氧化还原生物。2016年12月；10: 45–52.
谷胱甘肽维持可减轻与年龄相关的氧化还原循环剂敏感性
,a、，b条 ,一 ,a、，b条 ,一和a、，b、，⁎
尼古拉斯·O·托马斯
一美国俄勒冈州科瓦利斯市俄勒冈州立大学莱纳斯·鲍林研究所，邮编：97331-6512
b条美国俄勒冈州立大学生物化学和生物物理系
凯特·P·夏
一美国俄勒冈州科瓦利斯市俄勒冈州立大学莱纳斯·鲍林研究所，邮编：97331-6512
阿曼达·R·凯利
一美国俄勒冈州科瓦利斯市俄勒冈州立大学莱纳斯·鲍林研究所，邮编：97331-6512
b条美国俄勒冈州立大学生物化学和生物物理系
朱迪·巴特勒
一美国俄勒冈州科瓦利斯市俄勒冈州立大学莱纳斯·鲍林研究所，邮编：97331-6512
托利·M·黑根
一美国俄勒冈州科瓦利斯俄勒冈州立大学Linus Pauling研究所97331-6512
b条美国俄勒冈州立大学生物化学和生物物理系
一美国俄勒冈州科瓦利斯市俄勒冈州立大学莱纳斯·鲍林研究所，邮编：97331-6512
b条美国俄勒冈州立大学生物化学和生物物理系
2016年8月23日收到；2016年9月19日修订；2016年9月20日接受。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
摘要
将幼年（4-6月）和老年（24-26月）F344大鼠分离的肝细胞暴露于浓度增加的甲萘醌（一种维生素K衍生物和氧化还原循环剂）中，以确定Nrf2介导的解毒防御的年龄相关性下降是否会导致对外源性损伤的敏感性增加。信用证50对每个年龄组进行了测定，结果表明，衰老导致甲萘醌（LC）敏感性增加近2倍50对于年轻人：405μM；信用证50对于旧的：275μM）。对已知的与甲萘醌解毒相关的Nrf2调节途径的研究表明，令人惊讶的是，NAD（P）H:醌氧化还原酶1（NQO1）蛋白水平和活性随着年龄的增长分别诱导了9倍和4倍（P=0.0019和P=0.018；N=3），但谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）下降了70%（P=0.0043；N=3.）。这些结果表明，毒性可能源于易受脂质过氧化的影响，而不是甲萘醌半醌的还原不足。给300µM甲萘醌后，老年大鼠细胞与年轻大鼠细胞的脂质过氧化程度增加2倍，GSH下降幅度增加3倍（分别为p<0.05和p<0.01；N=3）。因此，我们在接触甲萘醌之前向老年大鼠的肝细胞提供400µM N-乙酰半胱氨酸（NAC），以缓解激发期间GSH合成的半胱氨酸底物可用性限制。NAC预处理导致细胞死亡减少2倍以上，表明甲萘醌敏感性的年龄相关增加可能源于GSH依赖性防御减弱。该数据确定了干预的细胞靶点，以限制甲萘醌和潜在的其他氧化还原循环化合物对年龄相关的毒理学损伤。
缩写：ARE，抗氧化反应元件；BSO、丁硫醚-S、R-亚砜胺；细胞色素P450还原酶；二氯苯酚靛酚；谷胱甘肽过氧化物酶4；乳酸脱氢酶A；LOO，脂质过氧化物；丙二醛；NQO1，NAD（P）H：醌氧化还原酶1；NQO2，NAD（P）H：醌氧化还原酶2；Nrf2，核因子（红细胞衍生2）样2；放射免疫沉淀法；TRE，TPA-响应元件
本文中的化合物研究：BSO（PubChem CID:119565）、DMF（PubChem CID:6228）、NAC（PubCem CID:12035）、Menadione（Pub化学CID:4055）
关键词：谷胱甘肽、甲萘醌、氧化还原循环、解毒能力、衰老
集锦
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LC显示，随着年龄的增长，雌二醇的毒性几乎高出两倍50F344肝细胞中。
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甲萘醌治疗期间谷胱甘肽（GSH）的损失随着年龄的增长而加快。
