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实验眼科研究。作者手稿；PMC 2016年7月5日发布。
以最终编辑形式发布为：
Exp-Eye Res.2006年1月；82(1): 99–110.
2005年7月12日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.exer.2005.007
预防性维修识别码：项目经理4932847
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院215595
PMID：16019000

色素上皮衍生因子（PEDF）和血管内皮生长因子（VEGF）在老年人脉络膜和年龄相关性黄斑变性眼睛中的表达

伊姆兰·布托,D.斯科特·麦克劳德,长谷川Takuya Hasegawa,Sahng Y.Kim先生,卡罗尔·莫尔斯,唐庆枝、和杰拉德·A·卢蒂*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

本研究的目的是检测血管内皮生长因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF）在老年人脉络膜中的定位和相对水平，并确定其在老年性黄斑变性（AMD）中的定位或相对水平是否发生变化.

眼组织取自8名无脉络膜视网膜疾病证据或病史的老年对照供体（年龄范围75-86岁；平均年龄79.8岁）和12名诊断为AMD的供体（年纪范围61-105岁；平均年纪83.9岁）。组织冷冻保存，用兔抗人血管内皮生长因子多克隆抗体和兔抗人PEDF多克隆抗体进行链霉亲和素碱性磷酸酶免疫组化。抗体与过量重组人PEDF或VEGF肽的预孵育阻止了抗体的结合。在邻近组织切片中用小鼠抗人CD-34抗体鉴定脉络膜血管。三名独立观察员对免疫组织化学反应产物进行分级。

在老年对照组脉络膜中，VEGF和PEDF定位最显著的部位是RPE–布鲁赫膜–脉络膜毛细血管复合体，包括RPE基底膜、毛细血管间隔和脉络膜基质。在老年对照组脉络膜中，VEGF和PEDF的免疫染色强度和定位无显著差异。血管内白细胞的VEGF免疫反应最强。AMD脉络膜的VEGF免疫染色模式和强度与老年对照组相似。然而，RPE细胞中PEDF的免疫反应性显著降低(第页=0.0073），RPE基底层(第页=0.0141），布鲁赫膜(第页<0.0001）和脉络膜基质(第页=0.0161）。椎间盘状瘢痕中PEDF免疫反应最强。VEGF和PEDF在Drusen和基底层沉积（BLD）中呈阳性。

在老年对照组受试者中，RPE-Bruch的膜毛细血管复合物中VEGF和PEDF免疫染色最强。在AMD中，RPE细胞、RPE基底膜、Bruch膜和脉络膜基质中的PEDF显著降低。这些数据表明，PEDF和VEGF之间存在着一个关键的平衡，并且PEDF可能会抵消VEGF的血管生成潜能。PEDF的减少可能会破坏这种平衡，并允许AMD患者脉络膜新生血管（CNV）的形成。

关键词：脉络膜、色素上皮衍生因子、血管内皮生长因子、RPE、布鲁赫膜、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管

1.简介

老年性黄斑变性（AMD）是西方65岁及以上人群中导致不可逆性视力丧失的主要原因之一(Ambati等人，2003年). AMD的发病机制可能是多因素的；其发病较晚、复杂的遗传和强烈的环境因素都可能在一定程度上起作用。脉络膜新生血管（CNV）是指从脉络膜生长出的新血管，以晚期“渗出性”AMD形式出现，是失明的主要危险因素。渗出性AMD的特征是脉络膜下血管通过受损的布鲁赫膜向内生长，布鲁赫膜可能保留在视网膜色素上皮（RPE）下方或突破RPE层进入视网膜下间隙。病理性脉管系统泄漏浆液和/或血液，最终导致视网膜黄斑区及其下的盘状疤痕(Green and Key，1977年;Green等人，1985年). 与视网膜新生血管不同，AMD患者的CNV不是明显的缺血驱动性疾病。事实上，对于AMD和其他相关疾病中视网膜下间隙异常血管的生长，目前还没有统一的理论。确定是什么引发了AMD中CNV的增长，是这一研究领域的主要挑战之一。

有证据表明，正常眼睛中存在内源性血管生成和抗血管生成生长因子之间的净平衡，这些因子的不平衡会导致脉络膜向内新生血管的生长。在动物模型中，手术切除的脉络膜新生血管膜和实验诱导的CNV中存在血管生成生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）(Amin等人，1994年;Kvanta等人，1996年;Ishibashi等人，1997年). 这些先前的研究还表明，RPE细胞的细胞外基质异常可能促进促血管生成表型和CNV的发展。

除了促血管生成因子外，最近发现，多种内源性抗血管生成因子，如色素上皮衍生因子（PEDF）、内皮抑素和血小板反应蛋白（TSP）可能有助于血管静止。PEDF是在眼睛中发现的内源性抗血管生成因子之一，首次从人类RPE细胞的条件培养基中纯化(Tombran-Tink等人，1991年). 它是丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）家族的成员，具有神经保护、神经营养(Tombran-Tink等人，1991年)和抗血管生成活性(Dawson等人，1999年). 已经在动物模型中探索了它作为治疗感光细胞退化和异常新生血管引发的视网膜和脉络膜疾病的潜在药物(Mori等人，2001年,2002年a;Gehlbach等人，2003年)正在进行临床试验评估(Rasmussen等人，2001年). 尽管PEDF在患有AMD的人脉络膜中的体内表达仍有待阐明，但PEDF已在动物模型的脉络膜中得到证实，并建议在实验性脉络膜新生血管膜的形成中发挥重要作用(Ogata等人，2002年). VEGF和PEDF的平衡得到了之前的证据的支持，即抑制VEGF系统或过度表达PEDF都会抑制脉络膜新生血管(Krzystolik等人，2002年;Mori等人，2002b).

