血浆DNA甲基化：非酒精性脂肪性肝病肝纤维化分层的潜在生物标志物

摘要

介绍

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）现在构成了西方世界大多数肝病负担。特别是，随着肥胖和胰岛素抵抗发病率的增加，NAFLD的发病率正在上升，因为生活方式变得越来越久坐，饮食模式也发生了变化。¹NAFLD是一系列肝脏疾病，包括单纯脂肪变性、脂肪浸润加炎症和肝细胞气球变性（非酒精性脂肪性肝炎；NASH）、纤维化和最终肝硬化。²总的来说，NAFLD与心血管疾病和肝脏相关死亡率的风险增加相关。^三最近的研究表明脂肪变性和NASH都可能发展为晚期肝病^4–6纤维化的存在和严重程度是长期预后的关键组织学决定因素；^{7 8}这部分患者更有可能发展为失代偿性肝硬化、门脉高压、肝细胞癌（HCC），并在不进行肝移植的情况下死亡。事实上，NAFLD预计将在十年内成为许多国家肝移植的主要适应症。⁹

必须准确确定NAFLD患者是否存在纤维化；肝活检仍是诊断和分期纤维化的金标准，但由于存在并发症的风险，很少进行肝活检。此外，肝活检存在抽样误差，而对肝纤维化程度和疾病分期的病理评估往往存在观察者间误差。总之，这些问题阻碍了肝纤维化疾病的常规临床护理和药物治疗的发展。临床上使用具有高负预测值的非侵入性评分系统，如NAFLD纤维化评分，以排除晚期纤维化疾病患者。^{10 11}然而，多达四分之一的患者无法使用该评分系统进行分类，¹⁰因此需要肝脏活检以进行组织学澄清。肝硬度测量（FibroScan/声辐射力脉冲）在诊断肝纤维化方面表现良好，但在患有NAFLD的肥胖患者中成功率较低。¹²最终，迫切需要开发非侵入性标记物，以准确分层患者的纤维化严重程度，反映潜在的纤维化过程，并可能用于监测疾病进展和对新兴抗纤维化药物的治疗反应。

毫无疑问，基因多态性在NASH向纤维化的发展中起着一定作用，但也有强有力的证据表明生活方式因素（年龄、饮食、运动、其他并发症等）参与其中。¹越来越明显的是，个人的环境和生活方式经历对疾病易感性和预后有重要影响。此外，人们越来越认识到，这些外部经验通过许多表观遗传机制影响基因表达，从而导致细胞和组织的表型和行为发生动态变化。实验和观察临床信息的不断积累支持了以下概念：表观遗传过程协调肝细胞的行为，并支持包括NAFLD在内的大多数肝脏疾病的病理生物学。¹³DNA甲基化是DNA的一种基本表观遗传修饰，发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（通常称为CpG）内的胞嘧啶碱处。¹⁴长期以来的生物学教条是，CpG甲基化是基因组的一个稳定特征，在胚胎发育期间被注释，通过抑制基因启动子处转录因子的结合或通过招募甲基DNA结合蛋白来抑制基因表达，甲基DNA结合蛋白质随后组装基因转录抑制复合物。¹⁵然而，最近发现的作用于DNA去甲基化的机制以及允许对DNA甲基化进行序列特异性量化的下一代测序协议的开发表明，DNA甲基化不是固定的，而是高度动态的，并对细胞和组织微环境作出响应。^{16 17}事实上，癌症的表观遗传进化现在已经是一个公认的概念，可以通过监测肿瘤生长和扩散过程中的甲基体变化以及化疗反应来追踪。¹⁸我们实验室的工作表明，DNA甲基化的动态变化与纤维化发生的关键事件、肝星状细胞（HSC）活化（或转分化）为基质生成肌成纤维细胞有关。^{16 19 20}此外，我们还发表了使用存档的人类NAFLD和酒精性肝病（ALD）活检组织的观察研究，以证明许多纤维素酶调节基因位点（过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、PPARα、，肿瘤生长因子β和血小板衍生生长因子α（PDGFα）可用于分层纤维化严重程度。^{21 22}例如，PPARγ是核激素受体家族的成员，²³参与脂质储存和代谢、葡萄糖稳态和脂肪生成。^{24 25}它也是HSC激活和肝纤维化发生的主要负调控因子。¹⁹与使用DNA甲基化作为潜在的分层工具相关的是，PPARγ的启动子区域经历甲基化重塑，并随着人类NASH肝活检中纤维化严重程度的增加而变得高度甲基化。²¹然而，在这些研究中，PPARγ启动子甲基化的测量依赖于对肝组织的接触，因此依赖于活检。

