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科学代表。2016; 6: 34157.
2016年9月28日在线发布。 数字对象标识：10.1038/srep34157
PMCID公司：项目编号：5039723
PMID：27677421

循环miR-185水平升高作为HBV相关性肝纤维化早期诊断的生物标志物的潜力

李斌,1,2,* 李东良,三，* 赵晨,2,4,* 刘宝海,5 春阳夏,1 吴汉军,2,6 吴朝群,7 郭庆吉,8,9 刘苏,10 吴妮,11 丁康瑶,2 曾志佑,三 陈大贵,12 秦宝东,13 宣欣,1 冈利燕,1 丹丹,2 刘惠民,1 金河,1 洪丽燕,14 朱伟建,1 余洪耀,a、，1和梁祝b、，2
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

肝纤维化的早期诊断对各种慢性肝病的早期干预和预后至关重要。由于相关的侵袭性，传统的重复组织学评估是不切实际的。在目前的研究中，我们评估了循环miR-185作为一种潜在的生物标志物来预测肝纤维化的发生和发展。我们发现，miR-185在HBV肝纤维化患者和肝纤维化大鼠的血液样本中显著上调，miR-85水平与肝纤维化进展相关，但与HBV感染患者的不同病毒载量无关。在晚期肝纤维化期间，在胶原沉积区观察到miR-185。我们发现，miR-185水平的差异促进了早期或晚期肝纤维化与健康对照组之间的区分，使用受体-操作员特征分析具有较高的特异性、敏感性和似然比。miR-185靶向SREBF1，COL1A1和a-SMA基因表达增加，这是肝纤维化的标志。我们的数据支持循环miR-185水平可以作为肝纤维化早期诊断的潜在生物标志物。

肝纤维化是全球发病和死亡的主要原因1,2在促肿瘤微环境中可发展为肝硬化和癌症，或肝衰竭。研究表明，肝纤维化可以逆转为正常状态，但肝硬化无法逆转三,4早期预防或逆转肝纤维化可以改善各种慢性肝病的预后5,6肝纤维化的早期诊断是早期干预的关键步骤。

目前，组织学评估是诊断肝纤维化的金标准方法。研究表明，对接受抗病毒治疗干预的高危患者进行反复组织学评估，有助于追踪纤维化负荷的动态变化，并更准确地预测长期预后7,8然而，这种方法是不切实际的，主要是由于肝活检固有的侵袭性。这也使得该方法不适合在治疗后不久评估治疗效果9,10因此，迫切需要找到一种合适的替代生物标记物，用于在早期发展阶段识别肝纤维化。这也将允许通过非侵入性随访方法监测肝纤维化进展，这对于早期干预非常重要。

miRNAs（MicroRNAs）是一种短的非编码RNA，由大约22个核苷酸组成，对蛋白质编码基因的表达进行负调控。已经有充分的文献证明，miRNAs以稳定和可检测的形式循环，且具有最小的诱导间变异性11,12研究表明，miRNA可以分泌到细胞外环境中，以响应炎症或肝细胞损伤13循环miRNAs在人类慢性肝纤维化中可以表现出不同的表达模式14单个miRNA已被确定为各种形式肝损伤炎症的生物标志物15循环miRNAs，miR-29a和miR-92a，已被证明是人类结直肠癌的有效无创生物标记物。MiR-208a已被证明是人类急性心肌梗死的有效无创生物标志物16,17因此，miRNAs可能是肝纤维化早期检测和分期的良好候选生物标记物。

在本研究中，我们利用大鼠肝纤维化模型和患者标本，将miR-185作为预测肝纤维化发生和发展的潜在候选药物。我们发现，miR-185在人类血液样本和纤维化大鼠血液样本中均显著上调，miR-85水平的增加幅度与肝纤维化的进展相关，但与HBV感染患者的不同病毒载量无关。在晚期肝纤维化期间，在胶原沉积区观察到miR-185。miR-185水平具有较高的特异性、敏感性和似然比，可以在健康对照组中区分早期和晚期肝纤维化。此外，miR-185靶向SREBF1并增加COL1A1和a-SMA基因的表达，这是肝纤维化的标志。我们的数据支持这样的假设，即循环miR-185水平可能是早期诊断肝纤维化的潜在候选指标，从而导致早期干预和逆转肝纤维化。

