癌症精准医疗与下一代功能诊断

摘要

越来越多安全有效的新型癌症治疗方法以特定信号和亚细胞机制为靶点；因此，将这些疗法与个别患者相匹配的压力越来越大。尽管存在广泛的表观遗传改变、谱系特异性驱动因素和非肿瘤驱动的脆弱性，但目前大多数将患者与治疗相匹配的努力都依赖于分子技术，通常是基因组技术，其基础是癌症就像罕见的遗传病一样(方框1). 新一代测序（NGS）技术的显著进步使癌症生物学家能够识别患者肿瘤中的数万个突变^1,2，彻底改变了我们对癌症起源的理解。现在已经对数千个癌症基因组进行了测序，我们正在达到仅发生在少数患者肿瘤中的突变的“长尾”¹这表明，大多数影响癌症患者群体的“低垂果子”驱动基因突变可能已经被发现，这些癌症患者的数量足以证明药物研发工作的合理性。即使考虑到已知的频繁突变基因，在慢性期BCR–ABL突变的慢性粒细胞白血病（CML）患者中，治疗配对的临床结果尚未复制伊马替尼>90%的有效率和长期控制^三,4这开启了基因组癌症时代。此外，只有一小部分（<10%）的患者通过了临床验证和美国食品和药物管理局（FDA）批准的与突变匹配的治疗⁵我们预计，随着时间的推移，这些新发现的突变中的一些将得到功能注释，并提供生物标记策略来指导治疗。然而，我们对肿瘤数千种突变的功能后果知之甚少，这使得大多数患者需要新的补充策略来将其肿瘤与适当的治疗相匹配。

尽管由于在其他疾病领域取得的成功，罕见的遗传病范式提供了一个吸引人的叙事来应用于癌症⁶癌症和免疫性疾病与罕见疾病截然不同，因为它们是由复制驱动的微观进化过程。一个微进化系统（免疫系统）对抗另一个（肿瘤）的部署可能是免疫肿瘤学方法有时在少数患者中产生持久长期缓解的原因^7,8然而，基因组和大多数传统病理学技术是描述性的和静态的，它们代表了由死亡癌细胞确定的肿瘤发展历史的总和。因此，尽管NGS在某些患者亚群中具有预测能力，但我们认为有必要使用其他诊断方法来补充NGS，从而指导更多患者的治疗选择。

一种有吸引力的动态方法是功能测试，它可以评估肿瘤细胞当前对干预的脆弱性。在这里，我们扩大了“功能性”筛查的定义，包括任何监测活肿瘤状态并用于指导患者治疗的测试，例如测量术后活检中的肿瘤细胞死亡体外药物接触。这类测试在传染病设置中作为“精确药物”常规使用，以选择适合患者感染的抗生素⁹然而，在癌症方面，尽管这些检测方法已在研究中使用了半个多世纪，但由于缺乏足够的临床实用性证据，它们的广泛采用受到了挑战。尽管对旧的分析技术的失败有几种解释体外对肿瘤学家和患者来说，患者样本的筛选仍然很有吸引力¹⁰，但基本上未经测试。我们描述了功能测试特定领域的最新技术进展，包括肿瘤操作和培养，以及用于测量抗肿瘤药物反应的分析。这些“下一代”功能测试(图1)保证进一步的临床前和临床测试，为肿瘤学家提供预测性、可操作的信息。

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图1

下一代癌症精确医学方法

正如文中所讨论的，已经为体外测定活肿瘤细胞对药物治疗的反应。这些包括（从图的顶部到底部排列）基于靶点和路径的方法、直接细胞毒性（肿瘤细胞数量减少）和体内模型。所有方法最终都会建议（或反对）对晚期癌症患者进行个性化的特定治疗。对于小肿瘤样本，根据方法体外在进行功能测量之前，可能需要进行扩展。可能还需要结合这些功能方法。结合基因测序和免疫分析，功能诊断方法是一种综合方法的一部分，可以精确匹配患者的新疗法。CR，条件重编程；循环肿瘤细胞；荧光激活细胞分选；MTT，代谢四氮唑染料；PDX，患者衍生异种移植物。动态BCL-2同源域3（BH3）剖析（DBP）图经REF许可改编。81爱思唯尔。

