p14/MP1支架复合体的晶体结构：一对孪生夫妇如何将丝裂原活化蛋白激酶信号连接到晚期内体

摘要

细胞外信号从质膜传递到特定细胞内位点的过程是细胞调节的一个基本特征。存在影响信号酶在细胞中何时何地发挥作用的调节机制。支架蛋白和衔接蛋白的鉴定有助于将酶招募到局部信号复合物中，为信号转导的时空协调提供了一个概念框架。尽管它们总体上很重要，但对于支架蛋白和衔接蛋白用于协调信号实体和保证细胞外信号转化为特定生物反应的分子机制知之甚少(1——三).

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联是一个被广泛研究的信号通路，它是许多细胞过程调控的基础(4). 这种酶级联反应的基本信号单位是一个三激酶模块，允许通过连续的磷酸化事件将细胞外信号传递给特定的靶蛋白：MAPK激酶激活MAPK激酶，而MAPK激酶反过来激活MAPK，最终能够激活多个靶蛋白。有趣的是，特定MAPK的激活产生不同的生物输出。因此，单个MAPK通路获得了复杂的调控机制，主要依赖于某些支架和衔接蛋白(2，5，6).

支架蛋白的原型是Ste5蛋白，它对交配信息素反应至关重要酿酒酵母.Ste5结合Ste11–Ste7–Fus3 MAPK级联的所有三个成员，从而促进三激酶模块内的信号传输。此外，它使Ste11–Ste7–Fus3复合物靠近质膜，允许膜相关上游调节器激活(7，8). 虽然MAPK级联的一般结构在真核生物进化过程中保持良好，但在高等真核生物中不存在Ste5p。

高等真核生物使用不同的支架复合物。已知Ras激酶抑制剂（KSR）、KSR连接增强子（CNK）和MAPK/ERK激酶1（MEK1）伴侣（MP1）在细胞外调节激酶（ERK）级联中调节和指定信号转导(9，10). ERK级联是高等真核生物中四种不同的MAPK通路之一(4)并且主要参与细胞增殖、分化和存活的调节，这取决于细胞外刺激(6). 其三激酶模块由Raf、MEK和ERK组成。三种Raf（Raf-1、B-Raf和A-Raf）、两种MEK（MEK1和MEK2）和两种ERK（ERK1和ERK2）亚型的存在增加了哺乳动物细胞的复杂性。KSR蛋白结合了支架蛋白和衔接蛋白的特性。当Ras在质膜上激活时，它们调节Ras–MEK–ERK模块的组装和激活。此外，KSR与控制KSR–MAPK信号复合物膜附着的几个调节蛋白相互作用(11——13). MP1支架最初通过其与MEK1富含脯氨酸区域结合并激活ERK1而非ERK2信号的能力进行鉴定。因此，有人提出MP1通过特异性介导MEK1–ERK1相互作用促进ERK信号传导(14).

决定支架蛋白定位的衔接蛋白的存在为调节MAPK级联的效率和特异性提供了额外的灵活性(5). 如Teis所示等。(16)，p14充当MP1的内体适配器。p14需要将MP1连接到晚期内体，因为p14的缺失导致MP1在细胞质中的定位错误，并导致ERK信号缺陷(15，16). 有趣的是，只有内体ERK激活受到p14或MP1的短干扰RNA的影响(16). 相反，p14/MP1复合物对于质膜上MAPK信号的初始阶段似乎是不必要的，这需要KSR(12). 这些发现提出了一个有趣的可能性，即KSR在质膜上组装一个信号复合物，并产生一个ERK信号，该信号不同于来自内体的p14/MP1-协调ERK信号(17). 然而，ERK信号传导的分子机制仍有待阐明。

在这里，我们以原子细节展示了p14和MP1如何形成适配器/支架复合体，以及该复合体如何与晚期内体相连。利用特异性突变，我们鉴定了p14的内胚体适配器基序，该基序决定了p14/MP1异二聚体相对于内胚体膜的相对取向。