结果

二甲基亚硝胺（DMN）和胆管结扎（BDL）大鼠模型中循环miR-185上调

为了检测microRNA在肝纤维化发生和发展中的潜在作用，在Paraflo™平台（LC Sciences）和Sanger miRBase 18.0上使用microRNA微阵列分析生成了12份血液RNA样本的miRNA表达谱。(图1A). 结果表明，与对照组相比，早期纤维化大鼠（F1-F2）和晚期纤维化大鼠的miR-185显著增加。最有趣的是，在DMN诱导的肝纤维化大鼠模型中，循环miR-185诱导的程度取决于纤维化的阶段(图1B、C). 在BDL诱导的肝纤维化大鼠模型中也得到了类似的结果(图1D、E)，尽管DMN肝纤维化的miRNA相对水平的增加幅度小于BDL肝纤维化。这些结果表明，循环miR-185水平可能是肝纤维化发病和进展的潜在标志物。

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DMN和BDL诱导的肝纤维化大鼠血液miR-185水平。

(A类)DMN肝纤维化大鼠模型中不同变化的血液miRNA水平。使用microRNA阵列测定miRNA水平，并通过qRT-PCR进行验证。(B类)正常大鼠（NC，n=6）、DMN诱导的早期肝纤维化大鼠（n=10）和晚期肝纤维化大鼠血中miR-185水平（n=11）。该线表示每组的中值。使用2计算折叠变化-ΔΔCt方法。Mann-Whitney检验被用作统计学显著性检验。(C类)DMN诱导大鼠肝纤维化的组织学证实。(D类)正常大鼠（NC，n=6）、BDL诱导的早期肝纤维化大鼠（n=8）和晚期肝纤维化大鼠血中miR-185水平（n=11）。该线表示每组的中值。使用2计算折叠变化-ΔΔCt方法。采用Mann-Whitney检验作为统计显著性检验。(E类)BDL大鼠肝纤维化分期。HE:HE染色；masson染色；VG：VG染色。这些照片是用显微镜（200倍）拍摄的。(A类)对照组（F0）；(B类)1期纤维化（F1）；(C类)2期纤维化（F2）；D、 3期纤维化（F3）；E、 4期纤维化（F4）。显示了三次重复的代表性数据。

肝纤维化患者循环miR-185水平以阶段依赖性方式升高

为了检测肝纤维化患者中miR-185的水平是否有差异性改变，我们使用TaqMan qRT-PCR（定量实时PCR）测定了21名健康志愿者对照组、13名阴性对照组（F0）、20名HBV感染早期纤维化患者（F1-F2）和24名HBV染染晚期纤维化患者（F3-F4）中miR-85的水平化验。我们发现HBV相关纤维化患者的miR-185水平在早期纤维化中显著升高（fold-changes=1.65，第页 = 0.0001）和晚期纤维化（fold-changes=2.96，P（P） < 0.0001）比健康对照组(图2A). 晚期纤维化患者循环miR-185水平高于早期纤维化患者（fold-changes=1.79，P=0.0267）(图2A). 与健康对照组相比，F0期患者的血液miR-185水平没有明显变化(P（P） = 0.4460) (图2A). 结果表明，HBV感染肝纤维化患者的miR-185血药浓度升高。增长幅度取决于阶段。

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HBV感染肝纤维化患者血液和肝脏中miR-185表达升高。

(A类)HBV感染肝纤维化患者的血液miR-185水平。使用qRT-PCR测定miR-185的相对水平。使用2计算折叠变化-ΔΔCt方法。进行Mann-Whitney检验以确定统计显著性。HV，健康志愿者（n=21）；F0，无肝纤维化的患者（n=13）；F1-F2，早期纤维化患者（n=33）；F3-F4，晚期纤维化患者（n=11）。该线表示每组中的中值。(B类)肝纤维化患者肝miR-185表达升高位于肌成纤维细胞增殖和胶原沉积部位。现场使用患者活检标本进行miR-185-5p杂交（ISH）检测。显示了三次重复的代表性数据。

肝脏miR-185水平的增加与胶原沉积有关

为了检测miR-185在纤维化肝脏中的组织学分布，我们进行了一项现场人肝纤维化样品中miR185的杂交分析。结果表明，F4期肝纤维化患者的miR-185水平高于F0期肝纤维化(图2B).

