外周蛋白质量控制去除质膜上未折叠的CFTR

摘要

异常多肽是由于转录、翻译和折叠错误以及基因突变或环境压力而产生的(1–三). 为了保持蛋白质平衡，质量控制（QC）机制已经发展起来，以便于折叠和消除末端错误折叠的多肽(三,4). 在内质网（ER），非天然膜蛋白被泛素化并逆转录到细胞质中，被泛素（Ub）蛋白酶体系统（UPS）破坏，这是ER相关降解（ERAD）的一部分。相比之下，从内质网逃逸或在内质网后产生的非天然膜蛋白优先通过溶酶体降解被清除(5–7). 负责在质膜（PM）识别和降解非天然蛋白质的外周质控的分子机制尚不清楚(1,8–10).

F508残基（ΔF508）是囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）中最常见的突变，其缺失会通过伴侣、耳蜗酮、，以及E2-Ub偶联酶和E3-Ub连接酶[羧基末端热休克同源物70（Hsc70）-相互作用蛋白（CHIP）、糖蛋白gp78和Rma1](11–14). 虽然单独抑制E3-利基气体无法恢复生物合成过程，但低温（26°C）和小分子校正器单独或结合E3连接酶的消融，促进功能性、复合糖基化ΔF508CFTR的PM积累(15–18). 然而，救出的（r）ΔF508CFTR代谢不稳定，并在37°C时迅速消除，这阻碍了恢复PM氯电导的治疗努力(5,18). 突变CFTR的不稳定性归因于去折叠和随后的泛素化、内化和溶酶体降解(5,6).

第页ΔF508CFTR作为外围QC的探针

为了确定rΔF508CFTR泛素化机制，我们构建了表达CFTR-3HA的HeLa和IB3（支气管呼吸上皮）细胞系，这些细胞系适用于小干扰RNA（siRNA）功能筛选(19). 细胞外血凝素标签（3HA-tag）可选择性检测CFTR(5). 野生型（wt）蛋白主要是复合糖基化并定位于PM，而ΔF508CFTR以核心糖基化形式表达并保留在37°C的ER中(图S1、A至C). 26°C下折叠缺陷的修复(15)部分恢复的生物合成过程和复合糖基化ΔF508CFTR在高尔基后腔室和PM的表达(图S1、A至C). 然后，rΔF508CFTR在37°C下通过加速内化和衰减再循环被消除(图1、A和B、和图S1、D至F)如预期(5).

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图1

构象失稳的rΔF508CFTR是泛素化的，并以ESCRT依赖性降解为目标。(一个)采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定CFTR颗粒的稳定性。ΔF508CFTR在26°C下保存36小时，然后37°C孵育2.5小时（rΔF）或26°C。(B类)用ELISA法测定（左）CFTR内化和（右）内吞再循环。rΔF508CFTR的展开在37°C下完成（2.5小时）。(C类)通过免疫印迹和密度测定法对剩余全长CFTR进行定量，测量微粒体中CFTR变体的胰蛋白酶敏感性。B带和C带分别表示核心和复合糖基化CFTR。(D类)rΔF508CFTR在高尔基后亚区的泛素化用d-IP测量，并对沉淀中的CFTR进行归一化。未挽救的ΔF508CFTR（ΔF）用作阳性对照。(E类和F类)通过37°C下的CHX追踪和ESCRT KD HeLa细胞（E）中抗HA抗体的免疫印迹测定rΔF508CFTR的代谢稳定性。剩余的复合糖基化CFTR通过密度计进行量化，并表示为初始量的百分比（F）。使用SMARTpool（p）或单个siRNA（1和2）。siNT；非靶向siRNA。

ΔF508CFTR在BHK细胞分离微粒体中的蛋白酶敏感性证明了其对温度敏感的构象缺陷(20). 在26°C下，通过环己酰亚胺（CHX）追踪（~10小时）从ER中清除新合成的核心糖基化通道，以避免络合糖基化rΔF508CFTR的去折叠(图S1G). 微粒体分离前37°C（2.5小时）下展开后，rΔF508CFTR的胰蛋白酶敏感性增加了5至10倍(图1C). 成熟的wt CFTR和不成熟的ΔF508CFTR的胰蛋白酶敏感性分别显著低于和高于rΔF50 8CFR(图1C)，如预期(21).