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与年龄相关的GPX4蛋白丢失与甲萘醌诱导的MDA增加相关。
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NAC维持的GSH减轻了与年龄相关的氧化还原循环甲萘醌敏感性。
1.简介
衰老的一个主要特征，以及包括灵长类在内的多种物种中与年龄相关的病理生理学发病的一个关键驱动因素，是细胞氧化还原稳态机制的破坏，这些机制可保护机体免受各种环境、氧化、病理和毒理的侵害[1],[2],[3],[4],[5],[6]Nrf2依赖的II期解毒机制尤其倾向于随着年龄的增长而下降[7],[8],[9],[10],[11],[12]这些解毒途径中与年龄相关的减少以及随后活性氧/氮物种（ROS/RNS）的增加是众所周知的，并且与各种病理学有关，例如心血管和神经退行性疾病、癌症和糖尿病[13],[14],[15],[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22]与这种损失相关的机制尚不清楚；然而，我们发现肝脏Nrf2蛋白合成随着年龄增长而下降，并且II期解毒基因表达有限[7],[23],[24]然而，尽管Nrf2调节的解毒酶的基础表达随着年龄的增长而下降，但这种缺失是否会放大通过这些途径解毒的ROS/RNS和外源性药物的毒理学暴露效应尚不清楚。这项研究特别感兴趣的是与年龄相关的抗急性氧化还原循环挑战的恢复力变化。
氧化还原循环化合物是促氧化剂催化剂，它有助于电子转移到氧气上以产生活性氧物种（ROS）[25],[26]这些化合物作为异源化合物（例如氧化还原活性金属和农药）中的取代基含量很高[27],[28],[29],[30],[31]氧化还原活性药效团（例如麻醉剂）[32]，尤其是它们在药物化疗药物（如甲萘二酮、蒽环类、阿霉素和阿霉素）中的应用[33],[34],[35],[36],[37].肝脏中氧化还原循环物质的解毒能力下降可能会增加对外源性接触的脆弱性，并限制一些医疗选择，如抗生素和抗癌化疗[38],[39],[40],[41]这一点尤为重要，因为癌症发病率随年龄呈指数增长[42]因此，重要的是要确定氧化还原循环化合物的解毒是否与年龄相关，如果是，这些类型的药物、毒素或环境外源性物质中哪些具有更高的毒性。
为了验证我们的假设，即肝脏对氧化还原循环化合物的恢复力存在与年龄相关的下降，我们采用了急性甲萘醌挑战。甲萘醌是维生素K的衍生物和氧化还原循环剂，其作用机制已得到很好的表征。在此，我们表明，老年大鼠的肝细胞更容易受到甲萘醌的损伤。此外，虽然参与甲萘醌代谢的某些解毒酶实际上随着年龄的增长而增加，但观察到的与年龄相关的甲萘酮易损性似乎源于Nrf2调节的谷胱甘肽依赖解毒途径的显著减弱。
2.材料和方法
2.1. 试剂
NAC（类别号616-91-1）、甲萘醌（类别号58-27-5）、NADPH（类别号2646-71-1）、二氯苯酚靛酚（DCPIP；类别号620-45-1）和蛋白酶抑制剂混合物（类别号P8340）是从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）订购的。IV型胶原酶购自沃辛顿生化公司（新泽西州莱克伍德）。PVDF转移膜购自Millipore（马萨诸塞州Billerica）。Dicumanol（产品目录号66-76-2）从Calbiochem（德国达姆施塔特）订购。
2.2. 动物
年轻和年老的雄性F344大鼠均来自国家老龄动物研究所。这些大鼠被安置在莱纳斯·鲍林研究所的动物设施中，在进行任何实验之前，让它们适应环境至少1周。动物以12小时的光周期（上午7点至下午7点）饲养，并随意喂食标准食物。根据IACUC指南（保证编号：A3229-01），所有动物工作均获得批准。AAALAC认证的实验动物资源中心（LARC）提供管理和兽医护理。