循环miR-185水平与患者肝纤维化进展相关，但与HBV-DNA载量无关

为了确定miR-185水平是否与肝纤维化的进展相关，我们对57例接受肝活检的HBV感染患者的miR-85水平与肝纤维化分期之间的相关性进行了分析。这些患者表现出不同阶段的组织学特征性纤维化（F0=13、F1=12、F2=8、F3=8和F4=16）。通过线性回归和相关性分析，我们发现循环miR-185水平与纤维化分期呈正相关（Rho=0.542，第页 < 0.001;图3A).

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在HBV感染患者中，循环miR-185水平与肝纤维化进展相关，但与病毒载量无关。

(A类)HBV感染患者的循环miR-185水平与肝纤维化进展相关。通过肝活检和组织病理学特征确定纤维化分期。每个阶段的病例数，F0=13，F1=12，F2=8，F3=8，或F4=16。相关分析采用Spearman秩相关系数检验。(B类)HBV感染患者的循环miR-185水平与病毒载量无关。低DNA，病毒载量低的患者（n=11）；DNA含量高，病毒载量高的患者（n=13）。相关分析采用Spearman秩相关系数检验。

已经证明104循环HBV-DNA拷贝数/mL或更高与进展为肝硬化的显著风险相关18,19这表明循环血清HBV-DNA水平是肝硬化风险的预测因子。为了确定血液miR-185水平是否与HBV病毒载量相关，我们使用24例晚期（F3-4）肝纤维化HBV感染患者的样本进行了相关性分析。13名患者的病毒载量较高（≥104拷贝数/mL），11例病毒载量低（<104份/mL）。通过线性回归和相关性分析，我们发现循环miR-185水平与HBV病毒载量之间没有相关性（Rho=-0.075，第页 = 0.726;图3B).

应用循环miR-185水平诊断HBV感染患者肝纤维化

为了确定循环miR-185水平在HBV感染患者肝纤维化诊断中的潜力，我们进行了SD（Sprague-Dawley，受体-操作员特征）分析，以评估miR-185-水平在检测HBV感染肝纤维化进展中的作用，该队列由21名健康志愿者组成，早期纤维化20例，晚期纤维化24例。结果表明，ROC曲线下面积（AUC）为0.8500（95%CI:0.7274–0.9726，P（P） = 在早期肝纤维化中观察到miR-185水平。这可用于特异而敏感地将早期肝纤维化患者与健康组区分开来（特异性95.24%，敏感性75%，似然比15.75，图4A). 此外，晚期纤维化中miR-185水平的AUC为0.9395（95%CI:0.8725-1.006，P（P） < 0.0001），可用于区分晚期纤维化和健康志愿者，具有更高的特异性（95.24%）和敏感性（87.5%）（似然比18.37）(图4B). 结果表明，循环miR-185水平具有较高的特异性、敏感性和似然比，有助于诊断HBV感染患者的肝纤维化。

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血液miR-185水平可以区分(A类)HBV感染患者早期纤维化和(B类)健康志愿者中患有晚期纤维化的HBV感染患者。采用ROC分析进行鉴别分析。

miR-185过表达导致HSC细胞中COL1A1和a-SMA基因表达增加

我们发现SREBF1包含miR-185潜在靶向的位点(图5A). 为了验证这一发现，我们使用含有可能被miR-185靶向的SREBF1野生型或突变序列的构建物，对人类胚胎肾细胞系293T进行了荧光素酶报告基因检测(图5B). 结果表明，miR-185显著降低了野生型结构体的荧光素酶活性，但突变结构体没有降低(图5C). 结果证实SREBF1是miR-185的靶点。

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miR-185靶向SREBF1基因，改变HSC细胞中COL1A1和a-SMA mRNA和蛋白水平。

