聚焦于肝瘢痕：肝纤维化细胞特异性靶向治疗的最新进展

摘要

介绍

肝病是全球发病率和死亡率不断上升的原因。最近的数据显示，欧盟约有2900万人患有慢性肝病¹无论病因如何，所有慢性肝病如果不加以治疗，都可能导致肝纤维化，最终导致肝硬化。这种细胞外基质（ECM）对重复性损伤的反应是基本伤口愈合过程的一部分；然而，如果不加以控制，越来越严重的纤维化会导致组织结构紊乱，最终导致器官衰竭。目前，没有欧洲药品管理局（EMEA）或美国食品和药物管理局（FDA）批准的抗纤维化疗法可用于治疗肝纤维化患者。因此，我们必须继续更好地了解肝纤维化的驱动机制，以促进和加速新的合理、高靶向治疗的发展。

在过去的30年里，我们对肝纤维化的细胞和分子机制的理解有了显著提高。人们普遍认为，肌成纤维细胞是肝纤维化过程中ECM蛋白的主要来源。此外，转基因小鼠技术的快速发展使得肝肌成纤维细胞的起源得到了广泛的研究，而常驻肝星状细胞（HSC）被认为是主要来源^2,三肝纤维化现在也被认为是一个动态的、潜在的可逆过程^4,5高度成功的乙型和丙型肝炎抗病毒治疗进一步突出了人类肝脏的纤维化可逆性和潜在的再生能力⁴这篇综述将重点介绍我们对肝纤维化理解的一些最新进展，以及该领域的基础科学研究如何开始推动向新型靶向治疗的转化。

肌成纤维细胞：肝纤维化的主要治疗靶点

肌成纤维细胞是多种器官和疾病状态下病理性ECM的关键来源，肝脏也不例外^2,6因此，大量研究集中于试图阐明肝纤维化中肌成纤维细胞的起源，以及破译负责肌成纤维纤维细胞激活、失活和消除的关键信号通路，以确定潜在的抗纤维化治疗靶点。

在肝纤维化期间，许多不同的细胞群可能会形成肌成纤维细胞池。这些细胞包括HSC、门静脉成纤维细胞（PFs）、间皮细胞、骨髓源性间充质细胞和纤维细胞^7–10(图1). HSC对基质分泌型肌成纤维细胞的激活是肝瘢痕组织形成的关键过程。最近的研究表明，HSC是肌成纤维细胞池中主要的间充质干细胞，与肝脏疾病的病因无关⁷使用卵磷脂-视黄醇酰基转移酶（Lrat）-Cre小鼠（标记99%的HSC），Mederacke及其同事发现HSC对中毒性、胆汁淤积性和脂肪性肝病模型中的肌成纤维细胞库有显著贡献⁷有趣的是，在胆汁淤积性肝损伤的研究中，发现了一种可能在门脉周围肝纤维化中具有特殊功能的独特PF样细胞群⁷.

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图1。

肝肌成纤维细胞的可能起源和命运。

PFs在肝肌成纤维细胞池中的识别和作用尚不清楚，这是一个活跃的研究领域。鉴于门脉周围的位置，PF可能是与门脉周围纤维化相关的肌成纤维细胞池的主要贡献者，许多研究表明PF是胆汁淤积性损伤早期肌成纤维纤维细胞的主要来源^8,11,12岩崎等。据报道，PFs在胆道损伤开始时对70%以上的肌成纤维细胞起作用⁸这项工作和其他研究将为PF特异性标记的鉴定提供一个有用的平台，促进转基因系统的发展，用于谱系追踪和在广泛的肝病小鼠模型中深入询问PF功能。此外，流式细胞术抗体等工具的产生应允许从纤维化人类肝组织中对PF进行细胞特异性分类。

最近，肝脏中第三个常驻间充质细胞群体作为肌成纤维细胞的潜在来源引起了人们的兴趣。锂等。发现肝损伤后，间皮细胞可以通过间皮到间充质的转变（称为MMT）产生HSC和肌成纤维细胞⁹使用诱导性Wilms Tumour 1 Cre小鼠（标记14.5%的间皮细胞）进行的命运追踪研究表明，在纤维化过程中，肝表面附近的许多HSC和肌成纤维细胞来源于间皮细胞亚群⁹.