变性免疫沉淀（d-IP）和抗Ub免疫印迹显示，热去折叠后复合糖基化rΔF508CFTR的泛素化增加了两倍(图1D). 在没有展开的情况下，rΔF508CFTR PM的稳定性、内化、内吞循环和泛素化水平接近wt表型(图1，A到D). 相反，CD4Tl-Ub嵌合体PM不稳定性的温度依赖性(22) (图S1H)细胞蛋白的泛素化和CHIP的Ub-连接酶活性（见下文）可以忽略不计(图S2、A至C). 这些观察结果与构象失稳导致rΔF508CFTR泛素化增加和37°C时PM快速转换的概念一致。事实上，与wt-CFTR相比，ΔF508CFTR对胰蛋白酶敏感性的显著增强与其在内质网泛素化的约100倍增加平行(图1、C和D). 因此，CFTR的泛素化倾向随着其构象失稳而增强，不仅在ER处，而且在高尔基后腔室，rΔF508CFTR是研究PM构象QC的合适模型。

支持泛素化在CFTR溶酶体降解、消融或敲除Hrs、STAM或TSG101内体分选复合物转运所需的Ub结合成分（ESCRT）中的功能，使用单个或SMARTpool siRNA；(5,6)HeLa细胞中代谢稳定的rΔF508CFTR(图1、E和F和图S3、A至C). 这可能是由于溶酶体输送受阻，通过腔酸化程度和含有异硫氰酸荧光素标记rΔF508CFTR的内吞囊泡速率进行监测(图S3、D到F). 来自PM的Lamp1溶酶体靶向性不受ESCRT KD的影响(图S3E).

依赖CHIP的泛素化从PM中去除未折叠CFTR

为了确定rΔF508CFTR的泛素化机制，33个E3连接酶参与PM受体的下调(8,10,23)和CFTR ERAD(12,13,24)使用SMARTpool siRNA耗尽（敲除），然后测定HeLa细胞中rΔF508CFTR PM的稳定性。CHIP、gp78或Hrd1耗竭抑制rΔF508CFTR处置约50%(图2A). 因为在IB3细胞中只能证实CHIP效应(图2B)，随后的实验集中于芯片。单个CHIP siRNA还阻碍复合糖基化和PM rΔF508CFTR降解(图2C和图S4、A和B).

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图2

CHIP介导PM中rΔF508CFTR的消除(一个)功能性siRNA筛选，以确定负责从HeLa细胞PM中清除rΔF508CFTR的Ub连接酶。用50nM SMARTpool siRNA敲除Ub连接酶，并通过ELISA在37°C下测量rΔF508CFTR PM稳定性。TSG101 siRNA；阳性对照。数据是来自两个或三个独立的四份实验的平均值±SEM。(B类)Ub连接酶或UbcH5c KD对IB3细胞中rΔF508CFTR PM稳定性的影响。(C类)利用SMARTpool siRNA对CHIP KD进行CHX追踪免疫印迹，测定高尔基后亚群的rΔF508CFTR代谢稳定性。绘制剩余的复合糖基化CFTR。(D类)在37°C下测量CHIP-KD细胞中CFTRs（5分钟）、TfR（5 min）和CD4Tcc-Ub（AllRΔG）（2.5分钟）的内化。(E类)CHIP KD增强了rΔF508CFTR内吞再循环。(F类)在E2-KD细胞中测量rΔF508CFTR PM稳定性，如（A）所示。