材料和方法

克隆、表达和蛋白质纯化。对于双顺反子蛋白表达，通过PCR扩增编码小鼠p14和MP1的DNA序列，并将其分别亚克隆到pET28（Novagen）中，其中MP1表达为C末端His-tag蛋白。将MP1结构体及其核糖体结合位点亚克隆到表达p14的pET28载体中。由此产生的双顺反子质粒pET-p14MP1允许p14和MP1以相当相等的数量共存。质粒pET-p14MP1被转化为大肠杆菌菌株BL21（DE3）。细胞在37°C LB培养基中生长并在OD诱导₆₀₀=0.6，添加1 mM异丙基β-d日-硫代半乳糖苷。蛋白质诱导在37°C下持续一夜。培养物通过离心收集，再悬浮在50 mM磷酸钠/磷酸钾（pH 7.5）/300 mM氯化钠中，然后通过冷冻-解冻和随后在冰上的超声处理进行溶解。用来自齐亚根的三醋酸硝基苯镍树脂通过亲和层析纯化蛋白质复合物。Superdex 75柱（Amersham Pharmacia Biosciences）有助于进一步抛光，并将蛋白质缓冲液调节为10 mM Hepes（pH 7.5）/150 mM NaCl/2 mM 2-巯基乙醇。结晶前，使用Centripreps（YM-3，Amicon）通过超滤将p14/MP1浓缩至7 mg/ml。

p14Δb3和p14b3*突变体是通过使用PCR诱变方案产生的。从Invitrogen亚克隆到PCR-blunt载体的钝端PCR产物。p14和MP1的Xpress标记突变体的生成与相应WT cDNA的生成相同(15，16). 按照制造商的建议，通过使用Lipofectamine Plus系统（Invitrogen）将不同的构建物转染细胞。

结晶和结构溶液。使用坐滴蒸汽扩散法在19°C下进行结晶。获得衍射良好晶体的关键是硒代蛋氨酸取代蛋白的使用和结晶试验的纳升设置。通过将200 nl蛋白质与100 nl含有25%（wt/vol）聚乙二醇4000、0.1 M Tris（pH 8.5）和0.2 M MgCl的结晶溶液混合，在19°C的静滴中生长p14/MP1晶体₂在储液体积为100μl的Greiner平板上进行晶体试验。一夜之间出现了尺寸为50×50×200μm的正交晶体^三对于低温测量，晶体从结晶滴转移到提供15%2-甲基-2,4-戊二醇作为低温保护剂的母液中，并在100-K氮气流中快速冷冻。所有晶体都属于太空群P（P）2₁2₁2₁带有单元格常数一= 50.1 Å,b条=62.5º，以及c（c）=73.0º，对应于不对称单元中一个p14/MP1异二聚体的33%溶剂含量。硒代蛋氨酸衍生物的单一异常衍射数据是在汉堡德国电子同步加速器（束线BW6）收集的。衍射数据通过程序进行处理和缩放丹麦人和鳞片包装(18). 随后，使用货架使我们能够确定六个理论硒位点中的四个。重原子参数的精细化和相位计算是用锋利的(19)溶剂压平所罗门(20). 采用最大似然算法进行了能量约束晶体学精细化中国国家科学院(21)使用Engh和Huber的蛋白质参数(22). 使用程序进行优化、模型重建o个(23)通过刚体、位置和后来的方式，水的并入顺利进行B类-因子优化。使用模拟退火复合省略图检查整个结构。一些末端蛋白片段在这些图谱中几乎看不到，因此从模型中被忽略。在添加溶剂分子后，精制收敛于R（右）21.3%的系数(R（右）_自由的= 25.9%). 表1总结了数据收集、阶段划分和细化统计数据，发布为支持信息在PNAS网站上。所有图形演示都是使用程序准备的墨尔本(24),光栅三d日(25)、和恐龙(网址：www.dino3d.org). 分子表面和静电势由以下公式计算毫秒(26)和蜂蜜酒(27)分别是。

共免疫沉淀、下拉实验和免疫荧光。如先前研究所述，使用相应抗体进行的实验(15，16).

磷酸化反应。将HeLa细胞血清饥饿过夜，并用表皮生长因子（EGF）刺激10分钟。按所述生成总细胞裂解物(16). 磷酸化反应包含40μl来自EGF刺激的HeLa细胞的细胞裂解液和0、20、100、500和2000 pg纯化的p14/MP1复合物、激酶反应缓冲液（50 mM Hepes，pH 7.4/10 mM MgCl₂/1 mM DTT）和5μM ATP，最终体积为60μl，在30°C下培养30分钟。对总反应进行SDS/PAGE，并用指示的抗体进行探测。