第一代功能诊断

为了正确预测复杂系统（如癌症）的行为，需要初始条件（基因、转录物、蛋白质、代谢物等）和该系统各组成部分在所有细胞状态下的所有相互作用（例如，基因-RNA、RNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用）^11,12然而，基线基因组信息仅提供了多种癌症生态系统的初始条件，这是对该细胞基因组在几十年癌症发展过程中遭受的所有侮辱的“考古”探索(方框1). 尽管在理解癌细胞成分之间的相互作用方面正在取得进展，例如蛋白质-蛋白质相互作用¹³和转录谱对干扰的反应¹⁴-我们对这个系统只有初步的了解，才能预测新的结果。然而，复杂系统的扰动会产生更多关于此类网络的组织和行为的信息，因此有理由使用功能测试。通过重复活检或监测循环肿瘤DNA的变化，在药物治疗前后获得基因组信息的新努力^15–17他们已经深入了解了对治疗产生耐药性的机制，但不一定能为单个患者带来直接、可行的结果。例如，在靶向治疗后识别靶点中的新热点突变可能仍需要多年的药物研发才能针对该突变靶点开发新的治疗方法。相比之下，直接的活细胞微扰可以直接揭示给定的样本是否对可立即用于临床的药物敏感。

直观地说，功能测试是指患者的肿瘤活检暴露于药物中。肿瘤反应通常通过细胞死亡来衡量，然后用于指导治疗选择。”这些测试的第一代版本在过去30-40年中得到了开发和深入研究，可分为多个类别；对这些旧测试的全面回顾超出了本文的范围，并在最近的评论中进行了很好的总结^18–20其中最早的包括人类肿瘤克隆形成试验（HTCA）²¹差异染色细胞毒性（DiSC）试验²²、极端耐药试验（EDRA）²³，ChemoFx分析（Helomics，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）²⁴和肾下包膜试验（SRCA）²⁵其中一些方案，如HTCA和ChemoFx，可以培养患者的肿瘤细胞，直到生成均匀的肿瘤集落或细胞系；然后使用细胞计数、代谢四氮唑染料（MTT）或基于全细胞ATP内容的细胞数读数等分析方法，在暴露于化疗药物后测试这些细胞的活性。其他方案直接测试化疗药物对患者在药物暴露3-7天后活检中肿瘤细胞和基质细胞的异质混合物的影响。大多数研究都局限于传统的细胞毒性化疗药物，很少在前瞻性、对照性、随机试验中对这些较老的试验进行评估，这些试验足以解决检测是否改善患者预后这一核心问题。其中一项针对卵巢癌的试验在组织药物暴露6天后使用基于ATP的检测来指导患者进行一系列细胞毒性化学治疗，并且在无进展生存率方面没有统计学意义的改善²⁶毫不奇怪，最近对支持这些化疗敏感性和反应分析的临床数据的综合审查确定，没有足够的结论性研究建议常规使用这些分析^18–20然而，尽管分析、药物和研究设计存在异质性，但值得注意的是，这些研究中的大多数在过去几十年中都显示出预测化疗耐药性的趋势。然而，这些测试都没有成为标准的护理，因为该领域已经将注意力转移到肿瘤发生的遗传原因上，作为治疗选择的途径。

肿瘤治疗的新方法

患者样本的扰动需要患者衍生的活肿瘤细胞，但体外实体肿瘤的培养和操作可能具有挑战性。在典型培养基中的细胞培养皿上使用传统的2D培养法从单个患者身上生成用于功能测试的稳定细胞系是费力的，通常不成功。这种同质细胞系通常在基因型水平（例如突变和表达谱）上具有与亲本肿瘤不同的特性^27,28和表型水平（生长更快，对化疗的敏感性增加）；特别是，这些细胞系已经失去了患者肿瘤的功能和基因型异质性，以及支持肿瘤生长的肿瘤-基质相互作用。例如，由于小的核心活检，从患者身上获得的少量活组织使这些影响更加复杂。因此，在以前的方法中，获得足够的功能测试单元数是一个主要障碍。