(A类)预测SREBF1基因中miR-185位点。(B类)miR-185和miR-185突变质粒的示意结构。(C类)miR-185阻断了SREBF1基因的表达，但miR-185-突变体没有阻断SREBF1的表达。将报告基因和miR-185模拟物及其抑制剂转染293T细胞。进行报告基因分析。(D类,E类)miR-185对COL1A1和a-SMA mRNA的影响(D类)和蛋白质(E类)HSC细胞中的水平。信使mRNA(D类)和蛋白质(E类)水平分别用qRT-PCR和Western blot测定。NC，阴性对照。模拟，miRNA-185模拟。抑制剂，miRNA-185抑制剂。显示了三次重复的代表性数据。

为了确定miR-185诱导表达对HSC细胞SREBF1、COL1A1和a-SMA表达的影响，我们测定了过表达miR-185-模拟物或其抑制剂时HSC细胞中SREBF1，COL1A1及a-SMA的水平。结果表明，miR-185模拟物降低了HSC细胞SREBF1 mRNA和蛋白水平(图5D、E). miR-185模拟物增加了HSC细胞中COL1A1 mRNA水平，但对a-SMA mRNA水平没有明显影响(图5D). miR-185模拟HSC细胞中COL1A1和a-SMA蛋白水平显著升高(图5E). 这些结果表明，miR-185降低了HSC细胞中SREBF1的表达，增加了COL1A1和a-SMA的表达。

讨论

肝纤维化是可逆的，这取决于病理分期和早期干预。早期诊断是肝纤维化早期干预的关键步骤。传统的组织病理学染色诊断需要活检，这是一种侵入性检查，不适合在短时间内评估治疗效果。需要一种替代方法来促进最佳的治疗后检测。在目前的研究中，我们使用大鼠肝纤维化模型和患者标本评估了循环miR-185的水平，将其作为一种潜在的生物标志物来预测肝纤维化的发生和发展。我们发现，miR-185在HBV相关肝纤维化患者和肝纤维化大鼠的血液样本中显著上调。我们的就地miR-185杂交分析表明，miR-185在晚期肝纤维化中位于胶原沉积区。miR-185水平的增加幅度与肝纤维化的进展阶段相关，但与HBV感染患者的不同病毒载量无关。miR-185水平具有较高的特异性、敏感性和似然比，可以在健康对照组中区分早期和晚期肝纤维化。此外，miR-185靶向SREBF1，并增加参与肝纤维化的COL1A1和a-SMA基因的表达。我们的数据证实，循环miR-185是肝纤维化的潜在生物标志物。由于我们收集的样本是HBV肝病患者的血液样本，miR-185也是HBV相关肝纤维化早期诊断的生物标志物。

在我们目前的研究中，我们发现miR-185的表达随着纤维化的加重而逐渐升高。有趣的是，文和韩，等。20发现HCC与miR-185的增加独立相关20肝纤维化和肝癌患者的.miR-185水平均升高。由于肝纤维化可以发展为HCC，我们推测在从肝纤维化过渡到HCC时miR185水平升高。在一些回顾性和前瞻性研究中，已经开发了几种基于血清的方法和成像方法来生物力学测量肝纤维化2这些非侵入性诊断方法在鉴别肝硬化患者方面表现出色；然而，他们不能准确区分F2和F3阶段的纤维化21肝活检仍是肝纤维化分级的金标准；然而，这种侵入性技术的死亡率为0.1–0.01%，并且存在严重并发症的风险22.最近的研究表明，循环miRNAs可能是肝脏疾病的潜在生物标记物23例如，血清中的miR-181b可能是肝硬化的潜在诊断生物标志物24与正常对照组相比，肝硬化患者血清中miR-19b的表达上调了4.3倍18.血清10个miRNAs的表达，如hsa-miR-4695-5p和hsa-miR-4651与未发生肝纤维化的肝脏相比，发现肝纤维化患者的肝纤维化表达上调。血清中这些miRNA的水平似乎与纤维化的分期不太可能相关25然而，目前还没有检测早期HBV相关肝纤维化的生物标记物。在当前研究中，我们首次研究了使用血液miR-185作为改善早期诊断性能指标的可行性。值得注意的是，使用ROC分析，miR-185水平可以高特异性（95.24%）、敏感性（75%）和似然比（15.75）区分早期HBV相关肝纤维化和健康对照(图4A). 与miR-185水平检测相关的诊断效率高于基于血清或成像的方法，后者在肝纤维化的早期诊断中表现出较低的特异性和敏感性2,21因此，循环miR-185水平可能是HBV相关肝纤维化早期诊断的潜在生物标志物。