BHK细胞的内切体纯化。用PBS洗涤BHK（幼仓鼠肾）细胞三次。细胞以200×克将细胞颗粒在HB缓冲液（250 mM蔗糖/3 mM咪唑，pH 7.4/1 mM EDTA/蛋白酶抑制剂）中重新缓冲5分钟，然后再次以2500 rpm的速度造粒10分钟。将细胞颗粒重新悬浮在HB缓冲器中，并通过四次通过22号针进行均质。核后上清液是通过在4°C下以2500 rpm离心15分钟获得的。将核后上清液在62%蔗糖中以1:1.2稀释，装载在Beckman SW41管的底部，并用4ml 35%蔗糖和3ml 25%蔗糖覆盖。通过10万倍离心，在不同组分中获得早期和晚期内体组分克在4°C下持续3小时。

生物传感器测量。定量测定纯化的p14蛋白（纯化自大肠杆菌作为GST融合蛋白）和MP1（从Sf9昆虫细胞纯化为His-tagged蛋白），应用表面等离子体共振技术。所有生物传感器测量均在25°C的BIAcore-X系统（BIAcore，Uppsala）上进行。为此，生物传感器芯片CM5首先通过共价衍生法负载抗GST抗体。以10μl/min的流速将纯化的GST标记的p14注入生物传感器缓冲液（10 mM Hepes，pH 7.4/150 mM NaCl/0.01%Nonide P-40）中，导致约600–650个响应单位的沉积。接下来，以10μl/min的流速以增加的浓度（10–250 nM）注射纯化的MP1。减去参考细胞中测得的非特定结合值。MP1与p14结合的动力学参数的评估是通过使用双评估 ^2.1分析软件。结合常数由微分结合曲线导出，假设为A+B⇄AB缔合类型。

结果和讨论

重组p14/MP1复合物的生化特性。全长MP1或p14的分离表达和纯化大肠杆菌蛋白质含量低，不溶于水（溶解度<1mg/ml）。用双顺反子载体共表达这两种蛋白质，使我们能够大量高浓度（>15 mg/ml）纯化生理复合物。His-tagging两种成分中的一种可以通过Ni-亲和色谱分离p14/MP1复合物。通过凝胶过滤色谱进一步抛光。均相性和1:1化学计量通过SDS/PAGE进行验证(图1一个)和MS（未显示数据）。利用Biacore技术研究了p14/MP1复合物的实时稳定性。将GST-p14固定在涂有抗GST抗体的CM5芯片上。在10–250 nM的浓度范围内注入纯化的MP1(图1B类). MP1与GST-p14结合的表观结合速率常数为4.68×10⁴M（M）^–1·秒^–1，解离速率常数为5.97×10^–4秒^–1，从而导致K（K）_d日12.8 nM，反映了p14和MP1的高亲和力关联。

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图1。

体外重组p14/MP1复合物的性质。(一个)纯化的p14/MP1复合物的SDS/PAGE。(B类)MP1与p14相关性的定量生物传感器分析。用GST标记的p14加载CM5传感器芯片，并以指示浓度（10–250 nM）注射纯化的MP1。(C类)重组p14/MP1复合物增强ERK1/2活化（磷酸化）。将更多纯化的p14/MP1添加到来自EGF刺激的HeLa细胞的细胞裂解液中，并在30°C下孵育30分钟。用SDS/PAGE分离细胞裂解液，并用指示的抗体（α-）进行探测。(天)重组p14/MP1以浓度依赖性的方式结合内膜。(上部)p14/MP1复合物和GST与缓冲液、细胞质或总细胞膜一起孵育。只有p14/MP1与总细胞膜相匹配。(下部)p14/MP1复合物和GST与越来越多的纯化内体孵育。只有p14/MP1能够与纯化的内体相匹配。输入（100000×之前克用SDS/PAGE分离膜丸和上清液，并用指示的抗体进行检测。