2.3. 肝细胞分离
如前所述进行肝细胞分离[43]简单地说，通过AALAC批准的方案进行动物处死后，通过门静脉插管用Hank的pH值为7.4的平衡盐溶液灌注肝脏。去除血液后，使用胶原酶溶液（1 mg/mL）分离肝细胞。通过无菌纱布过滤所得细胞悬浮液，以去除结缔组织和碎屑。利用重力过滤分离实质细胞，并用Krebs–Henseleit溶液（pH 7.4）洗涤三次。细胞重新悬浮在Kreb-Henseleit溶液中，置于圆底烧瓶中，并在室温下旋转1 h，然后使用台盼蓝排除法评估细胞计数和存活率。
2.4. 细胞和组织裂解物
对于全细胞裂解物，悬浮细胞通过100×克，在Krebs-Henseleit溶液中洗涤，pH 7.4，并在添加蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，含有1%NP-40（v/v）、100 mM NaCl、2 mM EDTA、2 mM-原钒酸钠）中进行超声处理。对于组织，如Siegel等人之前所述获得裂解物。。[44]简单地说，使用体积重量比为5:1的RIPA缓冲液中的均质机均质组织。将匀浆超声3次并在10000×克离心（4°C），然后收集上清液进行测定。对于NQO1分析，将组织裂解物的上清液进行额外的超速离心步骤（30000×克在4°C下持续1小时）。样品的蛋白质浓度通过Bradford试验（类别号500-0006，BioRad）或Pierce 660 nm试验（类别编号22660，Thermo Scientific）测定。
2.5. 甲萘醌毒性评估
肝细胞稀释至4×106使用Kreb-Henseleit溶液（pH 7.4），在置于细胞培养箱（5%CO）中的MACSMIX（Miltenyi Biotec）旋转器上旋转细胞/mL237°C）以保持细胞悬浮。在使用台盼蓝排除法检测肝细胞活力之前，用浓度增加的甲萘醌（0、100、200、300、400、500和600μM）处理肝细胞2小时。将甲萘醌溶解在二甲基甲酰胺（DMF）中。DMF也被用作载体对照，在所有处理实验中，处理细胞悬浮液中的总DMF体积为0.05%。
2.6. NQO1活性测定
样品的NQO1活性如Siegel等人之前所述进行了分析。[44]简单地说，在检测NQO1在双香豆素（可逆NQO1-特异性抑制剂）存在和不存在的情况下对DCPIP的NAD（P）H依赖性还原之前，按照上述方法制备年轻和年老动物的组织。使用DU800分光光度计在600 nm波长下检测DCPIP还原1分钟，并测量NQO1活性作为还原的双香豆素抑制部分。反应溶液中试剂的最终浓度为0.2 mM NAD（P）H和40μM DCPIP（含或不含20μM双香豆素）。
2.7. 丙二醛定量
如Wong等人之前所述，测量脂质过氧化产物丙二醛（MDA）。[45]并由Sommerburg等人修改。[46]简单地说，200µL悬浮细胞（4×106cells/mL）与750µL 440 mM磷酸、250µL 42 mM硫代巴比妥酸（TBA）和300µL水混合，然后煮沸1 h。将样品放入冰浴中，使反应停止。然后，在16000×离心之前，添加等量（1.5 mL）的1 M NaOH样品克在10°C下保持5分钟。使用Luna C18（2）]Phenomenex#00G-4252-E0）色谱柱，在等速模式下（25 mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5/乙醇[50:50]作为洗脱液），通过HPLC从其他代谢物中分离丙二醛，并通过荧光检测（激发，532 nm；发射，553 nm）。根据四甲氧基丙烷（TMP）标准曲线定量丙二醛。
2.8. 免疫印迹法