研究表明，细胞miR-185水平与特定的临床病理特征有关，如血管浸润、细胞增殖和迁移26,27,28.现场杂交数据显示，miR-185在晚期肝纤维化过程中沉积在胶原沉积区，这表明miR-85可能在活化的HSC细胞中诱导表达。这与之前的研究一致。我们推测，血液中miR-185水平的增加可能是由于活化的HSC细胞释放miR-185的增加。

已经证明SREBF1抑制HSC激活29,30抑制SREBF1表达导致培养HSC中COL1A1和a-SMA水平增加31COL1A1和a-SMA的诱导是HSC活化和肝纤维化的标志。在目前的研究中，我们发现miR-185模拟物抑制了SREBF1的表达，并增加了HSC细胞中COL1A1和a-SMA的水平。因此，miR-185过度表达后抑制SREBF1表达可能是肝纤维化期间COL1A1和a-SMA水平升高的相关机制。这证实了miR-185是一种有希望的肝纤维化指标。

总之，miR-185水平不仅可以用于早期肝纤维化的诊断，而且可以作为治疗后随访监测和评估的潜在生物标志物。据我们所知，本研究首次探讨了使用外周血miR-185作为早期肝纤维化指标的可行性。我们的研究表明，miR-185水平可以作为早期肝纤维化临床病理监测的补充诊断方法。

材料和方法

患者和样本采集

从2010年9月至2012年5月期间入住福州军区总医院的57名表现出不同纤维化阶段的HBV感染患者中，共采集了78份血液样本。作为本研究的一部分，还招募了21名健康志愿者。所有受试者之前都被诊断为没有任何其他类型的肝病，并且没有酗酒史。肝活检后评估慢性HBV患者的HBV DNA定量测量以及其他临床和组织学特征。根据纤维化等级（F0、F1、F2、F3或F4，基于METAVIR纤维化分期系统）确定肝纤维化分期。57例患者中，13例处于F0期，20例处于F1-F2期（早期），24例处于F3-F4期（晚期）。从未出现肝纤维化的慢性HBV感染患者（阴性对照）中采集纤维化等级为F0的样本。表1显示了不同临床阶段HBV感染患者的特征。使用乙型肝炎病毒DNA定量诊断试剂盒（PCR-荧光探针）（Supbio Biotech，中国广州）测定HBV-DNA水平。该研究得到了中国长征医院伦理委员会的批准。这些方法是根据《赫尔辛基宣言》中规定的原则进行的。每位患者都获得了书面知情同意书。

表1

F0-、F1/F2-、F3/F4-期肝纤维化患者。
临床数据健康F0一层/二层三层/四层
性别（男/女）13/811/214/617/7
年龄（年）42.3 ± 4.328 ± 7.640.9 ± 3.546.3 ± 6.3
丙氨酸氨基转移酶（μg/l）12.6 ± 7.813.0 ± 8.142.3 ± 16.343.0 ± 11.3
AST（微克/升）15.6 ± 2.915.9 ± 2.663.7 ± 13.960.5 ± 18.3
白蛋白（g/dl）74.2 ± 3.166 ± 2.847.2 ± 10.132.4 ± 16.5
HBV-DNA（log10copies/ml）05.3 ± 1.14.8 ± 2.35.6 ± 1.7
抗病毒治疗不不不不
阶段（NC/F0/F1-F2/F3-4）21/0/0/0/0/13/0/0/0/0/20/00/0/0/24

动物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6-12周龄，体重200±30 g）来自中国科学院动物研究所（中国上海），并在SPF级设施中喂养。标准的鼠食和水可以随意使用。动物研究得到了第二军医大学（中国上海）伦理委员会的批准。这些方法是根据第二军医大学动物护理机构和伦理委员会的指导方针进行的。