CHIP KD后未折叠rΔF508CFTR的内化减少约80%，而不影响转铁蛋白受体（TfR）和CD4Tcc-Ub（AllRΔG）嵌合体的摄取，这分别由酪氨酸基和四聚体Ub基内吞基序发出信号(图2D) (22). 在缺乏热去折叠和wt-CFTR的情况下，CHIP KD对rΔF508CFTR缓慢内吞作用的影响不大(图2D). CHIP KD也部分恢复了rΔF508CFTR内吞再循环(图2E)在不干扰Lamp2/CD63溶酶体靶向和TfR再循环的情况下，延迟早期内体的溶酶体输送（pH~6.2）(图S4、C到E). 为了支持CHIP的参与，消融CHIP的同源E2酶UbcH5c，阻止了IB3和HeLa细胞PM中rΔF508CFTR的去除(图2、B和F). CHIP KD还将络合糖基化rΔF508CFTR在37°C时的泛素化降低到26°C时(图3，A和B)，解释了内部化减弱、促进再循环和阻碍溶酶体传递未展开的CFTR的原因。

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图3

rΔF508CFTR泛素化受伴侣和共同伴侣调节。(一个)在SMARTpool siRNA转染的HeLa细胞中，检测高尔基体后亚群的rΔF508CFTR泛素化图1D. (B类)免疫印迹（A）和（G）中CFTR泛素化的定量。沉淀中CFTR的信号被归一化，并表示为去折叠（37℃，2.5小时）后siNT处理细胞中rΔF508CFTR泛素化的百分比，如图1D. (C类)在共表达myc-CHIP变异体的COS7细胞中，用ELISA法测定（左）PM稳定性和（右）rΔF508CFTR内化。(D类)在转染myc-CHIP变体的HeLa细胞中，CHIP与核心和复合糖基化rΔF508CFTR相互作用。(E类)经0.1 mM二硫代双[丙酸丁二酰亚胺]（DSP）体内交联后，HeLa细胞中的co-IP显示伴侣与复合糖基化rΔF508CFTR的相互作用。通过CHX追逐使核心糖基化wt和rΔF508CFTR最小化（车道3和4）。(F类)rΔF508CFTR PM稳定性通过SMARTpool siRNA根据伴侣或耳蜗酮的KD进行评估，如图2A数据是来自两个或三个独立的四份实验的平均值±SEM。(G公司)如（A）所示，在SMARTpool siRNA-转染的HeLa细胞中，对高尔基后亚群的rΔF508CFTR泛素化进行了测量。

Hsc70在下午确认未结CFTR

为了支持CHIP功能丧失表型，CHIP wt的过度表达而非催化活性的CHIP-H260Q[其中His²⁶⁰替换为Gln(25)]通过加速共转染COS7细胞内吞作用降低rΔF508CFTR表达和代谢稳定性(图3C和图S4F). 协同免疫沉淀（co-IP）证实CHIP与核心糖基化形式的关联(12)并揭示了CHIP在37°C下与复合糖基化rΔF508CFTR发生物理相互作用(图3D). 与核心糖基化F508CFTR相比，复合糖基化rΔF508CFTR的结构缺陷较轻，导致CHIP结合较弱(图1C)，被CHIP-H260Q突变稳定，可能是通过延迟CFTR解离(图3D). 通过K30A突变（取代Lys）消除Hsc70和热休克蛋白90（Hsp90）与CHIP四肽重复序列（TPR）结构域的结合³⁰与Ala）(26)防止PM的通道下调(图3C和图S4F)和CHIP-rΔF508CFTR相互作用(图3D). 根据Hsc70和Hsp90依赖的CHIP相互作用，通过co-IP验证了Hsc70以及在较小程度上Hsp90与复合糖基化rΔF508CFTR的关联，但与wt对应物的关联较少(图3E).

在HeLa细胞中评估分子伴侣对rΔF508CFTR外周质控的贡献。PM时Hsc70或Hsp90A（Hsp90α）稳定rΔF508CFTR的烧蚀(图3F和图S5A)通过减少其泛素化(图3A、B和G)在不干扰TfR和CD4Tl-ccUb（AllRΔG）内吞和Lamp2/CD63溶酶体分选的情况下，内化、溶酶体传递和降解(图4，A到E)CHIP KD效应的哪种现象。Hsc70 KD诱导应激反应中Hsp70和耳蜗酮亚群的上调(图S6、C和F)无法弥补Hsc70功能的丧失，这可能意味着伴侣和耳蜗之间的功能差异(27). 此前，在格尔德霉素抑制Hsp90后，CHIP-Hsc70参与了PM-localized ErbB2受体的蛋白酶体和溶酶体降解(28). 值得注意的是，格尔德霉素对rΔF508CFTR PM稳定性的影响最小(图S7)这突出了rΔF508CFTR和ErbB2降解之间的独特启动机制。