本研究的主要目的是询问是否可以在人类血浆的无细胞DNA库中检测到PPARγ启动子的差异DNA甲基化，如果可以，那么该基因座的甲基化水平是否与NASH的纤维化阶段相关。

方法

结果

共有26名NAFLD患者接受了肝活检，以研究脂肪变性患者的异常肝酶或分期纤维化。14名患者患有轻度纤维化（Kleiner 0–2），12名患者患有严重（Kleier 3–4）纤维化。所有患者的人口统计学和实验室特征如所示表1.

NAFLD患者PPARγ基因启动子的血浆DNA甲基化随纤维化程度增加

在分析肝组织DNA甲基化的研究中，我们之前已经表明，人类PPARγ基因启动子内特定CpG二核苷酸的差异DNA甲基化可用于分层NAFLD患者的纤维化严重程度。²¹定量地说，在轻度纤维化中，在检测的两个位点上，CpG甲基化密度从>70%上升到>80%。根据这些结果，分析血浆无细胞循环DNA中PPARγ中相同基因启动子区域的定量甲基化是合理的。为此，我们采集了患者和健康对照者的血液，然后分离出无细胞DNA（参见在线补充数字S1A）。使用经过测试和优化的焦磷酸测序引物（参见在线补充数字S1B），定量测量所有样本中PPARγ启动子内两个特定CpG位点的DNA甲基化量(图1A–C）。我们发现重度与轻度纤维化患者和对照组的CpG基因座DNA甲基化增加(图1B、 C），在第一个CpG位点轻度和重度NAFLD患者之间达到高度统计意义(图1B） ●●●●。

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图1

（A） 过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因启动子的示意图，显示差异甲基化CpG1和2的位置。通过焦磷酸测序测定轻度或重度非酒精性脂肪肝患者和对照组的人PPARγ基因启动子内（B）CpG1和（C）CpG2二核苷酸的（B和C）血浆DNA甲基化。（D和E）肝硬化酒精性肝病（ALD）患者和对照组的人PPARγ基因启动子内（D）CpG1和（E）CpG2二核苷酸的血浆DNA甲基化，通过焦磷酸测序测定。DNA甲基化的定量测量以百分比表示。误差线代表平均值±SEM*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001和***p<0.0001。

补充数字

gutjnl-2016-311526支持002.pdf

接下来，我们想评估PPARγ基因启动子处血浆DNA甲基化的增加是否与纤维化或病因学相关。因此，我们分析了13名因过度饮酒（ALD）导致肝硬化的临床证据患者，并将其与健康对照组进行了比较，因为不可能找到患有轻度ALD的患者。ALD队列的临床特征如所示表2值得注意的是，与健康对照组相比，我们再次发现肝硬化ALD患者PPARγ启动子内的两个CpG基因座存在纤维化相关的高甲基化现象(图1D、 E）。这些数据表明，PPARγ启动子高甲基化不太可能局限于肝病的特定病因，而是与疾病进展和纤维化发展密切相关。

表2

ALD队列的临床特征

临床特征	肝硬化ALD n=13
年龄（岁）	57±6
性别（%男性）	85%
谷丙转氨酶（IU/L）	34±14
天冬氨酸转氨酶（单位/升）	37±6
ALB（g/L）	39±6
血小板（×109/L）	136±61