现场功能诊断

作为否体外该方法可以精确地匹配人类肿瘤的背景，另一种方法是使用新型设备直接测试患者体内固体肿瘤的微剂量药物效果。最近发表了两份报告，描述了不同的微剂量技术^52,53在一项研究中，使用微针注射装置（CIVO；Presage Biosciences，Seattle，Washington，USA）在注射24–72小时后将异种移植瘤从动物体内取出进行组织化学分析，包括测量毒性和信号通路活性，该装置可将小剂量药物直接注入肿瘤。注射肿瘤的细胞毒性反应反映了全身给药的反应。该设备被进一步用于人类和患有可触及淋巴瘤的狗的研究中，在这些研究中，该程序具有良好的耐受性⁵²在第二项研究中，一种小装置含有多达16种不同药物的缓释库⁵³使用活检针进行植入，设备被留下就地在肿瘤中放置24小时，然后取回肿瘤并测量药物反应。通过小鼠异种移植，作者观察到每个贮存器周围细胞的凋亡指数与全身肿瘤对一系列细胞毒性化学疗法的反应之间存在着强烈的相关性。

在临床护理用此类设备的开发过程中，存在一些潜在的挑战。值得注意的是，它们的使用仅限于特定大小的可触及实体瘤，并且需要额外的、潜在危险的程序来从药物暴露后的患者身上取回肿瘤。此外，控制、标准化和分析设备中的药物扩散，并将绝对和相对反应与已知药物的药代动力学相关联，可能具有挑战性，特别是考虑到肿瘤内流体动力压力和肿瘤-基质混合物的患者间异质性。然而，这两种设备都显示了药物敏感性测试在预测系统治疗反应方面的价值。甚至在临床验证其诊断能力之前，它们最直接的用途可能是在临床前药物发现研究中验证多种新疗法体内同时，随后进行了实验疗法的早期临床药效学验证研究。

功能测试用鼠标模型

另一种可能更准确地模拟内源性肿瘤环境的技术是将患者衍生异种移植（PDX）小鼠模型作为患者肿瘤药物测试的“化身”。PDX模型，其中患者活检材料植入皮下或原位并扩张体内，具有保留患者肿瘤的一些组织学、基因表达和体遗传学的理论优势⁵⁴虽然PDX模型正在成为药物发现药理学工具箱中用于测试疗效的标准，但它们也被建议作为选择患者治疗方法的途径⁵⁵在这些PDX方法中，对具有以下特征的小鼠进行了可行的治疗试验：体内-患者肿瘤扩大。然后，建议将导致肿瘤退化或生长减慢的药物作为患者的治疗方法。尽管迄今为止的数据仅限于轶事案例研究或小型非随机试验，但一些PDX平台的初步数据很有希望，PDX导向治疗后的有效率为81-88%^56,57.

“功能筛查将成为新兴综合诊断方法的一部分，该方法包括传统病理学技术和基因测序。”

一些实际挑战与患者肿瘤的异种移植小鼠模型有关。第一个挑战是在足够多的小鼠中产生足够的肿瘤物质以测试一种或多种方案所需的时间；这通常需要6-8个月或更长时间^56–58第二，携带单个患者肿瘤的动物群实际上仅限于测试几种药物。第三，在小鼠组中产生足够数量的细胞以测试方案所需的额外时间对患者模型中各种肿瘤克隆的表现有明显的影响。例如，在一项针对乳腺癌PDX小鼠模型的大型研究中，所有模型都显示出在肿瘤生长过程中的选择，从适度漂移到显著的克隆选择，甚至在第一次小鼠传代中也是如此⁵⁹另一项更有限的研究同样表明，从患者肿瘤的全基因组测序中发现的突变与从匹配的二代PDX模型中发现的变异之间存在大量差异⁵⁰最后，在免疫缺陷小鼠中建立PDX模型，减少模型与原始肿瘤环境的相似性，包括人类基质成分和免疫细胞相互作用。尽管关于此类PDX模型的数据很有希望，但还需要进行更大规模的前瞻性随机试验，以获得PDX模型作为更广泛患者治疗选择策略的更有力证据。

