为该几何平均值来计算相对表达水平。
2.8. 统计分析
结果显示为平均值±平均值标准误差（S.E.M.）。夏皮罗试验用于测试mRNA相对水平表达数据的正常性。均方差通过Bartlett检验进行检验，残差独立性通过Durbin-Watson检验进行评估。对于由胱天蛋白酶3表达产生的数据，在进行统计分析之前，应用Box-Cox变换以实现正态分布。结果通过单因素方差分析（ANOVA）进行评估，然后进行Tukey事后检验（HSD：诚实显著差异），显著性水平为p<0.05。所有统计分析均使用RStudio免费软件（R Core Team，2014年版本0.99.891）和SPSS 15.0（SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）进行。
3.结果
3.1. 音量调节
在接触低盐度（5 ppt）的前10分钟内，M.利尼亚诺通过平均增加39%的身体体积来做出反应(). 然而，在这段时间之后，生物体的体积会慢慢减小，在首次接触5 ppt后50分钟，与对照动物相比，没有观察到显著差异。相反，暴露在高盐条件下（55 ppt）会导致动物突然失水。在暴露的前15分钟内，动物平均损失了其总初始体积的20%，并且没有恢复，在与对照动物的整个实验过程中观察到显著差异（35 ppt）。在首次接触高渗条件后24小时内记录这些动物的数据，并确认在此时间内没有恢复（数据未显示）。
3.2. 动物活动
盐分处理，尤其是暴露于5 ppt，对动物行为有显著影响（参见). 受最低盐度影响的动物表现出明显较低的活动性，这些观察结果通过伊玛瑞斯分析得到了证实，表明这些动物的最大值显著较低（K=1.621；第页<0.01）和平均速度（K=1.484；第页<0.05) (A） ●●●●。在这些情况下，蠕虫的行为主要减少为小的收缩运动（参见B） 。其余盐度处理的这些或其他参数没有显著差异。然而，我们在体积调节记录的框架内观察到，55ppt的动物在暴露的第一个小时内，其活动率往往会急剧下降。然而，正常活动随后会恢复，如.
通过Imaris记录的活动测量。A）动物最大速度（1）和平均速度（2）的定量结果；B） 5 ppt（1）、15 ppt（2）、35 ppt（3）和55 ppt（4）时动物轨迹的代表性图像。
3.3. 呼吸相关测量
平均VO2呼吸氧调节阶段的数值（介于P（P）c1和P（P）二氧化碳)用于各处理之间的比较。结果表明，VO2随盐度增加而增加（K=93.632；第页<0.001）（参见). 15 ppt时的动物表现出类似的VO2和P（P）c（c）值，而低盐暴露导致P（P）二氧化碳也影响VO2减少1.7倍。
呼吸频率测量结果M.利尼亚诺在不同的环境盐度下。条形代表平均呼吸速率（VO2)在上临界值之间第页O（运行）2(P（P）c1)和较低临界值第页O（运行）2(P（P）二氧化碳)（分别为连续线和不连续线）。
3.4。活性氧生成
O（运行）2·-2-OH-E+：DHE比值结果表明，地层随盐度增加而增加（K=31.867；第页<0.001) (A） ●●●●。相反，二氯荧光素（DCF）荧光(B） 在较低的环境盐度下显示出显著增加（K=24.167；第页<0.001). 如DAF-2T荧光所示(C、 在较低的盐度下，一氧化氮（NO）的存在也增加（F=4.683；第页<0.01）。一般根据2-OH-E+：DHE比值结果，线粒体O2·-形成（MitoSOX染色）也显示随着盐度的增加显著增加（F=20.204；第页<0.001) (A） ●●●●。
