脂肪组织不变的NKT细胞通过调节性细胞因子的产生预防饮食诱导的肥胖和代谢紊乱

iNKT细胞在肥胖发生中的作用

接下来，我们探讨了iNKT细胞可能对肥胖和相关代谢后果起保护作用的假设。缺乏iNKT细胞但免疫系统正常的Jα18-缺陷小鼠与年龄匹配的体重小鼠一起喂食HFD或SFD。在HFD攻击前，Jα18缺陷小鼠显著增大。在HFD治疗中，它们的体重也显著增加，脂肪垫显著增大，而瘦体重没有变化(图2a)Jα18缺乏小鼠和体重轻小鼠的食物摄入量相似(图2b). 与HFD小鼠相比，Jα18缺陷小鼠的脂肪细胞更大(图2c、d). 此外，患有HFD的Jα18缺陷小鼠的肝脏脂肪沉积更高(图2e)HFD患者空腹血糖升高，GTT受损，胰岛素抵抗增加(图2f). 与SFD相比，HFD组wt和Jα18缺陷小鼠的血清瘦素浓度相等(图2g).

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图2

iNKT细胞缺乏对体重增加、糖耐量、脂肪细胞大小和数量以及肝脏脂肪堆积的影响

（a）Jα18的重量^−/−HFD开始时和8周内的wt小鼠与SFD上的wt相比（每周每组4只）。HFD 8周后总体体重增加。体重和Jα18的瘦体重和附睾脂肪垫重量^−/−HFD小鼠和SFD小鼠的体重进行了比较。（b） 体重和Jα18缺陷小鼠的HFD食物摄入量。（c）用粒子计数器测量锇固定脂肪细胞的脂肪细胞直径。来自Jα18的脂肪细胞大小^−/−以及HFD上的wt小鼠（每只小鼠4个样品，每组4只小鼠）。（d）附睾脂肪脂肪细胞的组织学。wt小鼠对SFD、wt小鼠、HFD和Jα18的脂肪细胞大小^−/−HFD小鼠。对象/对象小鼠也进行了比较。比例尺，100μm。（e）wt和Jα18肝脂肪浸润的组织学研究^−/−HFD小鼠（4个单独实验的代表）。（f）SFD组小鼠空腹血糖（左）、葡萄糖耐量（中）和胰岛素抵抗（右。HOMA-IR测定的胰岛素抵抗（t检验）。（g）HFD组wt和Jα18-缺陷小鼠的血清瘦素水平与SFD组wt相比（n=4/组，方差分析）。图表显示平均值+标准差*p<0.05，**，p<0.01，***p<0.0001

我们在另一个缺乏iNKT细胞的小鼠模型中检测了DIO；Cd1d1号机组^−/−缺乏iNKT细胞限制因子的小鼠，因此也选择性缺乏iNK细胞。Cd1d1号机组^−/−在HFD中，小鼠的体重增加明显多于体重为wt的小鼠(图S2a).Cd1d1号机组^−/−HFD组小鼠的空腹血糖高于HFD组的wt组，血糖处理较差。空腹胰岛素和胰岛素抵抗并没有显著升高，可能是因为这些胰岛素测定固有的更高变异性(图S2b，c).Cd1d1号机组^−/−免疫组化检测显示，小鼠脂肪细胞也较大(图S2d).

上述实验均在男性身上进行。据报道，肥胖的某些代谢并发症存在性别差异(Fox等人，2007年;Medrikova等人，2011年)，我们还研究了患有HFD的雌性Jα18缺陷小鼠与雌性wt小鼠的代谢结果(图S3). 与雄性小鼠一样，雌性Jα18缺陷小鼠在HFD攻击的前4周体重明显增加；此后，体重增加，但与体重相比没有显著差异(图S3a). 这与饮食行为有关；在4周时，雌性Jα18缺陷小鼠的食物摄入量与雌性体重相比有所减少，而雄性体重和Jα18缺乏小鼠的食物摄入模式几乎相同(图S3b). 瘦体重相似，但Jα18缺陷女性的总脂肪量和脂肪垫重量均显著较高(图S3a). 脂肪细胞显著增大，数量减少(图S3c)在HFD中，Jα18缺陷女性的脂肪肝程度高于体重(图S3d). 然而，与男性相比，患有HFD的Jα18缺陷的女性相比，其空腹血糖没有变化，GTT没有受损(图S3e). 我们的研究结果与其他肥胖研究一致(Fox等人，2007年;Medrikova等人，2011年)说明雌性小鼠有较大的脂肪垫和脂肪细胞，但与雄性小鼠相比，对HFD诱导的葡萄糖损伤和胰岛素抵抗不太敏感