除了旨在确定肝肌成纤维细胞起源和肌成纤维纤维细胞激活机制的研究外^13,14最近的研究也集中于肌成纤维细胞失活和消除的途径。肝肌成纤维细胞的可能命运包括凋亡、衰老和重新编程到失活状态(图1)^15–18最近研究肝肌成纤维细胞重编程的数据发现，40-50%的肌成纤维纤维细胞逃避凋亡并恢复到静止状态，下调纤维化基因^15,16有趣的是，这两项研究都强调，与静止的HSC相比，恢复的HSC与静止的hsC不同，并被激发，对进一步的纤维生成刺激具有更高的反应性^15,16靶向和促进肌成纤维细胞逆转的可能性是一个令人兴奋的前景，因为它可以在对间充质细胞调节的稳态和正常组织修复的潜在破坏最小的情况下治疗肝纤维化。

肝纤维化背景下的药物靶向性

在开发有效治疗肝纤维化，甚至任何形式的器官纤维化的方法中，最重要的是能够针对患病器官和前携带效应细胞。因此，在过去几年里，纤维化领域越来越多的研究旨在开发针对肝纤维化的器官和/或细胞特异性治疗。

药物靶向肝脏有着悠久的历史，主要集中在药物靶向肝细胞。方法包括熊去氧胆酸的附着（几乎完全由肝细胞代谢）和去唾液酸糖蛋白受体介导的靶向作用（主要在肝细胞上表达，在肝外细胞上最少表达）^19,20将一氧化氮释放衍生物与熊去氧胆酸偶联，可以在肝脏内靶向释放，但不能专门靶向主要负责增加门静脉压力的细胞¹⁹其他方法包括使用小的类脂质纳米粒，这些纳米粒优先由肝脏摄取。类脂质纳米粒已被成功用于输送小干扰RNA（siRNA）来对抗肝脏中的前胶原α1（I）基因，最终导致胶原沉积减少²¹同样，这种方法不是效应细胞特异性的，因为纳米粒子比HSC更容易被Kupffer细胞吞噬²¹因此，量身定制的抗纤维化治疗的主要目标包括发现器官特异性和细胞特异性肌成纤维细胞标志物，这将允许将抗纤维化治疗靶向递送到患病器官中的主要促瘢痕形成细胞群。

最近，在鉴定HSC上的靶向标记物方面取得了重大进展。理想情况下，标记物只有在HSC激活为肌成纤维细胞表型时才会上调。血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）是在此背景下广泛研究的一个标记物。在肝纤维化形成过程中，HSC转分化为肌成纤维细胞并上调PDGFRβ的表达，使其成为优先靶向间充质瘢痕形成细胞的候选细胞¹³利用PDGFRβ作为直接向瘢痕形成细胞池提供抗纤维化治疗的潜在手段，可能会为肝纤维化的治疗提供更精细和更有针对性的方法。然而，还必须考虑到PDGFRβ是间充质细胞的广泛标记物，包括周细胞、血管平滑肌细胞和多器官中的常驻成纤维细胞。因此，纤维化研究界必须努力发现肌成纤维细胞标记物和治疗靶点，这些标记物和靶点对于每个不同的器官和疾病状态都是独一无二的。最近一项优雅的研究进一步明确了哪种间充质细胞群可能是肌成纤维细胞形成和瘢痕形成的原因。克拉曼等。研究了多个器官纤维化模型中的Gli1阳性细胞，发现这些细胞是损伤后形成肌成纤维细胞谱系的血管周细胞的一个子集²²这些血管周围和胆道周围Gli1阳性细胞仅构成肝脏中PDGFRβ阳性细胞的一小部分，但在肝纤维化中约39%的间质α-平滑肌抗体（α-SMA）阳性细胞²²此外，Gli1阳性细胞在其他器官的纤维化中起着关键作用。在肾脏和心脏损伤模型中，这些细胞的消融可将纤维化减少50%²²一种基于信息学的方法也被用于识别唯一表达的HSC基因²³原钙粘蛋白7（protocadherin 7）包含在已鉴定的基因中，是一种非常有希望的HSC追踪、靶向和分离候选标记物。有趣的是，该研究还表明，患者HSC特征基因的表达增加可以预测临床结果，包括失代偿、Child-Pugh分级进展和总生存率。与单独使用临床因素相比，将这些预测与临床因素相结合可以获得更准确的预测²³理想的情况是，未来的抗纤维化治疗将针对间充质血统中最具原纤维细胞亚群，确定“原携带”亚群很可能成为未来几年纤维化研究的主要重点。