如上所述制备裂解液，进行超声处理，并将蛋白质溶解在含有SDS的Laemmli加载缓冲液中进行PAGE。样品在100°C下热变性5分钟。将标准化量的蛋白质（30μg/lane）在SDS-PAGE上进行，并用半干吸墨纸转移到PVDF膜上。在含有1%吐温-20和5%脱脂奶粉或3%牛血清白蛋白的PBS中封闭膜，在室温下与一级抗体孵育2小时，清洗，并在室温下用二级抗体培养1小时，清洗、用化学发光试剂孵育、暴露于膜，然后显影。出于尺寸/空间考虑，对显示的图像进行了裁剪。使用针对以下蛋白质的抗体：GPX4（Protein Tech-Cat#14432-1-AP）、NQO1（Abcam-Cat#ab2346）、细胞色素P450还原酶（CPR，EC 1.6.2.4；Abcam–Cat#13513）、乳酸脱氢酶A（LDHA；Cell Signaling Technology-Cat#2012）和肌动蛋白（Sigma-Aldrich–Cat#A5044）。用美国国立卫生研究院的ImageJ软件对印迹进行密度分析。
2.9. 谷胱甘肽分析
根据Faris和Reed的方法测定悬浮细胞中的谷胱甘肽（GSH）含量[47]由Smith等人修改。[7]简单地说，在含有10 mM EDTA的等量10%（w/v）高氯酸（PCA）中均质悬浮液。脱蛋白后，将200µL含有内标物（γ-谷氨酰胺）的上清液与50µL碘乙酸（100 mM溶于0.2 mM中）混合米-甲酚紫），并通过使用KOH–KHCO将pH调节至10三缓冲器（2 M KOH:24 M KHCO三). 样品在室温下放置在黑暗中1小时。产生的结果S公司-通过添加等体积的1-氟-2,4-二硝基苯（在无水乙醇中为1%v/v）对羧甲基衍生物进行进一步的化学修饰。溶液在黑暗和室温下培养过夜。使用Thermo Scientific（Eugene，OR）APS-2 Hypersil柱通过HPLC分离样品（75µL），并在岛津（日本京都）SPD-10AVP UV–Vis分光光度计上检测，吸光度设置为365 nm。定量是通过与GSH和GSSG标准相关的积分获得的。
2.10. 统计分析
所有统计分析均使用Excel（Microsoft，Inc.）和Prism 6和7（GraphPad Software，Inc.）进行。误差条表示平均值的标准误差。对于两个样本之间的比较，双侧学生吨-使用了测试。导致p值≤0.05的样本之间的差异被认为具有统计学意义。Student’s评估了多重比较的统计分析吨-使用Sidak-Bonferroni事后方法进行测试。
3.结果
3.1. 急性甲萘醌激发导致肝细胞损伤和生存能力丧失
为了确定与年龄相关的对甲萘醌激发的相对敏感性，将年轻和老年大鼠新鲜分离的肝细胞等分样品与甲萘酮浓度增加的溶液进行孵育，并在激发2 h后评估存活率。中的结果研究表明，无论年龄大小，甲萘醌浓度的增加都与细胞损伤和活力丧失指数的增加相一致。对于幼年大鼠的肝细胞，与溶媒对照组相比，使用的最低甲萘醌浓度（100µM）没有导致毒性变化；相反，从老年大鼠分离的肝细胞对甲萘醌缺乏任何恢复能力，表明在所有测试浓度下，肝细胞都会丧失活力。信用证50甲萘醌的计算值为405µM，年轻和老年大鼠肝细胞的计算值分别为275µM(). 这些结果表明，随着年龄的增长，甲萘醌的敏感性显著增高（p<0.05，N=3），并表明基础细胞对这种氧化还原循环介质的防御受到损害。
甲萘二酮的急性毒性随着年龄的增长而增强。用越来越多的甲萘醌（0-600µM）处理年轻和老年大鼠分离的肝细胞。暴露后2小时通过台盼蓝排除法测定存活率。N=3，*p<0.05。。
3.2. 随着年龄的增长，甲萘醌的易感性增加不是由NQO1缺失或细胞色素P450还原酶（CPR）增加引起的
考虑与其解毒相关的机制()一种或多种抗氧化剂或II期解毒酶活性的改变可能导致甲萘醌的年龄依赖性增加。因为几乎所有这些酶都主要由Nrf2调节[48],[49],[50],[51],[52],[53],[54]，我们试图确定甲萘醌解毒的潜在损害，这可能是其毒性随年龄增加而增强的基础。