我们之前已经证明p14和MP1是MAPK信号传导所必需的，并协同增强ERK1/2激活(16). 因此，我们接下来测试纯化的p14/MP1是否会增强细胞裂解液中ERK1/2的活化。随着p14/MP1复合物浓度的增加，EGF刺激HeLa细胞的细胞裂解液中ERK1/2的活化增强(图1C类). p14/MP1生物学功能的另一个基本特征是其内体定位(15，16). 因此，我们接下来研究了重组p14/MP1复合物是否会与细胞膜结合在体外(图1天). p14/MP1复合物和GST，我们将其用作具有相似大小和分子量的对照，与缓冲液、细胞质和总细胞膜一起培养。10万倍高速离心克用于制备膜和膜结合蛋白颗粒。无论是与缓冲液、细胞液还是膜一起培养，上清液中始终存在GST。单独用缓冲液或细胞质孵育p14/MP1不会导致对抗，而用全细胞膜孵育p14/MP1则能有效对抗细胞膜。为了证实膜结合的特异性，我们使用了纯化的内体(15)而不是整个细胞膜。p14/MP1复合物能有效地与内体进行相互作用，而GST仅在100000×克离心。此外，p14/MP1复合物与内体的配对依赖于结合试验中存在的内体数量。总之，p14和MP1形成一种紧密的复合物，能够增强细胞裂解液中ERK1/2的活化并与内胚层膜结合。这些结果表明，分离的重组p14/MP1复合物反映了复合物的性质体内并且应当允许生物相关结构的重建。

p14和MP1的结构。适用于x射线衍射的晶体是通过蒸汽扩散法获得的，但仅采用纳升装置。砖状晶体属于太空群P（P）2₁2₁2₁，单位电池常数为一= 50.1 Å,b条=62.5º，以及c（c）= 73.0 Å. 提纯并结晶了硒代蛋氨酸取代的p14/MP1配合物，通过单波长反常色散确定了其结构。实验电子密度图质量很好(图2一个)并使我们能够构建除少数末端残基之外的整个模型。该模型被细化为晶体学模型R（右）21.3%的系数和R（右）因子为25.9%，分辨率为1.9？，显示出良好的立体化学（见表1）。

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图2。

p14/MP1的结构。(一个)用最终模型覆盖p14/MP1复合物代表区域的实验电子密度图。该图的计算分辨率为1.9°，等高线为1.2σ。(B类)单个MP1（绿色）和p14（白色）单体的带状图。用色阶来说明多肽的过程。给出了所有二级结构元素和端子。(C类)MP1（绿色）和p14（白色）叠加的立体视图。分歧最大的区域(左侧)和一些突出的表面口袋(赖特)已标记。(天)MP1为绿色，p14为白色的异二聚体的带状图。根据组成的螺旋层，可以区分p14/MP1复合物的两个不同面，即以正交方式呈现的两个和四个螺旋面。给出了可能的蛋白质-蛋白质相互作用位点的命名和位置。

p14蛋白折叠成一个紧密的结构域，由一个中心的五链反平行β片组成，其一侧由α-螺旋b夹住，另一侧由末端螺旋a和c夹住(图2B类). 连接αb和β3的回路的电子密度没有得到很好的定义，该b3回路（根据连接的二级结构元素的回路命名法）应被视为非常灵活。此外，p14的七个C末端残基在电子密度图中无法追踪。MP1获得围绕具有相同链序2 1 5 4 3的中心五链β-片构建的同源折叠。末端螺旋a和c位于板材的一侧，而α螺旋b和b2共同等于p14螺旋b和3₁₀-螺旋b1屏蔽β片的另一侧。除了七个C末端残基外，整个MP1结构都由电子密度很好地确定。在这两种蛋白质中可以区分几个潜在的蛋白结合囊。两个凹槽位于螺旋线b的两侧(图2C类). 2b袋由螺旋线b的N末端、环2b和34排列，而b3袋则围绕螺旋线b中心部分、环12和45排列。第三个口袋，ac口袋，由末端螺旋A和c形成。

这两种蛋白质都采用了惊人的同源结构域结构，具有非常相似的形状、尺寸和二级结构元素的相对取向(图2C类). 最小平方叠加对齐95 C^α均方根偏差为1.82℃的原子。发散的第一个区域包括N和C端。在MP1中，螺旋C的C端延伸折叠为螺旋段，进一步穿过并延伸到弯曲β-板的边缘。在p14中，相应的片段指向远离蛋白质体的方向，突出到周围。此外，p14的N末端接近其C末端，从而用Met-1和Leu-2延伸ac囊的疏水表面，这是MP1所没有的特征。环b3代表第二个发散区域，由p14中的残基57–70和MP1中的59–68组成。在这两种情况下，这个环都不与蛋白质体发生任何相互作用，因此看起来相当灵活。它突入蛋白质外围，但方向不同。第三发散区也位于螺旋线b层侧，并且由螺旋线b的N末端及其前环2b组成。在p14中，可以观察到一个宽的疏水性2b囊，它在MP1中被螺旋b1和不同折叠环2b部分阻断。此外，在MP1中，相应2b囊的剩余部分由若干大块残基填充，例如His-43、Phe-49、Tyr-75和Tyr-78，它们在p14中具有较小的对应物。