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ALD，酒精性肝病。

最后，我们分析了PDGFα基因特定位点的血浆DNA甲基化；我们之所以选择PDGF，是因为它是一个成熟的纤维化前基因，我们之前已经在该基因上显示出不同的DNA甲基化。²²在NAFLD肝活检中，一个特定的CpG基因座发生重塑，并随着纤维化程度的增加而发生低甲基化。²²值得注意的是，我们发现严重纤维化与轻度纤维化的NAFLD患者相同CpG位点的血浆DNA甲基化降低；肝硬化ALD患者与对照组相比也有类似的下降（参见在线补充数字S2）。

PPARγ的血浆DNA甲基化作为NAFLD纤维化严重程度的独立预测因子

为了确定CpG1位点的血浆PPARγDNA甲基化水平是否独立预测纤维化严重程度，我们进行了多元logistic回归分析。纳入PPARγDNA甲基化水平和在单变量分析（AST）中发现显著的临床生物化学指标，以控制纤维化严重程度与血浆PPARγDNA甲基化水平之间可能的混杂因素。PPARγ仍然具有统计学意义（p=0.01），而AST则失去了意义（p=0.095）。为了评估该测试的临床适用性，我们使用AUROC分析评估了其对晚期NAFLD纤维化（Kleiner 3-4）的诊断性能(图2A） ●●●●。AUROC为0.91，显著高于机会分配（渐近显著性p=0.000）。阈值为81%的PPARγCpG1甲基化值是区分轻度纤维化和晚期纤维化的最佳界限。该评分与NAFLD纤维化评分（一种经充分验证且广泛使用的非侵入性纤维化评分）相比较有利(图2). PPARγCpG1甲基化和NAFLD纤维化评分的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）见图2B。

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图2

（A） 使用过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）CpG1的定量DNA甲基化数据与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）纤维化评分进行晚期纤维化（克莱纳纤维化3～4期）无创诊断的受体操作特征（ROC）曲线。（B） 26例非酒精性脂肪性肝病（非酒精性肝炎）患者轻度与晚期纤维化分层的各项检测结果的比较。AUROC，ROC管辖区域。

血浆DNA PPARγ启动子的高甲基化与肝细胞而非肌成纤维细胞DNA甲基化的变化相关

我们接下来感兴趣的是确定血浆DNA中检测到的PPARγ启动子高甲基化程度是否反映了患病肝脏中的细胞变化。特别是，我们希望利用激光捕获显微切割（LCM）技术，在晚期NASH肝移植中从周围的非纤维化肝实质中分离富含肌纤维母细胞的纤维化组织。NAFLD外植体的特征由专家组织病理学家（DT）确定(图3A） ，然后使用LCM切除肝细胞富集区域(图3B、 左面板）或肌纤维母细胞丰富的瘢痕区域(图3B、 右侧面板）。再次，使用从LCM获得的组织中分离的基因组DNA通过焦测序测定PPARγ启动子内两个CpG基因座的DNA甲基化状态(图3C、 D）。与富含肌成纤维细胞的区域相比，两个CpG基因座在肝实质中都是高甲基化的(图3C、 D）。捕获的肝细胞结节中CpG1和CpG2的平均DNA甲基化百分比分别为79和78，而纤维化组织中为63和61。与非病变肝组织实质组织的类似测量值相比（CpG1和CpG2分别为76%和70%，在线补充数字S3A）和对照外周血单个核细胞（PBMC）（CpG1和CpG2分别为68%和63%，在线补充数字我们的LCM-焦磷酸测序数据表明，血浆中检测到的PPARγ启动子高甲基化与肝细胞中甲基化变化的关系比肌成纤维细胞或PBMC更密切。为了证实这一发现，我们使用ALD外植体组织进行了类似的LCM-焦磷酸测序分析（典型图像如图4A） ，再次使用LCM分离富含肝细胞的(图4B、 左面板）或肌纤维母细胞富集区域(图4B、 右侧面板）。与NAFLD一样，我们发现肝细胞富集组织与肌纤维母细胞富集组织的PPARγ启动子中CpG1和CpG2位点的相对高甲基化(图4C、 D）。因此，无论脂肪性肝病的病因如何，进展到晚期都与从血浆和富含肝细胞的再生结节中分离的DNA中的PPARγ启动子高甲基化有关。