动物模型和样品采集

对于DMN诱导的肝纤维化模型，42只雄性SD大鼠被随机分为五组。对照组注射生理盐水。其他组在每周一、周二和周三上午接受1%的DMN（i.p.），为期四周。

对于BDL诱导的肝纤维化模型，对34只雄性SD大鼠进行消毒和BDL处理。打开肝门部胆管后，胆管释放1厘米。两条线的上端和一条线的下端被结扎。结扎的胆管从中间切开，以避免胆管再通。手术后两天，动物接受青霉素注射，并正常喂养五周，直到实验完成。

高级病理学家对DMN诱导的肝纤维化动物模型进行了评估，并使用苏木精-伊红（H&E）染色、Van Gieson（VG）染色和Masson三色染色来分析和判断肝纤维化程度。

用3%戊巴比妥钠（腹腔注射，0.1 ml/100 g体重）麻醉小鼠后，收集肝组织。使用PAXgene采血管（BD，美国）从腹主动脉采集血样（2.5 ml），并在室温下上下旋转混合至少两小时。在−20°C下储存24小时后，将血液样本在−80°C下储存，直到需要为止。12只DMN诱导的肝纤维化大鼠的血液样本用于Paraflo™平台（LC Sciences）和Sanger miRBase 18.0上的miRNAs微阵列分析。

RNA制备和qRT-PCR

全血RNA按照之前公布的方案提取32使用PAXgene血RNA管（BD，美国）。使用NanoDrop仪器评估RNA的质量和数量。一个A260/一个280比率约为2.0，A260/一个230大于1.5的比率被认为是优质RNA的指标。通过变性凝胶电泳检查18S和28S核糖体RNA条带，进一步验证了RNA的完整性。使用TaqManq RT-PCR分析测定血液中miRNA的水平。所有试剂、引物和探针均购自Applied Bio-systems（中国上海）。使用TaqManq RT-PCR测定法测定血液中miRNA的水平。

根据制造商的方案，使用RNeasy迷你试剂盒（中国上海恰根）提取细胞RNA样本。使用SYBR GREEN（应用生物系统，中国上海）的qRT-PCR测定了colla1、α-sma和SREBF1基因的相对水平。U6基因被用作内部参照物。用于扩增这些基因的引物列于表2.

表2

qRT-PCR分析的基因特异性引物。
基因引物序列（5′-3′）产品T型米(o（o）C）
列1a1意义：GCTCGTGGATTGCCTGGAACAG235个基点55
反义：CACCGACAGCACCATCGTTACC  
α-平滑肌肌动蛋白意义：GCCACTGCTTCCTCCTT136个基点55
反义：CCGCCGACTCACTTCCAATGAA  
SREBF1意义：AGGAGAACCTGCGAAG214个基点55
反义：TCACTGCCACCACTGCTGCT  
6号机组意义：CTCGCTTCGGCAGCACACATACT  
反义：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC  

使用Applied Bio-Systems 7900HT热循环器，在以下条件下进行定量实时PCR：95°C 10分钟，40次95°C循环15秒，60°C 60秒。使用SDS软件v2.4（Applied Bio-Systems，美国）计算循环阈值（CT）。使用2-ΔΔCt方法。

现场杂交（ISH）分析

根据制造商的说明，使用miR-185-5p锁定核酸探针（5′-地高辛素-UGGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3′-地高辛素）和microRNA ISH优化试剂盒（Exiqon，Vedbaek，Denmark）进行ISH。简言之，脱蜡阵列在37°C下与15 mg/mL蛋白酶K孵育8分钟。脱水后，用40 nmol/L miR-185-5p探针在50°C下孵育120分钟，然后用5倍标准柠檬酸盐、1倍标准柠檬酸盐和0.2倍标准柠檬主义盐缓冲液在50℃下进行严格清洗°C，最后用地高辛封闭试剂培养（德国曼海姆罗氏）。用BX51荧光显微镜（Olympus，Japan）检测信号。