第14页/MP1复合体是一对几乎对称的双胞胎。在p14/MP1复合体中，域显示出广泛的相互作用表面，允许高亲和力结合。如所示图2天，该复合物呈现出惊人的对称外观，在蛋白质数据库中没有结构同源物。p14和MP1结合形成一个连续的、反向平行的10股β-片，链序为2 1 5 4 3 3*4*5*1*2*（星号表示MP1）。内对β链，即3和3*，通过九个主链氢键相互作用。中央β-片的一侧被两个双螺旋束ac和a*c*（四螺旋侧）覆盖，而另一侧被bb*双螺旋束（双螺旋侧）所覆盖。b螺旋通过几个相互缠绕的疏水残基的拉链式排列相互耦合，这些疏水残基包括Ala-59、Tyr-56、Ile-52、Ile-48、Phe-49*、Thr-52*、Phe-53*、Ala-56*、Gln-59*（脂肪族部分）和Leu-63*。该疏水簇被β链3和3*的几个残基延伸，包括Leu-69、Ile-72、Met-74、Cys-76、Ile-11*、Cys-33*和Tyr-75*，从而在异二聚体的中心形成一个显著的疏水核，p14和MP1的贡献几乎相等。此外，MP1的环路b3*正好适合p14的互补形2b口袋。在这里，两个MP1亮氨酸，Leu-63*和Leu-65*，以锁定键的方式与p14残基Ile-48、Ile-52、Met-74、Val-81、Ile-83和Tyr-94相互作用。β-片的另一面，即四螺旋面，是极性的。在这方面，异二聚体的稳定是通过在Asp-75–Lys-69*、Lys-70–Asn-76*、Asp-67–Thr-77*和Glu-78–Ser-66*之间形成的几个氢键和盐桥来实现的。后两种相互作用似乎密封了混合β-表33*的两侧。在四螺旋侧的中心，一个很深的极地峡谷贯穿了整个异二聚体，沿着MP1的β链3*延伸。该中线峡谷的壁上排列着几个基本残基（Arg-80、Lys-105、Lys-70、Lys-69*、Arg-85*和Lys-108*）和几个具有H供体基团的残基（Gln-109、Asn-76*、Ser-70*、Tyr-74*、Gln-79*、Thr-100*和Ser-105*）。

使用100 mM磷酸盐作为结晶添加剂，我们获得了具有一些有趣特征的第二种晶体形式。在这里，p14的柔性b3环由电子密度清楚地定义，并且如其平均晶体热运动因子所示是相当刚性的（见图5一个，发布为支持信息在PNAS网站上）。最有趣的是，环b3的构象与先前确定的结构不同。它朝向MP1弯曲，并与MP1 2b*袋的一些残留物接触。此外，其侧链之一Phe-64向外伸入相邻p14分子的疏水性ac囊中，在那里与Tyr-114发生环叠相互作用（见图5B类). 通过溶剂暴露的疏水残基获得不同构象和建立晶体接触的能力突出了p14环b3介导蛋白质-蛋白质相互作用的潜力。

MP1的表面性质/p14指向几个潜在的蛋白质结合位点。为了确定与其他分子相互作用的潜在位点，我们分析了p14/MP1异二聚体的晶体接触、静电特性和守恒模式(图3). p14和MP1都有许多暴露在溶剂中的非极性残基，它们在异二聚体的两个和四个螺旋侧形成独特的疏水囊。

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图3。

p14/MP1复合物的表面性质。四螺旋面(上部)和双螺旋边(下部)如图所示。左侧显示异二聚体的相对取向，而居中和赖特显示相应取向的p14/MP1分子表面。(居中)用计算的保护模式铝2有限公司(29)绘制在表面上，品红色表示最保守的区域，绿色表示最不保守的区域。(赖特)静电势计算方法蜂蜜酒映射到p14/MP1曲面上。红色表示带负电荷，蓝色表示带正电荷的区域。