生活中评估的ROS/RNS形成M.利尼亚诺通过a）DHE，b）C-H2DFFDA和c）DAF染色。子面板1表示2-OH-E的定量值+：DHE（A）、DCF（B）和DAF-2T（C）荧光，而子面板2显示了每个实验的代表性图像。
活体线粒体分析M.利尼亚诺使用a）MitoSOX，b）Mitotracker Deep Red 633和b）JC-10染色作为线粒体O的指标2·-地层，ρ米和ΔΨ米分别是。子面板1表示定量值，而子面板2显示每个实验的代表性图像。
3.5. 线粒体密度和能量状态
在6小时内，暴露于最高盐度（55ppt）环境中的动物的线粒体密度出现了小幅度但显著的增加（F=6.028；第页<0.01) (B） ，比对照动物增加1.3倍。将55ppt暴露时间增加至24小时，这些差异增加到1.8倍（K=31.820；第页<0.001）（未显示结果）。另一方面，ΔΨ米盐度较低时显著增加（K=8.530；第页<0.05) (C） ●●●●。
3.6. 基因表达定量
参考基因的转录水平没有显著差异rpl12型和gm2a标准在盐度处理中(p>（第页）0.062和第页>分别为0.11）。蠕虫的qPCR分析，如证实了我们的Mitotracker Deep Red结果，细胞色素c氧化酶（5B亚基）显著增加(环氧化酶5b)随着盐度的增加表达。同样，高盐诱导caspase 3的表达显著升高(casp3基因)，编码一种参与程序性细胞死亡的酶。正如预期的那样，暴露在高盐环境下会导致本研究分析的许多抗氧化酶的增加，例如微粒体谷胱甘肽-s-转移酶线粒体(管理层1)，过氧化物酶原1(prdx1型)或线粒体超氧化物歧化酶(草皮2). 相反，观察到两种抗氧化酶（即过氧化物酶原6）的水平增加(prdx6型)和谷胱甘肽e-转移酶pi-1(谷胱甘肽硫转移酶P1)当蠕虫浸没在较高或较低的盐度中时prdx6型盐度较高时。GSTP1是唯一一种在低盐度下表现出明显增加的氧化还原酶。
4.讨论
4.1.M.利尼亚诺：渗透调节器还是渗透调节器？
这些结果显示了潮间带扁虫M.利尼亚诺成为一种广盐物种，能够轻松应对从淡水到80 ppt的盐度范围内的临时暴露（Rivera-Ingraham pers.obs）。这是沿海海洋沉积物间隙水域长期暴露在空气中生存的必要条件。由沃顿和佩里审核[33]在没有渗透压测量的情况下，调节体容量是确定小型小型底栖生物渗透调节策略的可靠工具。作为M.利尼亚诺只有在低渗条件下才能恢复其初始体积，我们可以得出结论，我们正在处理一种高/等调节因子。
一些潮间带大型无脊椎动物的渗透调节能量成本已通过测量整个动物的呼吸速率得到解决[例如17]。然而，最近有人指出，这些测量值不一定与能量代谢相关[22]这突出表明需要研究促进线粒体水平适应环境变化的机制过程，包括ATP生成、ROS形成和氧化还原平衡的维持（Rivera-Ingraham&Lignot，subm）。可以从中学到什么木霉属?
4.2. 高渗压力是一个耗能巨大的过程，伴随着氧化还原失衡
很可能M.利尼亚诺经常暴露于高渗条件下，因为该物种栖息在不经常被海水浸泡但经常暴露于高温和辐射水平的上海岸。因此，我们可以预期木霉属发展了一种优化的细胞和分子适应能力，以承受这种恶劣环境，正如de Mulder等人[41]问题在于扁虫对这些高渗环境的生理管理。自20世纪60年代以来，人们已经确定，海洋无脊椎动物的嗜盐性在很大程度上取决于它们调节游离氨基酸胞内浓度的能力[42]和有机离子[43]渗透定律决定，在这种高盐条件下，水会从蠕虫体内溢出，导致脱水。如果这些渗透液存在于培养基中，动物可以吸收并积累它们[44]然而，本研究是使用人工海水进行的，人工海水被认为不含有机渗透剂。因此，我们可以认为，我们实验中的蠕虫通过从头开始与其他潮间带无脊椎动物一样，合成游离氨基酸[45],[46]和类似的小型生物，如线虫[47]。由于动物无法在24小时内恢复其初始体积，我们可以假设它们是高盐度下的渗透压适应者[48]这导致了与此渗透岩生产相关的能源成本的合理问题。