iNKT细胞数量与脂肪组织中巨噬细胞浸润呈负相关

iNKT细胞可以招募和调节其他免疫细胞(Cerndolo等人，2009年). 我们研究了脂肪来源的iNKT细胞对巨噬细胞浸润和活化的影响。如预期，促炎巨噬细胞（F4/80⁺CD11c公司⁺)肥胖症发展过程中脂肪组织增加，在HFD发病1周时可检测到明显增加。HFD停止1周后，脂肪中的促炎巨噬细胞显著减少(图3a). 我们发现脂肪和炎症前巨噬细胞中iNKT细胞水平之间存在强烈的负相关(图3a).

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图3

iNKT细胞与巨噬细胞的关系

（a）左侧，促炎性巨噬细胞（促炎性Mac；F4/80⁺CD11c公司⁺MMR公司⁺)喂食HFD（红色）或SFD（蓝色）10周的wt小鼠的脂肪水平（以%血管收缩分数（SVF）表示）。虚线表示HFD被SFD替换的时间（黑色）。对，iNKT细胞水平和脂肪中巨噬细胞数量之间的相关性，皮尔逊r=−0.9612，p=0.0001。（b）左图：%F4/80的代表性点图⁺每个脂肪垫的巨噬细胞总数（顶部），以及CD11c的巨噬细胞百分比⁺（促炎）（中间）和CD206巨噬细胞百分比⁺（抗炎）（底部）wt SFD、wt HFD和Jα18缺乏HFD。右：单个小鼠组（每组4只小鼠）的巨噬细胞水平和表型，包括免疫组织化学测量的CD68+巨噬细胞数量（每组20个低倍视野（LPF））。（c）F4/80免疫组织化学染色⁺SFD、HFD和Jα18上wt脂肪中的巨噬细胞^−/−HFD小鼠，以及对象/对象SFD小鼠（每组代表4只小鼠）。（d）CD68的免疫组织化学染色⁺来自SFD上的wt和HFD上的wt和Jα18缺陷的脂肪中的M1巨噬细胞（代表每组4只小鼠）。比例尺，100μm*p<0.05，**，p<0.01，***p<0.0001

为了确定iNKT细胞是否在巨噬细胞的浸润和表型中发挥因果作用，我们研究了肥胖Jα18缺陷小鼠的巨噬细胞数量。在没有iNKT细胞的情况下，脂肪组织中的巨噬细胞总数较高(图3b、c、d). 与HFD组的wt相比，Jα18缺陷小鼠的脂肪组织巨噬细胞表现出增加促炎症（CD11c）和降低抗炎（CD206）表型的趋势(图3b).Cd1d1号机组^−/−与HFD小鼠相比，脂肪组织中F4/80巨噬细胞的数量同样高(图S2e)但在HFD上，促炎性巨噬细胞明显多于wt小鼠(图S2f).

缺乏iNKT细胞的小鼠在SFD上表现出代谢紊乱

Jα18缺陷和Cd1d1号机组^−/−小鼠的免疫系统明显正常，没有病理敏感性，除非受到某些病原体或肿瘤的攻击。我们调查了Jα18缺乏症和Cd1d1号机组^−/−喂食老鼠即兴演奏在SFD上持续4-5个月。Jα18缺陷小鼠和Cd1d1号机组^−/−小鼠体重持续增加(图4a)与年龄匹配的wt小鼠相比，SFD上的脂肪细胞更大(图4b). iNKT缺乏组和SFD组的脂肪组织巨噬细胞均显著增加，但各组的促炎（未显示）和抗炎表型相似(图4c). 与这些发现一致，Jα18缺乏和Cd1d1号机组^−/−小鼠血清甘油三酯、TNFα浓度显著升高，IL-6浓度有所升高(图4d). Jα18缺陷小鼠和Cd1d1号机组^−/−SFD组小鼠空腹血糖升高，GTT轻度受损Cd1d1号机组^−/−尽管这些差异并不显著(图4e).