甲萘醌解毒方案。甲萘醌是一种有效的氧化还原循环剂，在醌和半醌状态之间循环，产生超氧物，最终可能导致氧化和亚硝化损伤。NQO1通过将甲萘醌还原为对苯二酚来解毒，然后将其消除。氧化还原循环产生的主要氧化损伤是脂质过氧化（LOO），主要由谷胱甘肽依赖性GPX4酶解毒。
CPR将甲萘醌从醌状态转换为半醌状态；因此，任何与年龄相关的还原酶增加都会导致氧化还原循环水平升高。然而，我们发现老年动物肝细胞中的CPR蛋白减少了约2倍(A、 p=0.0137，N=3）。这些结果表明，如果有什么不同的话，随着年龄的增长，甲萘二酮的氧化还原循环可能会减少。
随着年龄的增长，CPR蛋白水平降低，而NQO1蛋白水平和活性增加。评估年轻（Y）和老年（O）动物肝组织匀浆中的CPR蛋白水平（A）、NQO1活性（B）和蛋白水平（C）。A、B和C的N=3，*p=0.0137、0.0185和0.0019。
因为CPR不能解释甲萘醌的毒性升高，所以我们检测了肝脏中NQO1的水平和活性，因为该酶催化甲萘酮的双电子还原为完全还原的对苯二酚状态(). 完全还原限制氧化还原循环，并启动甲萘醌解毒和从细胞中清除。我们观察到，与幼年动物相比，老年大鼠肝脏中的NQO1蛋白质含量和酶活性显著增加，而不是假设的NQO3水平随年龄而下降。如所示B、 NQO1活性随年龄增长而增加近4倍（p=0.0185，N=3），这与该酶的肝蛋白含量增加（9.3倍增加，p=0.0019，N=3）相一致C.虽然稳态NQO1活性的显著升高可能代表了对衰老大鼠肝脏的高促氧化细胞环境的适应，但这些结果表明NQO2不太可能是与甲萘醌易损性相关的机制的一部分。
3.3. 肝GSH和GPX4的年龄相关下降有助于甲萘醌介导的细胞毒性
甲萘醌及其氧化还原循环引发的活性氧物种主要通过谷胱甘肽依赖机制解毒（参见。)我们之前报告称，随着年龄的增长，该指数显著下降[7]为了确定在甲萘醌损伤下肝脏GSH水平是否受限，在大约LC时用甲萘酮处理幼年和老年动物的肝细胞50用于老年大鼠（300µM）。结果表明，甲萘醌在两个年龄组都能迅速消除GSH，但它对老年大鼠GSH肝细胞的损失明显更大。如所示，甲萘醌导致衰老大鼠肝细胞GSH在一分钟内下降>80%。甲萘醌介导的谷胱甘肽（GSH）在幼年动物细胞中的损失明显较轻（约下降60%）。年轻人和老年人在所有时间点的谷胱甘肽水平均存在显著差异（p≤0.01，N=3）。此外，幼年大鼠肝细胞中的谷胱甘肽水平从未低于约35%的阈值。因此，随着年龄的增长，肝脏谷胱甘肽的储备会更快、更广泛地丧失，谷胱甘氨酸的急剧下降先于细胞损伤和生存能力丧失的指标。
甲萘醌治疗期间的谷胱甘肽损失随着年龄的增长而加快。用300µM甲萘醌处理年轻和老年大鼠的肝细胞15分钟，并测定GSH含量。N=3，*p≤0.01。
为了进一步确定谷胱甘肽依赖性甲萘醌脱毒的年龄相关性差异，我们检测了肝脏谷胱甘苷过氧化物酶4（GPX4）的浓度。这种酶是磷脂氢过氧化物的主要保护剂，也已知在防止氧化还原循环中起重要作用[55],[56]Western blot分析显示，老年肝细胞中GPX4蛋白水平显著低于年轻肝细胞(A；70%，p=0.0043，N=3），这与包括肝脏在内的多个组织中GPX4水平随年龄增长而下降的报告一致[57],[58]..
GPX4蛋白水平随着年龄的增长显著降低，这与甲萘醌诱导的MDA增加有关。通过western blot（A）评估年轻（Y）和老年（O）动物肝细胞的GPX4蛋白水平。测定甲萘醌处理后基础MDA含量（B）和MDA累积量（C）。A、B和C的N=3，*A、B和C的p分别为0.0043、>0.05和<0.05。