在我们的研究中，动物对高盐度的反应是增加呼吸速率和合成新的线粒体，这两个步骤都可能是满足这种适应机制的能量需求的必要步骤。在其他渗透压形成的无脊椎动物（包括软体动物）中也观察到呼吸速率增加[49],[50]棘皮动物[51]虽然传统上认为较高的呼吸频率代表能量代谢，但最近的研究表明并非总是如此[22].由于我们记录了Δ的下降Ψ米然而，我们可以假设发生了强烈的ATP生成（状态3）。我们的DHE染色显示O的生成量很大2·-随着盐度的增加。目前，人们普遍认为，具有较高膜电位的非病理性线粒体也会产生较高的活性氧，反之亦然[52],[53],[54]这与我们的结果不一致。最近的工作[55]也表明高代谢率与低活性氧生成水平有关。然而，我们的结果并不是第一个证明高盐度导致O2·-形成：使用酵母的研究酿酒酵母也表明高渗应激（0.8M NaCl）诱导O增加5倍2·-这很可能导致氧化应激，因为在这些条件下，抗氧化防御能力下降[56]同样，高渗刺激增加了2-OH-E+（以及DCF荧光）在小鼠下丘脑细胞中，但在这种情况下，前氧化剂的增加伴随着抗氧化酶（如CAT或SOD）的增加[57]。在M.利尼亚诺，其中O2·-可通过上调多种抗氧化酶，即SOD-2，转化O2·-线粒体内（O的主要来源2·-异养生物内）转化为H2O（运行）2.这些O2·-以及由此产生的H2O（运行）2每一种都可能产生不同的有害影响，但当这些分子相互结合或与其他活性物种结合时，对生物结构的影响通常更大。无论如何，这些活性物质经常以不饱和磷脂和细胞膜的其他成分为靶点，导致脂质过氧化物的形成。在这些反应的中间产物中，我们发现了具有高度遗传毒性的物种，如脂质过氧化物（LOOH）[58]为了平衡这些化合物，生物体开发了Prdxs酶，这种酶通过将LOOH还原为相应的醇来解毒。我们的结果表明，扁虫确实在上调（2-Cys）prdx 1型和（1-周期）prdx6型在高盐暴露导致的促氧化条件下，它可以提供额外的解毒能力，并提供细胞保护，防止脂质过氧化，如许多研究中所述，例如。[59],[60].
然而，我们的基因表达数据表明，在高盐条件下，casp-3转录水平大约是SW条件下（35ppt）的1.7倍，是5ppt条件下的8倍以上。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是细胞凋亡的重要介导物，对正常体内平衡至关重要[61]虽然我们的样品体积较小，无法分析动物体内的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性，但我们没有明显的理由相信这种增加casp-3是动物对高盐度不耐受的指标，正如前面提到的那样，M.利尼亚诺能够繁殖并承受更高的盐度浓度。
4.3. 应对低渗应激导致代谢停滞
由于低潮期降雨等事件，在潮间带环境中可能经常出现淡水或近淡水条件。为了生存，动物必须挤出大量的代谢物，如游离氨基酸，以控制其渗透压和体积。然而，游离氨基酸不是以当前形式挤压出来的，而是脱氨基的[参见[16]以及其中的引用]，这是一个与增加的VO相关联的过程2在渗透压下观察到[16],[17]或过度调节无脊椎动物[20].