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图4

iNKT阴性小鼠在SFD上有更多的促炎细胞因子和巨噬细胞

（a） 重量，Jα18^−/−，以及CD1d1型^−/−喂食SFD的小鼠随意的直到20周大（每组3例，采用事后Tukey进行单因素方差分析）。（b） 脂肪细胞大小（重量），Jα18-缺乏和CD1d1号机组^−/−SFD小鼠（每组3只）。（c） SFD上3组小鼠的巨噬细胞水平和表型。左上、巨噬细胞总数和底部M2（CD206⁺)巨噬细胞，CD206^你好（顶部闸门），CD206^洛（中间门）和CD206⁻（底门）。（d） 3组空腹血清甘油三酯（TGL）浓度（n=3，采用事后Tukey进行单因素方差分析）。体重和Jα18中的血清TNFα和IL-6浓度^−/−SFD小鼠（n=3，t试验），CD1d1号机组^−/−未测试小鼠。（e） 20周龄wt，Jα18的空腹血糖和糖耐量^−/−，以及CD1d1号机组^−/−SFD小鼠。图表显示平均值+标准差*p<0.05，**，p<0.01，***p<0.0001。

将iNKT细胞转移到肥胖Jα18缺乏小鼠中改善葡萄糖处理

为了直接验证iNKT细胞对肥胖诱导的代谢综合征的发展起保护作用的假设，我们采用5×10⁵wt肝iNKT细胞转化为肥胖小鼠（HFD治疗>8周），这些小鼠继续HFD治疗4天。5×10过户⁵以NKT缺失的T细胞或PBS作为对照。与转移T细胞或PBS相比，过继转移iNKT细胞导致体重显著减轻，脂肪细胞尺寸显著减小(图5a和b). 接受NKT细胞的小鼠与接受T细胞的鼠巨噬细胞数量相似，但促炎标记物CD11c表达较少(图S4). 接受iNKT转移或单独PBS的小鼠的食物摄入量相似（未显示）。接受iNKT细胞的小鼠的脂肪垫明显小于PBS对照组，而T细胞受体的脂肪垫大小介于PBS和iNKT细胞之间(图5c). 重要的是，接受相同数量iNKT细胞的瘦对照小鼠没有减轻体重(图5d)或低血糖(图5e)与单独的PBS相比。接受iNKT细胞的肥胖小鼠的空腹血糖显著降低(图5f)和改进的GTT(图5g)而T细胞受体再次介于PBS和iNKT受体之间。iNKT细胞移植后胰岛素敏感性改善，但T细胞移植未改善(图5h). 接下来，我们用接受NKT细胞或PBS的小鼠培养脂肪垫过夜体内并对培养脂肪垫的上清液进行阵列分析。接受NKT细胞的小鼠具有相似数量的脂肪因子抵抗素，但瘦素显著减少，脂联素显著增加。此外，血管生成素样3（angiopoietin-like 3，ANGPTL3）的生成大大减少，IL-10的生成增加，可能是由iNKT细胞产生的(图5i).