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图4

rΔF508CFTR的内化和溶酶体靶向性受不同的伴侣和耳蜗调节。(一个)未折叠rΔF508CFTR（5分钟）、TfR（5分钟图2D. (B类和C类)通过测量早期内体到溶酶体的酸化率（参见图S9). (D类)通过CHX追踪免疫印迹法测定SMARTpool siRNA-转染HeLa细胞中（左）核心糖基化ΔF508CFTR和（右）复合糖基化rΔF50 8CFR的代谢稳定性。(E类)在（D）所示的实验中，CFTR消失通过密度测定法定量，并表示为初始量（T-0）的百分比。每个样本的条形图表示0-3小时和0-6小时追踪的数据（顶部）。MG132和巴非霉素A1（BafA1）分别是ERAD和溶酶体降解的阳性对照。

体外证实了CHIP-Hsc70在rΔF508CFTR泛素化中的作用。复合糖基化rΔF508CFTR-His₁₀在自然条件下通过亲和层析从BHK细胞中分离得到。验证了重组wt和K30A的催化活性，而不是ΔUbox CHIP(图S8，A至D). 在E1、UbcH5c、CHIP、myc-Ub和三磷酸腺苷（ATP）存在下，重组rΔF508CFTR的泛素化(图5A). 省略任何成分或使用CHIP-ΔUbox破坏了通道泛素化(图5A和图S8E). 从富含PM的囊泡中纯化rΔF508CFTR也获得了类似的结果(图5B和图S8、F和G). 重组Hsc70显著增强了CHIP-依赖性泛素化，而CHIP-K30A仍然无效(图5B和图S8E). 因此，Hsc70在识别非本土rΔF508CFTR和高尔基后亚区CHIP募集中起着重要作用。Wt-CFTR对泛素化有很大抵抗力，这证实了Hsc70-CHIP-UbcH5复合物在体外的构象选择性(图5C) (12,29).

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图5

外围质量控制机制使展开的CFTR无所不在，并规定PM水平。(一个)体外重组rΔF508CFTR泛素化。纯化复合糖基化rΔF508CFTR-His₁₀与E1、UbcH5c、CHIP、Hsc70、Ub-Myc和ATP在30°C下孵育2小时。用d-IP分离rΔF508CFTR并进行免疫印迹分析。(B类)重组Hsc70刺激来自富含PM的囊泡的纯化rΔF508CFTR的CHIP依赖性泛素化。(C类)Wt和rΔF508 CFR-His₁₀如（B）中所述进行纯化和泛素化。(D类)基于对rΔF508CFTR PM密度影响的伴侣/耳蜗分类(图S5E)和稳定性(图2A和​和3F）。第三层). 已识别的外围QC机器的部件以较大的类型表示。(E类)rΔF508CFTR外周蛋白QC的工作模型。

辅酶肽调节CFTR外周质控

Hsc70-Hsp90的折叠和降解功能受耳蜗调节(24,30–32). 使用SMARTpool和单个siRNAs进行功能筛选后发现，从HeLa细胞PM中去除rΔF508CFTR需要BAG1、DNAJB2（HSJ1）、DNAJA1（Hdj2）、DNAJC7（TPR2）、HOP（STIP1）和Aha1（AHSA1）(图3F和图S5A). Hsc70及其共同伴侣、BAG1、DNAJB2、DNAJA1和HOP对IB3细胞也有效，尽管Hsp90A和Aha1的影响不大(图S5B).

我们通过泛素化、内化和溶酶体靶向验证了耳蜗酮对rΔF508CFTR处置的贡献。消融Hsc70调节因子DNAJA1、Hsc70-Hsp90耦合因子HOP或Hsp90辅酶Aha1可降低rΔF508CFTR泛素化(图3、B和G)并在不影响TfR和CD4Tcc-Ub（AllRΔG）摄取的情况下内化(图4A和表S1). 通道泛素化和内化或PM稳定性之间的相关性表明，这些耳蜗通过增强泛素化促进rΔF508CFTR内化和处置，可能是通过调节CHIP-Hsc70-Hsp90A复合物(图S5、C和D).