由于GPX4主要保护肝脏免受脂质过氧化，我们通过其与硫代巴比妥酸（TBA）的衍生化，测量了肝脏丙二醛（MDA）的水平，MDA是多不饱和脂质氧化的生物标志物。由于TBA衍生化可能会高估脂质过氧化水平，我们采用了一种特征鲜明的HPLC方法来最小化体外伪影，从而可以看出脂质过氧化随年龄和甲萘醌的相对差异。[59]值得注意的是，在没有甲萘醌的情况下，未观察到MDA水平的年龄相关性差异，这表明尽管GPX4的年龄相关性缺失，但基础脂质氧化及其解毒仍得以维持(B） 。然而，甲萘醌暴露在约LC50对于老年大鼠肝细胞（300µM），导致两个年龄组的细胞中迅速出现MDA(C） ●●●●。衰老大鼠的肝细胞明显更容易受到甲萘醌介导的脂质过氧化的影响。观察到幼年和老年动物细胞MDA水平的最初增加，随后在2到5分钟时间点之间MDA水平短暂稳定。之后，幼年动物细胞中的MDA水平恢复到基线水平。相反，在2-5分钟的稳定期后，老年大鼠肝细胞的MDA水平迅速增加。15分钟后，幼年和老年动物肝细胞中MDA水平分别为147.4±13.8和274.2±35.1 pmol/mg蛋白。此外，幼年动物肝细胞中的脂质过氧化水平从未增加超过5%，而老年大鼠肝细胞的脂质氧化程度则高出78%，并且在甲萘醌激发15分钟后仍在上升。年轻人和老年人之间的差异是显著的，与GPX4的丢失以及细胞损伤和生存能力的丧失相一致。
3.4。谷胱甘肽前体可逆转与年龄相关的甲萘醌毒性
由于GPX4的作用是以GSH为代价的，并且在我们的模型中GSH也随着年龄的增长而降低，因此我们假设，向细胞提供NAC应缓解半胱氨酸底物对GSH合成的限制，从而增加对甲萘醌损伤的抵抗力。在甲萘二酮暴露前用NAC（400µM）预处理1小时，可显著增加老年大鼠肝细胞对甲萘二酮的耐药性。事实上，我们的数据表明，NAC治疗逆转了甲萘醌增加的年龄相关性易感性(p=0.003，n=5），这与300µM甲萘醌处理的幼年动物肝细胞无法区分(). 与特定谷胱甘肽合成抑制剂丁硫氨酸亚砜胺（BSO；400µM，持续1小时）共给药，消除了NAC拯救肝细胞活力的能力，这证明了谷胱甘苷是关键成分的概念。
在甲萘醌暴露前用NAC预处理细胞可提高抵抗力。在添加300µM甲萘醌之前，用媒剂（水）、400µM NAC或400µM NAC和400µMBSO预处理老年动物的肝细胞1小时。2小时后测定存活率。N=5，*p=0.003与车辆。
4.讨论
衰老过程导致肝脏解毒能力发生不同的变化。例如，许多第一阶段的酶不受年龄的影响，而第二阶段的解毒过程则更加多变[60],[61],[62]我们的数据表明，老化肝细胞中NQO1水平和活性显著增加，但GPX4显著下降。因此，虽然与年龄有关的基础排毒能力的一般性丧失是明显的，但尚不清楚这种下降是否至少是部分代偿性的，或者是否导致易受某些种类的外源性化合物的影响。我们目前的研究很重要，因为我们的数据支持这样一个概念，即至少对于氧化还原循环化合物（例如甲萘醌）来说，它对年龄有着深刻的敏感性。
目前的研究重点是使用年轻和老年大鼠新鲜分离的肝细胞研究急性甲萘醌损伤的易感性。这种细胞模型适合于理解解毒过程中的衰老差异，因为这些细胞在抗应激方面保持其衰老表型。它还可以直接评估动物献祭时由年龄引起的肝脏解毒能力的潜在差异[43]使用该肝细胞模型，我们之前发现肝细胞和衰老大鼠肝脏中稳态Nrf2水平显著下降[7],[23],[24].
我们在目前的研究中使用甲萘醌，因为参与其解毒的大多数酶都依赖于Nrf2。例如，NQO1将甲萘醌保持在完全还原的对苯二酚状态[25],[26],[63]在其进一步代谢和从细胞中清除之前(囊性纤维变性.). 此外，由于甲萘醌是一种有效的氧化还原循环剂，其急性毒性模式是由氧化还原循环、脂质过氧化和膜损伤级联引起的[26],[64],[65],[66],[67]因此，我们选择检测GSH和GPX4，即定位于细胞膜的主要谷胱甘肽过氧化物酶，作为防止急性甲萘醌暴露引起细胞损伤的主要因素[68],[69],[70],[71]虽然GPX1在过氧化物解毒中也起着主要作用，但它局限于胞质溶胶，因此不是甲萘醌诱导的脂质过氧化的初始解毒剂。因此，甲萘醌暴露引起的外源性处置和急性氧化损伤程度在很大程度上取决于NQO1、GSH和GPX4的肝细胞活性，所有这些都是Nrf2调节机制。