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图3

（A） 用天狼星红和α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）染色的移植非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）肝组织的代表性图像。天狼星红色图片中的蓝色箭头指向肝细胞，而α-SMA染色切片中的棕色箭头显示瘢痕区域的肌成纤维细胞。以10倍放大率拍摄显微照片。（B） 移植的NAFLD肝组织进行激光捕获显微切割（LCM）；从肌纤维母细胞富集区分离出肝细胞区。LCM前后的H&E染色组织。（C和D）人过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因启动子内（C）CpG1和（D）CpG2二核苷酸的DNA甲基化密度，通过来自NAFLD的LCM材料中的焦磷酸测序测定。DNA甲基化被定量测量并表示为百分比。误差条代表平均值±SEM*p<0.05和**p<0.01。。

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图4

（A） 用马森三色、天狼星红和α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）染色的移植性酒精性肝病（ALD）组织的代表性图像。蓝色箭头指向肝细胞，而棕色箭头指向αSMA染色瘢痕区的肌成纤维细胞。以10倍放大率拍摄显微照片。（B） H&E染色移植的ALD肝组织进行激光捕获显微切割（LCM）；从肌纤维母细胞富集区分离出肝细胞区。图像显示LCM前后的组织。人过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因启动子内（C）CpG1和（D）CpG2二核苷酸的（C和D）DNA甲基化密度，由来自ALD的LCM材料中的焦测序确定。差异甲基化CpG的位置如上图所示。差异以DNA甲基化的百分比表示。误差线代表平均值±SEM****p<0.0001。

讨论

鉴于目前肝脏疾病负担的增加，迫切需要非侵入性或微创性疾病进展生物标记物。特别是，NAFLD的发病率正在增加，预计到2020年将成为肝移植的主要适应症。⁹最近，纤维化的存在被证明是长期预后的关键组织学决定因素。^{7 8}因此，准确测定纤维化程度对有效治疗该病至关重要。NAFLD纤维化评分目前在常规实践中被广泛采用，以帮助合理使用肝活检，但对于许多患者来说，如果不转诊肝活检，就无法提供满意的疾病进展定量测量。¹⁰可在患者血液中检测到的疾病进展动态生物标记物提供了对疾病进展进行微创定期监测的优势，并且如果预后对NASH和其他主要形式慢性肝病的临床管理和临床试验的设计极有帮助的话。

这里，我们在NAFLD和ALD中显示，所谓差异DNA甲基化区域（DMR）甲基化密度的序列特异性量化可用于根据患者的疾病严重程度对患者进行分层。具体来说，使用PPARγ启动子中先前被鉴定为DMR的两个CpG序列，我们已经表明这些序列的高甲基化与晚期纤维化/肝硬化相关。这一发现与我们之前的数据相关联，该数据表明，肝脏活检组织中同一PPARγ启动子DMR的高甲基化可用于识别进展到Kleiner 3-4级的患者。²¹虽然我们的研究仅使用了相对较少的患者样本（26例NAFLD和13例ALD），PPARγ启动子超甲基化与两种不同疾病病因的疾病进展相关，这一事实鼓励并支持对PPARγDMR和其他基因组DMR的诊断和预后实用性的进一步研究。同样，我们在两个不同和相反的基因DMR中的差异血浆DNA甲基化证明进一步加强了我们的研究。

一个有趣的问题是肝病患者血浆中高甲基化PPARγDNA的细胞来源。肝细胞损伤和死亡是NASH和ALD病理生物学的特征性组成部分，预计将导致大量无细胞DNA泄漏到循环中。此外，最近的一篇论文报道称，肝脏对血浆中自由循环的DNA库有重要贡献。²⁸鉴于LCM捕获的血浆和富含肝细胞的组织中CpG1和CpG2的PPARγ超甲基化程度相似，我们很容易推测死亡的肝细胞代表了高甲基化血浆DNA的细胞来源。然而，在撰写本文时，我们缺乏足够的直接证据来支持这一观点。