蛋白质印迹分析

用冷PBS洗涤三次后，用RIPA细胞裂解缓冲液收集HSC细胞样品。用考马斯蓝光度法测定蛋白质浓度。蛋白质（15–30μg/lane）在10%SDS–聚丙烯酰胺电泳凝胶上使用10%堆积凝胶进行分解，然后电转移到硝化纤维素膜（Millopore，中国上海）。用封闭缓冲液（中国上海三工）培养细胞膜，然后在TBST缓冲液（Tris-HCl，pH 7）中培养一级抗体（抗COL1A1，cat#ab90395；抗a-SMA，cat#ab5694；抗-SREBF1，cat＃ab3259，abcam，中国上海）。4–7.6，25毫米；氯化钠0.88%；氯化钾0.02%；吐温20 0.05%）2 h。用TBST缓冲液洗涤后，添加过氧化物酶结合的次级IgG，并在TBST缓冲溶液中培养2 h。在用TBST缓冲器洗涤后，用化学发光试剂（加州圣克鲁斯，美国）覆盖膜并培养，然后暴露于X射线胶片（柯达，中国上海）。在可视化之前，使用柯达胶片冲洗器冲洗胶片。

质粒构建、细胞转染和报告基因检测

预测与miRNAs相互作用的SREBF1的3′UTR片段通过PCR从人类基因组DNA中扩增并插入pMIR报告载体（Applied Biosystems），使用Mlu公司我和Hin公司荧光素酶终止密码子下游的dIII位点。

在转染和荧光素酶报告实验中，人胚胎肾细胞系293T在37°C DMEM培养基中的10%FBS中生长，在含5%CO的湿空气中生长2用脂质体转染96个平板中的细胞®2000（Life Technologies），根据制造商协议。在每个孔中使用0.2μg萤火虫荧光素酶报告载体和0.01μg含有Renilla荧光素酶、pRL-CMV（Promega）或100 nM miRNA寡核苷酸的对照载体进行转染。在转染48 h后，使用双荧光素酶分析（Promega）连续测定萤火虫和Renilla荧光素酶活性。

miRNA模拟物（ago-miR-185-5p）、抑制剂（antago-miR-185-5p。用50 nM的模拟物、抑制剂和阴性对照溶液转染细胞。按照制造商的说明使用Fu GENE HD转染剂（美国Promega）。

统计分析

所有值均表示为至少三个独立实验的平均值±标准偏差（SD）。对于qRT-PCR获得的数据，采用Mann-Whitney非配对检验对肝纤维化样品和对照组进行比较。建立受体-操作员特征（ROC）曲线，以评估外周血miRNA水平用于区分HBV纤维化患者和健康志愿者。ROC曲线下面积（AUC）被用作评估所选miRNAs水平诊断性能的准确性指标。根据斯皮尔曼秩相关系数确定相关性。全部第页-价值观是双向的，并且第页 < 0.05被认为具有统计学意义。所有统计计算均使用SPSS 17.0（IBM，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行。图形是使用GraphPad Prism 5.0（GraphPad-Software，Inc.，CA，USA）生成的。

其他信息

如何引用这篇文章：李，B.-B等。循环miR-185水平升高作为HBV相关肝纤维化早期诊断的生物标志物的潜力。科学。代表。 6, 34157; doi:10.1038/srep34157（2016）。

致谢

本研究得到了上海市科技攻关重点项目（10142201000号和124119a4100号）、国家自然科学基金（10972235号和11272342号赠款授予朱丽萍；30570836号和81370553号赠款授予余洪云）的资助。

脚注

作者贡献作者：B.-B.L.、X.X.、D.-g.C.和g.-L.Y.负责进行实验；L.Z.、C.-q.W.、B.-B.L.和G.-q.J.主要设计了实验；B.-d.Q.、C.C.和H.-j.W.任务是分析数据；B.-h.L.、S.L.、W.N.、D.-k.Y.和h.-L.Y.撰写了论文；D.-l.l.、Z.-y.Z.和D.T.主要采集人类血液样本，C.-y.X.、H.-m.l.，J.H.、W.-J.Z.和H.-y.y.负责通过光学显微镜进行活组织学检查，并与肝纤维化评分进行比较。所有这些作者都阅读并批准了最终的手稿。

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