在四螺旋侧，只能观察到一个疏水囊，对应于p14 ac囊，即螺旋a和c的界面处。排在疏水囊中的残留物在p14家族中高度保守，因此p14ac囊应被视为潜在的蛋白结合囊。始终，这个口袋也参与建立晶体接触，结合分子邻居的苯丙氨酸残基（见图5B类). 四螺旋侧的第二个显著特征是一个显著的电正性通道，在p14/MP1中线穿透整个异二聚体。一些主要负责该通道基本呈现的残基是严格保守的，而对于其他残基，则允许保守交换，这不会改变整体静电表面电位。因此，电正性通道似乎是p14/MP1复合物的一个共同特征，可能具有功能重要性。值得注意的是，MP1在四螺旋侧表现出相当弱的保守性模式，这表明MP1的这一表面在与靶蛋白的结合中只起到很小的作用。

相反，MP1在双螺旋侧有一个潜在的蛋白质相互作用斑块。几个高度保守的非极性残基聚集在构成b3*口袋的不变DG基序周围。该袋的疏水部分由Val-30*、Pro-31*、Val-32*、Val-120*和Val-121*构成。在这两种晶体形式中，该部分被来源于对称相关p14分子的Tyr-37侧链占据（图5B类). 此外，该酪氨酸的OH功能与Asp-26的羧酸基相互作用，该羧酸基由MP1高度不变的DG基序保持。在双螺旋侧，p14的环l2下方有一个额外的显著疏水囊。由于DG基序（Glu-28–Gly-29）的特殊骨架构象，该环接近并沿着螺旋线b运行。封闭螺旋环填料通过几个范德华相互作用而稳定，并导致p14疏水核的开放。因此，残基Met-1、Leu-2、Leu-7、Leu-11、Leue-24、Leu-32、Val-86、Leu-89、Pro-112和Leu-115形成一个巨大的疏水性b3囊，几个非极性残基完全暴露在溶剂中。这些残基中的大多数构成了p14中最高度保守的氨基酸序列。因此，p14的b3口袋可能代表蛋白质结合表面。值得注意的是，序列和结构比较进一步证明了2b和b3口袋在介导蛋白质-蛋白质相互作用中的重要性（有关详细信息，请参阅支持结果和讨论和图6，发布为支持信息在PNAS网站上）。虽然p14和MP1的2b囊被用于异二聚体的形成，但相应的b3囊已为结合伙伴蛋白做好准备(图2天).

p14。p14/MP1复合体的结构分析表明，p14和MP1的b3环在定义各自的相互作用伙伴方面起着重要作用。因此，我们通过在p14中产生特定突变来研究这个环路的功能。环b3被删除（p14Δb3:p14氨基酸残基57-70被Gly-Ala取代）或与MP1的相应b3*环交换（p14b3*：p14氨基酸残留物57-70替换为MP1氨基酸残基59-68）。为了研究这些突变的影响，将Xpress标记的p14（Xp14）突变体与myc标记的MP1（MP1-myc）在HeLa细胞中共表达(图4).

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图4。

影响p14的b3环的突变改变了p14/MP1的亚细胞分布。(一个)Xpress标记的WT p14、p14Δb3和p14b3*蛋白与MP1-myc共表达。随后，使用抗Xpress和抗myc抗体对细胞进行间接免疫荧光分析。Xp14（红色）和MP1-myc（绿色）在晚期内体（黄色）上共定位。Xp14Δb3定位于细胞质中，与晚期内体上的MP1没有共定位。Xp14b3*被发现在晚期内体上与MP1-myc共定位，但也部分在细胞质中。(B类)Xp14、Xp14Δb3和Xp14b3*与MP1-myc或myc标记的p14共表达。用抗Xpress抗体对Xpress标记的蛋白质进行免疫沉淀（IP）。为了证明MP1-myc或myc-p14的表达相等，用抗myc抗体检测细胞裂解物（输入）。用抗myc（MP1和p14）抗体探测p14免疫沉淀物，检测到Xp14与MP1-myc（通道1）和Xp14b3*与myc-p14（通道6）的相互作用。

免疫荧光和共焦图像分析用于确定p14突变体的亚细胞位置。Xp14确实与MP1-myc在81%的晚期内体细胞中共定位(n个= 100). 只有在Xp14和MP1-myc强烈过度表达的细胞中，细胞质中才发现这两种蛋白质。值得注意的是，Xp14Δb3从未在晚期内体上与MP1-myc共定位，并且总是在细胞质中观察到(n个= 100). 显然，需要环b3来确定p14的内胚体定位。然而，在28%的p14Δb3表达细胞中(n个=100），在未与MP1-myc共定位的亚细胞蛋白聚集体中发现突变蛋白。此外，表达Xp14Δb3的量不可能等于Xp14或Xp14b3*蛋白水平(图4B类). 这些结果表明，细胞不能耐受高水平的细胞质错误定位的Xp14Δb3蛋白。