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图5

过继转移iNKT细胞可防止体重增加和脂肪细胞肥大，并逆转肥胖相关代谢紊乱

将Wt-iNKT细胞（纯度>95%）、iNKT-细胞缺失的T细胞（T）或不治疗（PBS）对照组ip注射到18–20周龄的饮食诱导肥胖小鼠体内，进行HFD治疗12周，然后继续进行HFD 4天。（a） 接受iNKT细胞（n=10）或PBS（n=6）或T细胞（n=6）的小鼠在过继移植前和移植后4天的体重差异。（b） 脂肪细胞直径接受iNKT细胞与T细胞或PBS对照的肥胖小鼠，每只小鼠2个样本，PBS和NKT的n=4，T细胞的n=3，Tukey的方差分析）。（c）iNKT移植后附睾脂肪重量（n=10）与PBS移植（n=6）或T细胞移植（n=6）和SFD上的重量进行比较（n=4）。（d）重量变化和（e）减轻NKT细胞转移的瘦体重小鼠的空腹血糖。（f）空腹血糖（ANOVA）和（g）iNKT（n=8）转移后的葡萄糖耐受性与PBS（n=4）或T细胞转移（n=四）和SFD上的wt进行比较（n=4,2向方差分析）（h）将iNKT细胞（n=4）、PBS细胞（n=4）、T细胞或体重转移到SFD（n=3）后4天，测量肥胖小鼠的胰岛素耐受性试验（使用Tukey post-hoc进行双向方差分析）。（i）继过继转移iNKT细胞3天后，收获并培养贴壁组织。抵抗素、瘦素、脂联素、血管生成素三（ANGPTL3）和白细胞介素-10的产生通过蛋白质阵列进行测量（每组2只，共2只），图表显示平均值+标准日*p<0.05，**，p<0.01，***p<0.0001。

学科

从26名连续肥胖受试者（平均年龄47岁，范围24-60岁；平均BMI 48）和18名在减肥手术18个月后到体重管理诊所就诊的患者（平均年龄46岁，范围36-54岁；平均体重指数38）中采集10 ml外周血和22名瘦健康对照组（平均年龄39岁，范围23-54岁；平均BMI 24）。所有血样均获得书面知情同意。都柏林圣文森特大学医院的伦理委员会批准了这项研究。

试剂

NIH四聚体设施（佐治亚州亚特兰大埃默里疫苗中心）提供了αGC类似物PBS-57负载或空CD1d四聚体。αGC（KRN 7000）由日本麒麟有限公司提供。免疫细胞在RPMI-1640中培养，脂肪组织衍生细胞在Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中培养，补充青霉素、链霉素（Mediatech、Manassas、VA）和5%FBS（Hyclone、Logan、UT）。

饮食和代谢研究

Wt，Jα18-缺乏和CD1d1号机组^−/−每周称重，并在HFD上监测食物摄入量。处死小鼠后，通过X射线发射DEXA扫描测量体脂含量。解剖睾丸和淋巴结后，称量整个腹部脂肪垫的重量。HFD治疗6周后，测量空腹血糖（OneTouch Ultra）和胰岛素浓度（Crystal Chem ELISA）。在葡萄糖耐量试验中，禁食（10小时）小鼠每公斤体重腹腔注射1克葡萄糖（i.p），每隔15分钟测量一次血糖水平，持续90分钟。对于胰岛素抵抗，胰岛素抵抗评估的稳态模型（HOMA-IR）计算(Matthews等人，1985年)采用：空腹血糖x空腹胰岛素/22.5。采集两个5mm肝脏样本，并在福尔马林中固定过夜，然后进行石蜡贴装和制备H&E或油红O染色载玻片，以测量脂肪肝。对于H&E和油红O染色，使用20x物镜观察活检。脂肪肝的程度通过油红O染色强度在每张玻片5个门管区附近测量。

脂肪细胞大小

通过锇和免疫组织化学方法测量脂肪细胞大小和数量。将每只小鼠20–30 mg脂肪组织的两个样品立即固定在四氧化锇（3%溶液，0.05M氯化钾）中，切成1 mm块，在室温下黑暗中培养48小时。脂肪细胞的大小和数量由400μm孔径的Beckman Coulter Multisizer III测定。脂肪组织也在福尔马林中固定过夜，然后进行石蜡贴装和准备H&E载玻片。脂肪细胞数按每个视野计算，每个样本按十个视野计算，并与每个脂肪垫的原始重量相关联。