肝纤维化的药物输送途径

据报道，有许多不同的药物传递方法专门针对HSC，如病毒载体、脂质体和基于蛋白质的策略(表1). 16年前，首次报道了选择性靶向HSC的载体甘露糖6-磷酸修饰白蛋白²⁴该载体的特征表明其优先结合活化的HSC和受体介导的内吞作用，使其成为药物输送的一个有吸引力的选择²⁵许多研究已经利用该系统成功地将激酶抑制剂、受体阻滞剂和脂质体靶向动物和人类HSC^26–28使用该系统靶向输送Rho激酶抑制剂可减少肝纤维化期间胶原沉积并降低门脉高压，但不会导致与全身抑制相关的严重低血压^26,29此外，据报道，血管紧张素1型受体阻滞剂的短期治疗在靶向使用该载体时对抑制晚期纤维化更有效²⁷虽然前景看好，但甘露糖6-磷酸修饰白蛋白系统的翻译潜力可能受到合成这些蛋白质所需的复杂过程的限制，使其在临床上不太可行³⁰此外，由于BSA的高分子量，使用甘露糖6-磷酸牛血清白蛋白（BSA）载体长期输送寡核苷酸与潜在的免疫反应有关³¹这导致用抵消免疫原性反应的共聚物取代BSA³¹有报道称，甘露糖6-磷酸载体并非完全针对HSC^28,32考虑到与甘露糖6-磷酸载体相关的负电荷，有人认为它们也可能是清除剂受体的靶点，例如在库普弗细胞和内皮细胞上发现的清除剂²⁸.

另一种针对HSC的药物传递方法涉及到肽修饰蛋白的偶联，该蛋白旨在识别靶细胞上的特定受体。这些药物通常被认为更容易生产，免疫原性更低，使其成为更具吸引力的药物靶向选择³⁰然而，与肽修饰蛋白相关的系统稳定性差是一个需要解决的潜在障碍³⁰初步研究成功地用含有多个氨基酸序列Arg-Gly-Asp（RGD）的环肽修饰了人血清白蛋白，以靶向表达胶原VI型受体的HSC³³此后，含有识别VI型胶原受体的RGD附着位点的肽已成功用于肝纤维化模型，以将载干扰素-α1b的脂质体输送至HSC，但肝外摄取有限。此外，与非靶向治疗相比，靶向注射干扰素-α1b显著降低了肝纤维化³⁴.通过产生PDGFRβ识别肽，HSC也被成功靶向³⁵由于负责受体结合的氨基酸序列在大鼠和人类中是相同的，这种新设计的载体也可能具有翻译潜力³⁵该载体已被用于传递干扰素-γ信号肽，从而显著抑制早期和已确立的肝纤维化，而不会表现出任何非靶向效应^36,37自最初开发以来，PDGFRβ识别肽递送分子发生了改变。Bansal及其同事证明，通过从单环结合肽转换为双环肽，可以与二聚体PDGFRβ进行更合适的相互作用。这也减少了载体的大小和复杂性，使其可能更适合临床用药³⁶此外，添加聚乙二醇连接物可延长血浆半衰期和稳定性，并为与PDGFRβ的适当相互作用提供构象灵活性³⁶.