白血病功能检测

上述大多数新方法都试图解决实体肿瘤的生存、生长和测量等特别棘手的挑战。相反，白血病和其他血液学恶性肿瘤代表了临床功能筛查的“最低悬而未决的成果”，因为从简单的抽血或骨髓活检中很容易获得单细胞悬浮液中的大量活的恶性细胞。在过去几年里，一些研究小组已经开始测试先进的高通量方法来测量这种白血病反应体外以及这些反应与患者预后的相关性。

例如，Tyner等.⁶⁰已经开发了一种用于患者样本的高通量筛选方法。最初设计用于在原发肿瘤样本中进行基于RNA干扰的靶点识别，研究人员利用该系统对150多个原发性患者白血病样本进行了筛选，包括临床相关靶点治疗⁶¹通过叠加抑制剂靶点分布图，对多种药物导致细胞杀伤增加的样品的共同靶点进行三角剖分，证实了这种高通量技术在患者样本中确定的抑制剂活性的临床有效性。因此，突变型Fms样酪氨酸激酶3内串联重复（FLT3-ITD）阳性的急性髓性白血病（AML）患者的细胞被已知靶向FLT3的药物杀死，BCR-ABL阳性CML患者的细胞则被靶向ABL重叠的药物杀死。在一个案例研究中，一名患者接受了基于体外响应配置文件。引人注目的是体外患者后续样本对索拉非尼的反应反映了临床上对索拉菲尼的最初敏感性和随后的耐药性，而体外对另一种激酶抑制剂舒尼替尼的反应没有改变，反映了索拉非尼的特异性耐药效应。值得注意的是，每名患者使用的最特异、最有效的药物各不相同，在许多情况下，FDA批准的治疗方法被确定为一种新的非标签适应症。该平台在儿童白血病的病例研究中得到了进一步验证⁶²以及在实体肿瘤中，从较大的活检中获得足够的细胞，包括肾细胞癌的病例研究⁶³还有一个犬骨肉瘤⁶⁴该系统的临床实用性目前正在复发性AML的前瞻性临床试验中进行测试(临床试验.gov标识符：{“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT01620216”，“term_id”：“ncT016202016”}}NCT01620216号).

Wennerberg及其同事使用类似的筛选分析⁶⁵已开发出高吞吐量体外在患者活组织检查中测试靶向治疗，包括单独治疗和联合治疗。在一个队列中，在获得28份AML患者骨髓活检样本后，作者开发了一个药物敏感性和耐药性测试（DSRT）平台，该平台检测了多剂量187种药物在72小时暴露后对患者细胞活力的影响⁶⁵为了对药物反应进行专门评分，开发了一种算法（药物敏感性评分（DSS）），该算法集成了单个患者和一组对照样品之间的剂量-反应曲线差异⁶⁶值得注意的是，该研究发现了多种未经批准用于AML但对杀伤患者AML细胞有效的药物。尽管可以通过分层聚类将样本分为主要的易感组，但最有效的药物因患者而异，强调了个性化药物选择的必要性。药物反应也可能与已知突变群相关，例如FLT3突变AML对FLT3抑制剂的敏感性，从而验证了这一发现体外反应与已知的肿瘤生物学相匹配。最近，该方法被用于确定血管内皮生长因子受体（VEGFR）抑制剂阿西替尼的一种新的非靶向效应：具体来说，它抑制患者样本中的T315I门控突变BCR–ABL，研究发现患者对该药物的非标签应用有反应⁶⁷.

在处理血液系统恶性肿瘤，尤其是AML的样本时，面临的一个挑战是爆发人群的脆弱性体外操纵可以迅速导致细胞死亡，与药物作用无关。此外，许多患者，尤其是那些反复接受细胞毒治疗的患者，可能患有骨髓细胞过少，这限制了可用于检测的细胞数量。最近，AML细胞的生存条件和检测前扩增条件得到了确定和发展，以探讨低剂量地西他滨对原代AML细胞产生的影响⁶⁸类似于实体肿瘤的CR，这些技术利用饲养层和富含生长因子的培养基为短期扩张提供合适的条件。