脾脏、肝脏和脂肪组织以及人类血液制品

用PBS对异氟醚麻醉的小鼠进行全身灌注。用标准技术制备脾单细胞悬液。如前所述，在没有胶原酶消化的情况下分离肝脏MNC(Nowak等人，2009年). 简单地说，用PBS灌注肝脏，用两步Percoll梯度离心法富集绞碎和iNKT细胞。丰富的人群通常含有20-30%的iNKT细胞。仔细解剖附睾/腹股沟脂肪组织，避开淋巴结，用相反的手术刀切碎，并用胶原酶消化（Sigma，0.2 mg ml⁻¹在DMEM中，37°C，在旋转振动器上放置45分钟）。消化物通过40μm细胞过滤器过滤，并制成颗粒，以富集基质血管部分（SVF）中的脂肪相关淋巴细胞。用台盼蓝染色法测定细胞产量和活力。在肝素化管中收集10毫升静脉血，用于测量iNKT细胞水平。通过在Lymphoprep（Nycomed）上以400g的标准密度梯度离心25分钟制备外周血单核细胞。然后用补充有HEPES缓冲溶液（Invitrogen Life Technologies）和抗生素的HBSS洗涤细胞两次。将细胞颗粒重新悬浮在1ml RPMI 1640培养基中，通过溴化乙锭/吖啶橙染色评估细胞产量和存活率。将细胞悬浮液调节至1×10⁶RPMI中的细胞/ml用于染色（100μl/管）。

流式细胞术

脾细胞、LMNCs和脂肪SVF的单细胞悬浮液用抗CD16/32 mAb阻断，并用PBS-57负载或空CD1d四聚体-PE（NIH四聚体设施）和CD3（1:150稀释，eBiosciences）在4℃黑暗中染色30分钟。如前所述，用F4/80（1/100）、CD11c（1/2 200）和CD206（1/200）藻红蛋白结合抗体标记巨噬细胞，以区分SVF中M1和M2巨噬细胞(Fujisaka等人，2009年). 对于人类外周血，使用小鼠抗人CD3结合iNKT TCR（6B11）和等型匹配对照（BD Biosciences）。iNKT细胞也用来自Coulter Immunotech（法国马赛）的Vα24和Vβ11 TCR链染色。细胞在1%PFA中清洗和固定，并用LSR II流式细胞仪（BD Bioscience）和FlowJo和Kaluza软件采集。

iNKT细胞分离和过继转移

用CD1d四聚体-PE对肝单个核细胞进行染色，并使用FacsArial II（加利福尼亚州Becton Dickinson）将其分选至>95%纯度。纯化iNKT细胞（5×10⁵)将小鼠腹腔注射到服用HFD 8周的Jα18缺陷小鼠体内。4天后分析代谢参数，处死小鼠，称重脂肪组织，并用锇和免疫组织化学方法检测脂肪细胞。

体内iNKT细胞的刺激和细胞内细胞因子染色

在代谢分析时，小鼠腹腔注射2μgαGG或单独载体，并在5小时或4天后处死小鼠。如前所述，获得脾细胞、肝单核细胞和脂肪组织间充质干细胞组分（SVF）的单细胞悬浮液，但所有培养基中均含有Brefeldin A。首先，用细胞表面标记的抗CD3单克隆抗体和载αGC的CD1d四聚体对脾细胞或肝单核细胞的单细胞悬液进行染色。然后，根据制造商的说明，对细胞进行固定、渗透和细胞内IL-4、IL-10和IFN-γ染色。为了在αGC治疗之前中和细胞因子，在注射αGC之前，静脉注射抗IL-4（11B11）或抗IL-10（JES5-2A5）。

我们感谢B.Kahn教授、Odile Peroni博士和波士顿代谢生理学中心在DEXA成像和脂肪细胞测量方面的帮助。我们感谢哈佛大学公共卫生学院的Gokhan Hotamisligil教授、哈佛医学院的Ulrich von Andrian教授进行了富有成果的讨论，并感谢Michael Brenner教授对这篇论文的友好帮助和讨论。我们感谢F.Scheuplein博士和S.Jordan女士对老鼠的护理。我们还感谢BIDMC流式细胞术核心，特别是John Tigges，以及BIDMC组织学核心，尤其是S.White女士和LH博士。Ang.本研究得到了NIH R01 DK066917、U19 AI066313（MAE）、美国国防部W81XWH-09-1-0156（SPB）、UNESCO-L’Oreal Fellowship（LL）、欧洲委员会玛丽·居里（LL）研究员、爱尔兰科学基金会（CO'F）和爱尔兰健康研究委员会（LL、AEH、DOS）的支持。Balk和Exley博士与NKT Therapeutics Inc.有咨询关系。