HSC靶向性的另一种方法是将脂质体与维生素A偶联，维生素A被静止和活化的HSC主动摄取³⁸.佐藤等。据报道，siRNA脂质体可以通过这种方法靶向HSC，并抑制肌成纤维细胞的胶原沉积³⁸此外，他们报告称，活化的HSC在活化过程中减少了其维生素A含量，与静止的HSC一样有效地吸收维生素A^38,39还产生了一种单克隆人单链抗体片段，通过与突触素受体结合靶向人类HSC⁴⁰随访研究表明，该抗体在纤维化过程中特异性靶向肝肌成纤维细胞，而非单核细胞/巨噬细胞，并成功用作药物载体⁴¹虽然结果很有希望，但单克隆抗体药物载体方法存在一些潜在的局限性，包括半衰期、有效载荷和内吞潜能³⁰.

现在，研究也开始关注使用肽修饰蛋白方法通过腺病毒靶向传递治疗基因。与腺病毒和PDGF肽亲和的融合蛋白的开发增加了分离HSC中腺病毒基因的转移，同时减少了肝细胞的向性⁴²最近的一项研究将腺病毒与一种与p75神经营养素受体（存在于HSC和肌成纤维细胞上）有亲和力的肽偶联^43,44。使用这个结构，作者能够证明体内某些转录因子的表达可使肌成纤维细胞在纤维化小鼠肝脏中重新编程为肝细胞样细胞，并减轻肝纤维化⁴³使用腺相关病毒载体也可以实现向肌成纤维细胞靶向传递转录因子，腺相关病毒优先转染肌成纤维母细胞以生成复制原代肝细胞功能和增殖的肝细胞，并减少肝纤维化⁴⁵特异性靶向肝脏内瘢痕生成细胞并将其重新编程为具有积极功能益处的细胞的能力具有巨大的治疗潜力。

结论和未来挑战

我们对肝肌成纤维细胞生物学的基本认识的最新进展揭示了许多潜在的治疗靶点。尽管HSC可能是肌成纤维细胞群的主要贡献者，但重要的是我们继续深入研究产生肝肌成纤维纤维细胞的细胞库，随着我们对肝纤维化演变和消退的细胞和分子机制的进一步了解，无疑将使我们能够提高新的抗纤维化治疗的效力和精确度。还必须记住，有关肝肌成纤维细胞生物学的大多数数据都来自临床前动物模型，并且在这一领域仍然严重缺乏人类数据。未来几年，在“组学”技术巨大进步的推动下，我们应该利用这些强大的新方法直接研究人类纤维化肝组织，以大大提高我们对人类肝纤维化的细胞和分子机制的理解，跨越人类慢性肝病的各种病因和阶段。从这些类型的人体研究中积累的数据可用于告知、指导和聚焦我们的临床前研究，并提高我们识别相关新抗纤维化治疗靶点的精确度。此外，鉴于肌成纤维细胞对不同形式肝损伤的反应具有异质性，未来的治疗可能需要以特定疾病的方式进行调整。在未来几年中，在肝脏间充质细胞群中确定特定的前携带亚群有望促进并加速发现有效的、，靶向性抗纤维化治疗的最终目标是识别特异性标记物，使亚群特异性药物传递到肝脏内的瘢痕形成细胞，对正常器官内稳态的影响最小。在治疗肝纤维化患者时，我们还没有达到这种忠诚度；然而，组织特异性肌成纤维细胞标记物的鉴定有可能开辟肝纤维化精确医学的新时代。

缩写

BSA，牛血清白蛋白；ECM，细胞外基质；欧洲药品管理局；美国食品和药物管理局；肝星状细胞；卵磷脂视黄醇酰基转移酶；MMT，间皮细胞向间充质细胞转化；血小板衍生生长因子受体β；门静脉成纤维细胞；RGD，精氨酸-赖氨酸；小干扰RNA。

笔记

[版本1；参考：3已批准]

资金筹措表

作者感谢CORE/儿童肝病基金会和Wellcome信托基金会的支持。

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