令人惊讶的是，Xp14b3*突变体显示64%的内胚体定位(n个=100）所有Xp14b3*-阳性细胞。根据p14/MP1晶体结构，MP1的环b3对与p14相互作用至关重要。因此，Xp14b3*突变体可能已获得与内源性p14相互作用的能力，形成Xp14b 3*/p14假同二聚体。为了验证这一预测，使用联合免疫沉淀实验研究了Xp14、Xp14Δb3和Xp14b3*与MP1-myc或p14-myc的相互作用。MP1-myc只有在Xp14存在时才能共同免疫沉淀(图4，泳道1），而Xp14Δb3和Xp14b3*突变体与MP1没有显示出显著的相互作用（泳道2和3）。有趣的是，p14-myc仅由Xp14b3*（通道6）突变体共同免疫沉淀，而不是由Xp14（通道4）或Xp14Δb3（通道5）共同免疫沉淀。这些发现证实了p14b3*突变体确实能够形成p14b3/p14二聚体，证明了MP1环b3在建立和稳定与p14的相互作用方面的重要作用。综合以上结果，突变分析表明，p14的b3环需要将p14靶向晚期内体，MP1的b3*环定义了MP1与p14的相互作用。

第14页/MP1作为MAPK支架复合体锚定在晚期内分体上。p14/MP1-MAPK支架复合体的内体定位对于EGF模拟ERK级联中的有效信号传递至关重要。尽管MP1作为相应的支架蛋白，但p14作为将MP1–MAPK模块定位到内体的适配器发挥作用(16). 目前的结构和生化数据允许提出一个模型：p14和MP1如何在胞内MAPK信号转导中协作。

无论大小如何，p14衔接蛋白上都有几个潜在的蛋白结合位点。突变分析表明其b3环作为内体适配器基序的重要性。该环可能通过与迄今未知的靶蛋白的特异性相互作用，将复合体靶向晚期内体。需要进一步努力确定这样一个伙伴。有趣的是，p14的ac囊和带正电荷的中线峡谷与环b3位于异二聚体的同一侧。因此，很容易推测后两种特征有助于确定p14/MP1复合物相对于内胚层膜的定位。我们认为异二聚体的四螺旋侧将面对内胚层膜，从而为胞质伴侣提供异二聚物的双螺旋侧的通路。尤其是表面暴露的MP1残留物的保护模式支持这一观点。虽然四螺旋侧表现出相当弱的守恒性，但双螺旋侧则更守恒。在这里，一个潜在的蛋白质结合位点是围绕高度保守的DG基序组织的。相应的表面贴片的特征是由疏水残基包围的高电负性区域。值得注意的是，所有MAPK都使用一个负电荷区域，即所谓的保守对接域（ERK2基序序列：LEQYYDPTDEPVA）来与底物、调节因子和活化因子相互作用。研究表明，MAPK的活化子如MEK1/2通过一个带正电荷的区域，即所谓的对接位点（MEK1序列：MPKKKPTPIQLNPNP）与保守的对接域结合(28). 我们认为聚集在MP1高度保守的DG基序周围的酸性斑块可能用于与MEK1建立类似的相互作用。有趣的是，p14显著的b3口袋位于异二聚体的同一侧，因此可能作为第二个蛋白质的结合位点(图2天). 两个p14和MP1结合位点可以协同作用，促进MEK1和ERK1之间的相互作用。一贯地，生化数据表明调节p14/MP1-依赖性MAPK信号的协同作用模式(16). 需要更多的研究来研究这个模型。本结构将有助于构建可能干扰p14/MP1二聚化和/或与MAPK伙伴蛋白MEK1和ERK1结合的位点特异性突变体。

补充材料

致谢

笔记

缩写：MAPK，丝裂原活化蛋白激酶；表皮生长因子；Ras激酶抑制剂KSR；ERK，细胞外调节激酶；MEK、MAPK/ERK激酶；MP1、MEK1合作伙伴；MP1-myc，标记为myc的MP1。

数据沉积：两个p14/MP1复合物结构的原子坐标和结构因子已存储在蛋白质数据库中，网址：www.pdb.org（PDB ID代码分别为1VET和1VEU）。

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