我们LCM-焦磷酸测序研究的一个意外发现是，与肌纤维母细胞丰富的纤维化组织相比，富肝细胞组织中CpG1和CpG2 PPARγ启动子DMR的甲基化密度更高，这在NASH和ALD肝脏中都可以观察到。PPARγ表达与HSC静止的非成纤维表型密切相关，需要抑制其转录，以便细胞采用肌成纤维细胞表型。^{29 30}我们之前已经证明，甲基-CpG结合蛋白MeCP2至少部分通过与上游启动子的甲基化区域结合，在上游启动子中招募染色质重塑因子，从而抑制PPARγ转录。¹⁹因此，PPARγ启动子甲基化程度较高可能是晚期肝病中纤维化组织的特征。然而，我们对非纤维化肝细胞丰富组织和纤维化肌纤维母细胞丰富组织的比较表明，PPARγ启动子中的DMR在肝细胞中甲基化程度更高。值得注意的是，最近的一项细胞特异性敲除研究报告称，实验诱导小鼠肝纤维化后，肝细胞PPARγ1 mRNA受到高度抑制。³¹在实验中，肝细胞PPARγ表达的缺失被认为是HSC预活化和加速纤维化的信号³²; 这样的过程可能构成肝细胞和HSC之间的重要串扰机制，该机制驱动疾病进展为纤维化和肝硬化。PPARγ也被证明在肝再生中具有调节作用。肝细胞靶向PPARγ基因缺失的小鼠在饮食诱导的脂肪变性环境中表现出再生受损。³³因此，肝细胞中PPARγ的高甲基化也可以反映再生受损，这是晚期肝病的主要特征，也是纤维化的驱动因素。^{34 35}

目前的研究存在一些局限性。显然，样本量相对较小，在单独的队列中没有独立的验证。此外，我们的方法需要使用前瞻性收集的新鲜血浆样本，避免立即使用其他中心现有队列中的存档血浆样本。没有关于参与研究的患者预后的数据，也没有纵向测量数据，尤其是来自介入试验的数据。最后，尽管该数据在该队列中对NAFLD纤维化评分表现良好，但该数据并不表明其优于现有的纤维化生物标记物。然而，鉴于在这一小组患者、NAFLD纤维化患者和肝硬化ALD患者的两个单独的基因DMR中检测到显著差异的血浆DNA甲基化的能力，需要进一步的工作来验证在NAFLD、ALD和其他纤维化肝病患者的大组列中的这些发现。

鉴于本研究的局限性，有明确的进一步研究方向。首先，需要在第二个独立队列中验证这些发现。其次，通过对介入试验患者进行配对活检分析，可以揭示路径导向干预（如PPARα/δ激动剂）是否会改变该标记物的诊断性能。我们目前尚不清楚的是，在个体的疾病过程中，PPARγ和其他携带DMR的基因的DNA甲基化程度发生了变化。因此，应评估生物标记物的诊断相关性和预后价值。在长期随访中，应评估使用新技术对NAFLD早期阶段疾病进展的预测。此外，当与NAFLD共存时，我们对HCC特异性表观基因特征及其对PPARγ甲基化模式的影响的了解应在未来的研究中进行评估。最后，一个关键问题是PPARγ超甲基化是易患疾病进展的患者的预设特征，还是随着疾病的发展而发生的更动态的改变。

总之，我们的研究结果表明，根据PPARγ基因启动子内DMR的甲基化水平，血浆DNA可以被检测出来，并可能用于非侵入性分层NAFLD的纤维化风险。经过验证，这种基于血液的生物标记物可以与其他表观遗传、遗传和生化生物标记物一起成为重要的临床辅助工具，减少未来活检评估纤维化的需要。

致谢

脚注

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