有趣的是，M.利尼亚诺在暴露的前6小时内降低其呼吸速率。我们的测量结果表明，由于低盐暴露，活动率也显著降低。在这些条件下，动物的水分积累增加，从而增加了体积。我们可以自信地确认，这些活动率的降低并不是因为肿胀的动物无法通过我们的准备，因为自由动物的观察结果得到了证实。此外，在其他海洋扁蠕虫中也观察到呼吸速率和活动的类似下降，如滨海原螯虾
[15]。这种节能策略通常是一种充分的机制，可以在环境压力下生存，最大限度地提高生存机会。在其他潮间带无脊椎动物中已经观察到低氧诱导的代谢抑制，如长春花(利托里纳spp.）。众所周知，这些软体动物会因淡水暴露而进入剧烈的代谢抑制[62]这种以ATP消耗减少为特征的能量保存机制可能导致线粒体建立更高的膜电位。活性率的下降和Δ的增加相同Ψ米在另一项研究中也观察到M.利尼亚诺暴露于急性缺氧时[24]支持低氧诱导代谢率下降的论点。
暴露于5 ppt原因M.利尼亚诺以增加其NO水平。尽管NO是一种自由基，但这个分子对生物分子的反应性相对较低，只是它可以与其他化合物如O相互作用2和O2·-形成更多有害分子[63]NO主要以其信号特性而闻名，Palumbo对其进行了审查[64]在过去的几十年里，人们做了大量的努力来理解这种分子参与的途径。有人认为，在细胞应激条件下，NO-complex IV相互作用启动了一系列保护机制，导致细胞凋亡的预防[65]。这与获得的转录水平的结果一致casp-3在里面M.利尼亚诺正如20世纪90年代已经提出的那样，NO可以导致代谢停滞，例如。[66]简而言之，NO可能通过两条主要途径参与节能战略M.利尼亚诺一种可能性是NO可能与电子传输链直接相互作用。40多年前已经证明NO能够与O连接2细胞色素氧化酶中的结合位点，从而调节呼吸速率[67]这一过程将减少ATP的生成并增加AMP、ADP和其他代谢物的浓度，而这些代谢物又会调节其他细胞过程，如离子运输和蛋白质合成[68]NO暴露对呼吸速率的影响已经在M.利尼亚诺
[69]作为一种易于通过生物膜的脂溶性分子，NO暴露消除了扁形虫的氧化调节能力。第二种理论是NO刺激鸟苷环化酶，它可能通过环磷酸鸟苷（cGMP）途径控制细胞过程。这种机制是为了调节蛋白激酶和离子通道等而设计的，但在哺乳动物细胞的代谢停滞过程中也起着关键作用，例如。[70]虽然cGMP路线被认为对海洋无脊椎动物很重要（参见[71],[72]以及脊椎动物（例如。[73])需要更多信息来确认缺氧/缺氧耐受性、cGMP和NO之间的联系。
因此，需要进一步研究来确定和解开NO生成与代谢抑制诱导之间的关系，而扁形虫模型可能是一个理想的工具。这将为研究这些途径在系统发育中的年龄和分布开辟一个新的进化视角。关于a）NO的作用机制和b）NO的来源仍然存在未决问题。关于后者，以前的工作已经检测到了这种分子在扁形虫中的产生和信号传递作用[74]，其中一氧化氮合酶（NOS）被鉴定为来源。本研究及其他M.利尼亚诺支持NOS确实存在于这种扁形虫中的假设[69,38]然而，低氧条件下的DAF-2DA染色在使用普通NOS抑制剂（如L（左）-NAME（Rivera-Ingraham等人，unpub）表示，至少在压力条件下，产生的大多数NO可能有其他来源。
4.4. 代谢性抑郁症与促氧化细胞条件有关吗？
同样值得注意的是2·-在高盐度时，地层显示出急剧增加，尽管朝向最低盐度，DCF荧光也有重要变化。作为一种相对非特定的染料，DCFH可能会因介质盐度等众多参数而被氧化[20]多种细胞内和细胞外条件，例如。[75],[76]。尽管该染料在定量方面存在明显缺陷，但我们可以得出结论，低盐环境会导致M.利尼亚诺然而，问题仍然是ROS的增加是否与NO的生成及其调节作用有关。秦等人。，[70]用兔心脏研究表明，NO供体的治疗增加了cGMP水平，这一过程伴随着ROS形成的同等增加，这可能是通过线粒体K的开放发生的列车自动防护系统通道。同样，NO或具有类似抑制作用的分子（如CO）对细胞色素氧化酶的抑制可导致Δ的超极化Ψ米ROS增加[参见[77]以及其中的参考文献]。这些作者还建议，抑制复合物IV产生的活性氧可能具有进一步的益处，例如抗炎作用。但是，在代谢性抑郁症的情况下，ROS增加的意义是什么？最重要的是，如何（如果我们确实处于有限的能量条件下）以及为什么它会增加某些抗氧化酶（如GSTP-1）的浓度？