尽管离体在血液恶性肿瘤和药物发现的基本生物学机制研究中，对患者样本的检测现已成为常规（例如，最近对30例慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者进行了检测，发现卡非佐米布和ibrutinib联合治疗对这些患者有效⁶⁹)，其诊断潜力尚未完全实现。这些最近的研究表明，在不了解潜在生物学或突变的情况下，这种直接的患者检测可能会给患者带来益处，这补充了临床场景，在这些场景中，发现治疗与特定突变匹配时会产生益处。

的新分析体外肿瘤反应

所有功能测定最终都必须以某种方法来检测药物效果。上述大多数研究使用自动或手动测量细胞终点，如细胞内ATP浓度、细胞计数或增殖或凋亡的特定细胞标记物。这些终点非常引人注目，因为它们测试了体外化疗敏感性分析：测量可能转化为患者治疗的细胞杀伤。然而，大多数测量技术需要将肿瘤样品与药物孵育数天，以观察这种表型效应，在此期间，肿瘤细胞处于细胞培养环境中，这改变了基质和多维相互作用、氧张力、温度、代谢物和其他参数。最近，已经描述了几种可用于测量更具体分子事件的替代分析体外.

BH3剖面

大多数靶向治疗似乎通过最终的线粒体死亡途径有效⁷⁷。以这种常见的作用机制为出发点，我们最近描述了一种更快速的检测体外几个小时内出现药物反应，可能消除长期用药的需要离体培养，这是第一代药敏试验的主要障碍。此前，我们开发了一个测量患者肿瘤“死亡阈值”的系统体外使用称为BCL-2同源域3（BH3）分析的过程⁷⁸通过将渗透性肿瘤细胞暴露于合成的BH3结构域肽并测量线粒体通透性，我们观察到一些患者的细胞更有可能失去线粒体电位；这些患者患有多种类型的白血病和实体瘤，对细胞毒化疗更敏感^79,80我们最近描述了对这种“静态BH3剖面”的改进，称为“动态BH3剖面（DBP）”⁸¹：在DBP中，患者细胞首先暴露体外给药16-24小时，然后进行BH3分析(图2). 线粒体启动使用传统的生存能力终点检测预测最终的药物反应，这些检测在数天后在一系列实体和血液肿瘤细胞系中进行，ROC的AUC为0.89。然而，更重要的是，DBP结果预测患者对药物的反应：CML患者样本中伊马替尼诱导的线粒体启动与伊马替尼临床反应相关，卵巢癌患者的样本显示，顺铂导致线粒体启动增加，这表明患者的无进展生存率显著提高。有趣的是，一系列分子靶向信号转导抑制剂和细胞毒化疗的结果是一致的。因此，DBP可能适用于目前使用的大多数抗癌药物，无论是常规药物还是靶向药物。DBP可以预测的所有药物类别仍需在更大的患者样本队列中进行充分探索，DBP在临床决策中的效用需要临床测试。

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图2

动态BH3分析可以预测患者对癌症治疗的反应

动态BCL-2同源域3（BH3）分析是一种更新的、更精确的分子检测方法，可用于离体功能筛选。患者的活检材料分散（对于实体肿瘤），并短暂（16-24小时）暴露于潜在的药物治疗中。培养后，细胞被渗透并暴露于含BH3-结构域的肽。测量线粒体外膜的通透性，生成线粒体极化的动力学轨迹（中心图）。在该分析中，改变凋亡阈值的药物治疗使阴性对照处理样品和药物处理样品的曲线下动力学示踪面积（AUC）之间的差异大幅增加。这种差异产生了凋亡阈值的“Δ%启动”指标（左下图）。通过比较对照组和药物治疗组样本的这一指标，可以选择优先导致凋亡启动的药物治疗（右下图）。虚线表示有效性阈值。经REF许可改编。81爱思唯尔。

这些技术之所以引人注目，是因为它们将对活细胞的复杂观察减少到定义明确且稳健的分子相互作用。需要与患者结果进行关联，以确认患者活检中这些过度活跃的目标和途径是真正的脆弱性或“驱动因素”。在过去几年中，还描述了许多其他新的检测方法，这些方法可以从患者活组织检查中提供功能读数，包括用于测量阻抗谱的方法体外活黑色素瘤标本片段对化疗的反应⁸²和代谢输出，如耗氧量⁸³与增殖、活性和凋亡的测量类似，这些分析需要严格评估其与患者预后预测的相关性，并进行比较，以确定每个分析的优缺点，而不仅仅是试剂、时间和分析方面的技术差异。