尽管这与Nrf2相关基因转录有着共同的联系，但我们发现衰老并没有统一地影响所有参与甲萘醌解毒的酶组分。例如，我们观察到，随着年龄的增长，肝脏中NQO1的水平及其活性显著增加，而CPR活性降低。总的来说，这些结果可以解释为肝细胞试图限制半醌类物质的水平，从而降低氧化还原循环的速率。然而，GSH水平和GSH依赖性解毒酶（例如GPX4）的显著损失抵消了衰老大鼠肝脏对甲萘醌损伤的这种保护性适应。某些Nrf2依赖性基因会随着年龄的增长而受到影响，而其他基因不会改变或下降的原因目前尚不清楚。关于NQO1，据报道，随着年龄的增长，NQO2水平和/或活性下降[72]，增加[73]或保持年轻时的样子[74]这些结果可能源于用于监测NQO1的各种方法。我们使用了Ernster等人首次开发的DCPIP还原法。[75]Ross等人最近进行了优化。[44]此方法的优点是通过超速离心高度纯化细胞溶质部分，并且不检测甲萘醌-细胞色素c的还原，这会混淆NQO2酶活性。此外，NQO1启动子区域在ARE增强子内包含一个嵌入式TRE（TPA-响应元件）[76],[77]并证明Nrf2在基础转录和诱导转录中具有更高的募集和结合效率[78],[79]尽管Nrf2下降，但这些因素可能解释了我们观察到的增加。无论确切的机制如何，很明显，NQO1与我们在本研究中观察到的与年龄相关的甲萘醌易损性增强无关。
同样清楚的是，衰老大鼠肝细胞中GSH依赖性防御受到损害。我们和其他人之前已经证明肝脏GSH随着年龄的增长而下降[7],[80],[81],[82],[83],[84]; 然而，即使在很老的动物中，谷胱甘肽也保持在毫摩尔水平。因此，在本研究之前，尚不清楚肝脏是否更容易受到谷胱甘肽浓度降低导致的甲萘醌损伤。我们的结果表明，甲萘醌可导致幼年和老年大鼠肝细胞中的谷胱甘肽快速丢失，但在老年动物中，谷胱甘氨酸丢失的速度和程度更为广泛。这种缺乏维持细胞谷胱甘肽的能力似乎是导致随着年龄增长对甲萘醌挑战失去弹性的最重要因素。这一概念得到了我们在甲萘醌损伤前使用NAC和NAC+BSO调节GSH的结果的支持。特别是NACL（左）-半胱氨酸用于谷胱甘肽合成[85],[86],[87]基本上消除了衰老大鼠肝细胞对甲萘醌的易感性增加。综上所述，无法为解毒提供谷胱甘肽，加上GPX4减少，可能会使老化细胞易受各种毒素、氧化剂和环境诱变剂的影响。
本研究揭示的另一个方面是，幼年大鼠肝细胞中的谷胱甘肽水平从未低于初始水平的约35%，而老年大鼠的谷胱甘肽水平则下降了90%。这表明，当甲萘醌介导的氧化超过谷胱甘肽的临界阈值时，细胞毒性迅速发生。由于线粒体包含一个单独的谷胱甘肽库，接近该阈值水平，因此很有吸引力地表明，维持线粒体谷胱甘氨酸对抵抗甲萘醌的损伤特别重要。在这方面，线粒体谷胱甘肽的丢失已被证明会导致线粒体膜电位下降[66],[88],[89],[90],[91]，诱导钙超载并启动导致细胞死亡的坏死凋亡途径[92],[93],[94],[95],[96]我们目前正在研究线粒体谷胱甘肽在衰老过程中使细胞对氧化损伤敏感的作用。
最后，本研究中的结果确定了一个特定的细胞靶点，以潜在地改善解毒和外源性代谢。使用NAC限制急性暴露于药物和毒素的毒性有着重要的临床历史[97],[98],[99]我们的数据表明，可能需要采用类似的NAC预防策略，以提高老年人对外来生物和药物毒性的抵抗力。谷胱甘肽是环境外源性物质、药品、空气污染物和重金属的主要解毒剂。提供NAC以增加半胱氨酸的底物供应，可以避免因Nrf2衰减而导致的谷胱甘肽合成酶的年龄相关性下降。因此，使用NAC作为预防药物而不是干预措施可能会使老年人的GSH水平保持在脱毒水平。
致谢
这项工作得到了NIH P01AT002034和NIH R012AG17141拨款以及俄勒冈州医学研究基金会（拨款编号：2014-14-1837）的资助。N.O.T.得到了NSF老龄研究综合研究生教育和研究实习生的支持。
参考文献
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