4.5. 从低渗性休克中恢复：对复氧的预期？
如果我们考虑到这一点M.利尼亚诺为了抵抗低渗透性休克，显著降低其能量成本（就ATP生成、蛋白质周转和其他能量消耗途径而言），发现某些基因表达上调似乎是矛盾的。然而，在文献中发现，在应对导致代谢停滞的应激源（如冷冻、禁食或缺氧）时，生物体表现出这种反应的案例并不罕见。这种机制被解释为在恢复和复氧时发生氧化爆发的准备[78],[79]如果处理不当，活性氧产生的这种突然爆发最终可能导致细胞损伤甚至死亡。这种机制最初是在20世纪90年代初被发现的，被称为“氧化应激准备”（POS）假说，Hermes Lima等人最近详细回顾了这一主题。，[78].但这是不是M.利尼亚诺? 我们的数据表明，这种扁形虫物种在暴露于低盐度时确实进入了“代谢停止”状态。此外，值得注意的是，在这些条件下，一些抗氧化酶（即GSTP1）在该物种中的水平增加。我们是否面临POS案件？这将是第一次将这种机制与渗透挑战联系起来进行描述。许多出版物报告了GST动力学与无脊椎动物呼吸速率之间的负相关关系。为了说明这一点，de Oliveira等人。[80]据报道，缺氧蟹鳃中GST水平增加颗粒沙蜥（Chasmagnathus granulata）。这在蜜蜂等昆虫中也有描述，在低温和饥饿条件下，GST水平也会增加[81]同样地，陆地蜗牛的脚肌肉乳耳当面临禁食时，CAT和SOD活性增加，但最重要的是，GST防御比活动动物高79%至108%[82].
结合上一节讨论的最后一个悬而未决的问题，我们考虑了我们在低渗透性休克下检测到的ROS形成是否可能参与触发蠕虫中的GST上调。自20世纪90年代以来，越来越多的研究指出，活性氧在低氧或同等条件下发挥作用，启动一系列不同的途径，以上调这些抗氧化酶的活性，为复氧或恢复有利条件做准备（由[78]).
5.结论和未来展望
正如之前对该物种进行的生态生理学研究所指出的那样，该物种的许多特性使其成为研究环境变化的生物能量平衡的非常合适的模型。如本研究所示，M.利尼亚诺在生物降解和活性氧生成方面，对低盐和高盐环境的反应非常不同。当高渗环境诱导线粒体生物发生和呼吸增加时，这些扁形虫通过进入代谢停滞而面临低渗性休克。然而，这两种应力条件都会导致ROS和RNS的形成，从而产生不同种类的低渗和高渗冲击。因此，M.利尼亚诺由于ROS/RNS物种在不同条件下差异很大，因此发现每种情况下产生的抗氧化酶的性质不同也就不足为奇了。然而，在新陈代谢停止的情况下，仍然应该有一种能量平衡，不仅可以诱导渗透调节过程，还可以诱导抗氧化防御。这就引出了一个问题，即为什么GST主要是产生的，而不是其他氧化还原酶。这与产生的活性氧类型或生物能量学成本有关吗？生产GST的成本是否会低于CAT或SOD等其他酶？
为了回答本研究中提出的一些问题，未来的研究将考虑在低渗性休克期间使用活性氧清除产物，以揭示活性氧是否真的参与触发GST上调信号，如果是，如果ROS信号的消除威胁到动物在回到海水条件下的生存能力。
致谢
本研究由玛丽·居里行动欧盟授予G.A.R-I.P.L.的FP7-PEOPLE-2013-IEF（授予编号622087-“IAS-Life”）资助。奥地利科学基金（FWF P25404-B25）支持了本研究。作者感谢蒙彼利埃RIO成像平台的Vicky Diakou和Elodie Jublanc对旋转圆盘操作和伊玛瑞斯动物活动分析的支持。作者还感谢Joanna Munro女士（蒙罗语言服务）的英语编辑、Anne-Laure Charles博士和Joffrey Zoll博士（法国斯特拉斯堡医学院）对结果解释的贡献，以及Dr。维克托·达利（Victor Darley）-乌马尔（Ammar）和两位匿名审稿人，以及他们对原稿的评论。
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