功能分析临床验证

下一代功能测试方法旨在帮助指导肿瘤学家在实践中为患者选择最佳治疗方案，并作为实验疗法临床试验的分层测试。与所有预测性生物标记物一样，包括使用NGS的单基因和多基因面板，此类测试将需要对其分析有效性、临床有效性和临床实用性进行严格评估，以证明其对患者的价值并在临床上采用^84,85这些测试参数在分子技术中得到了广泛的考虑，但许多相同的标准可以应用于下一代功能诊断，包括严格的质量控制和质量保证措施，测试结果与临床反应的显著而有意义的相关性，以及最终的随机，临床实用性对照试验(方框2). 这些标准对于明确这些功能分析的监管和报销前景至关重要，其中大多数可能在集中测试实验室中作为实验室开发测试（LDT）进行。在美国，长期以来，LDT一直由医疗保险和医疗补助服务中心（CMS）根据《临床实验室改进修正案》（CLIA）进行监管，因为FDA行使了执法自由裁量权，在临床使用前不需要正式批准。然而，该机构最近宣布了一个建议框架，在该框架中，某些最不发达国家，尤其是那些被归类为高风险的国家，需要获得正式批准⁸⁶美国癌症研究协会确认的立场⁸⁵。考虑到功能分析直接推荐患者设计的治疗方案，如果采用该指南，则很可能会对其进行调整。因此，需要设计良好的临床试验来证明功能测试的临床有效性和实用性，然后才能将其推向更广泛的市场。

结论

功能测试通过在没有药物活性机制先验知识的情况下提供患者细胞的反应来补充基因测序。鉴于肿瘤学功能测试的直观和令人信服的理论基础，近年来人们对下一代功能诊断重新产生兴趣也就不足为奇了。与任何新的临床生物标志物一样，这些检测将需要临床验证，以确保这些检测能够为患者提供持久的益处，从而在常规肿瘤治疗中得到采用。我们认为，未来3-5年的此类试验将最终确定具体的临床场景，在这些场景中，下一代功能测试可以帮助指导肿瘤学家为患者选择正确的治疗方法。因此，此类测试还可以防止不必要地使用患者可能耐药的治疗药物，从而降低毒性和成本。

目前，基于体细胞癌突变可以建议治疗的希望，正在使用NGS等分子方法。我们认为，对于大多数癌症患者来说，仅此信息最终是有限的。功能筛查将成为新兴综合诊断方法的一部分，该方法包括传统病理学技术和基因测序。作为这两种方法的补充，研究患者肿瘤滤过淋巴细胞的表型和功能反应，以及肿瘤抗原预测和整体突变负荷，将用于帮助为免疫肿瘤学治疗选择提供建议⁸⁷在这种模式下，在治疗前将对单个患者的活检使用多种诊断技术，以便从大量单一和联合用药方案中实现最佳的“个性化”选择。只有通过这样一个全面的图像，数百种靶向治疗和免疫治疗的新兴队列才能与癌症患者个体精确匹配。

致谢

脚注

参与者信息

亚当·弗里德曼，马萨诸塞州总医院癌症中心，哈佛医学院，55 Fruit Street，Boston，Massachusetts 02114，USA。

安东尼·勒泰，美国马萨诸塞州波士顿市梅耶布鲁克林大道440号哈佛医学院达纳-法伯癌症研究所，邮编：02215。

David E.Fisher，马萨诸塞州波士顿水果街55号哈佛医学院马萨诸塞州总医院癌症中心，邮编02114。美国马萨诸塞州查尔斯敦东13街149号马萨诸塞总医院皮肤病和皮肤生物研究中心，邮编：02129。

Keith T.Flaherty，马萨诸塞州总医院癌症中心，哈佛医学院，55 Fruit Street，Boston，Massachusetts 02114，USA。

参考文献