来自早期内体的rΔF508CFTR的溶酶体递送受到DNAJA1、DNAJB2、DNAJC7、Aha1、BAG1或HOP的KD的阻碍(图4B和图S9). 然而，DNAJC7、Aha1或HOP的消融也延迟了Lamp2/CD63溶酶体靶向性(图4C)，这意味着它们在货物溶酶体靶向上的Ub-独立功能(表S1). 相反，DNAJB2仅通过增强早期内体的泛素化参与rΔF508CFTR的溶酶体靶向(图3、B和G、和4、A到C). BAG1 KD选择性抑制rΔF508CFTR内化和溶酶体递送，而不影响泛素化(图3、B和G、和4、A到C)表明其在泛素化后发挥作用。因为BAG1被CHIP泛素化并且包含Ub-like域(30)，它可能将伴侣-rΔF508CFTR复合物与内化和溶酶体分选机制的Ub-结合适配器联系起来。

CFTR PM水平由其PM稳定性和生物合成分泌决定，由转录、翻译和ER相关折叠和降解速率决定。基于伴侣酮和耳蜗酮KD对核心糖基化ΔF508CFTR表达的最小影响(图S5F)和ERAD(图4、D和E，见下文），我们推断CFTR PM密度主要由折叠和/或分泌和PM稳定性调节。因此，在恒定分泌时，PM密度应与CFTR外周稳定性成正比。事实上，消融Hsc70、DNAJB2或Aha1可以成比例地增加rΔF508CFTR PM密度和功能(图5D、和图S5E和S10)这表明这些伴侣或耳蜗蛋白主要参与外周降解。相反，CHIP或Hsp90A的消融仅略微增加了通道PM密度，而DNAJA1、BAG1或HOP-KD没有增加通道PM密度(图5D和图S5E)这表明外周稳定被受损的生物合成分泌所抵消。PM密度和稳定性之间观察到的关系也支持伴侣和耳蜗酮在CFTR折叠中的既定作用[例如calnexin（CNX）(6,33); BAG2型(30); 第23页；FKBP8型(24)和稳定性[钙网蛋白（CALR）(34)].

讨论

我们的结果显示，ER的CFTR QC成分之间存在部分重叠(4,12,16,35,36)和PM，这表明类似的原则可能指导不同蜂窝位置结构缺陷信道的识别。这与CHIP-UbcH5c合成具有所有可能连接的Ub链的能力一致(37)，为蛋白酶体降解通道提供识别信号(38)高尔基后腔室中的Ub结合内吞和ESCRT适配器(9). ERAD和溶酶体降解的比较表明，只有Hsc70或BAG1 KD延迟了ΔF508CFTR ERAD，而在我们的功能筛选中确定的任何伴侣或耳蜗酮的KD减弱了rΔF50 8CFTR的降解(图4、D和E)，这意味着平行的QC途径，包括与伴侣无关的系统(13,14,39)，以提高ER QC的保真度。

基于我们的结果和不同亚细胞位置的蛋白质平衡机制(1–4,30)，为外围CFTR QC提出以下模型(图5E). CFTR未折叠细胞质区域的识别由Hsc70和DNAJA1共同介导，可能也由Hsp90机制介导。与伴侣-耳蜗复合体的长时间相互作用招募CHIP-UbcH5c，导致构象损伤的CFTR泛素化。这种泛素化可能受到其他E3连接酶和去泛素酶活性的影响(40)，最终分别由Ub结合网格蛋白适配器和ESCRT机制介导的内吞作用和溶酶体递送加速。Hsc70-Hsp90对非天然多肽的杂合底物特异性意味着外周QC可能有助于其他构象缺陷PM蛋白的分型决策，从而导致各种构象疾病的发病机制。

补充材料

致谢

脚注

参考文献和注释