本研究的目的是确定VEGF和PEDF在老年人脉络膜和RPE中的定位和相对水平，并评估AMD中PEDF和VEGF定位和强度的变化。数据表明，这两种重要内源性蛋白的水平可能调节CNV。

2.材料和方法

2.1. 捐赠者的眼睛

在威尔默眼科研究所（马里兰州巴尔的摩）和国家疾病研究交换所（宾夕法尼亚州费城NDRI）医学博士珍妮特·桑内斯（Janet Sunness）和卡罗尔·阿普尔盖特（Carol Applegate）的帮助下，获得了人类捐赠者的眼睛。研究中使用了以下捐赠者的眼睛：12名AMD患者（年龄范围61-105岁；平均年龄83.9±13.1岁）；8名无脉络膜视网膜疾病病史的老年对照供者（年龄范围75-86岁；平均年龄79.8±3.7岁）。所有捐赠者均为白人。表1包括每个受试者的尸检时间（PMT）和死亡至眼球摘除时间（DET）、年龄、性别、死因以及病史和眼史。研究方案遵循《赫尔辛基宣言》关于人体组织研究的原则。AMD的诊断是通过回顾眼库传递表上的眼部病史和解剖显微镜使用透射和反射照明对眼罩进行的尸检来进行的（Stemi，2000；Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY）。

表1

人类供体冷冻保存眼的特征

案例#时间（小时）年龄/种族/
性		主要死亡原因医疗
历史		眼睛
诊断		眼睛
历史
老年人检测支付款
12.53375/立方英尺心脏病正常无
272776/立方英尺肺CAHTN公司正常无
三12677/厘米慢性阻塞性肺病HTN公司正常未知
42.52880/厘米慢性阻塞性肺病正常白内障-OU
57.152880/厘米颅内出血HTN公司，
血管成形术		正常IOL-OU公司
6三1582/厘米脑转移CA正常无
7三1683/厘米心脏呼吸暂停正常IOL-OU公司
852686/CF公司呼吸衰竭正常无
AMD公司
93.53461/CM（厘米）食管转移
加利福尼亚州		AMD，早期放射状角膜切开术
103.54269/立方英尺蛛网膜下腔出血-
拉格		普尔。纤维化，
甲状腺功能减退-
主义		AMD（GA），后期黄斑变性
1143374/厘米前列腺癌AMD，早期黄斑变性；
IOL-OU公司
1273075/厘米吸入性肺炎AMD（GA），后期*黄斑变性-OS
13三3379/厘米肺炎HTN公司，
哮喘，
前列腺CA		AMD，早期黄斑变性；
IOL-OS（IOL-OS）
1452981/CF（81/CF）心肌梗死HTN公司AMD，早期黄斑孔-OD
15三1283/厘米前列腺CADM、HTNAMD，早期白内障，黄斑病变-OU
1642093/立方英尺多系统故障DM、HTNAMD（椎间盘疤痕），
晚的*		黄斑变性-OU
17三3694/厘米心脏衰竭AMD（Disc.Scar），
晚的*		黄斑变性；
IOL-OS（IOL-OS）
183.5?95/厘米心肌病AMD（Disc.Scar），
晚的*		合法盲-OU
1923398/立方英尺老年人AMD，早期IOL-OD公司
204.5–511105/厘米慢性阻塞性肺病AMD（盘状疤痕，
GA），较晚		未知

DET，死亡至眼球摘除时间；PMT，死后时间（从死亡到固定）；C、 高加索人；M、 男性；F、 女性；老年性黄斑变性；糖尿病；HTN，高血压；慢性阻塞性肺病；CA，癌症；GA，地理萎缩；人工晶状体，眼内晶状体；

*脉络膜新生血管（CNV）；OU，双眼；外径，右眼；OS，左眼。

2.2. 组织制备和切片

在角膜缘后方0.5 cm处做一个环形切口后，将眼前节切除，并用立体显微镜检查眼罩（Stemi 2000；Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY）。使用数码相机（QImaging；加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）获取总图像，并直接导入图像分析软件（Photoshop 6.0版；加利福尼亚州圣何塞的Adobe Systems Inc.，使用PowerMac G3；加利福尼亚州库比蒂诺的Apple Computer）。眼睛固定在0.1的2%多聚甲醛中米磷酸钠缓冲液（pH 7.4）在室温下保存1小时，用增加浓度的蔗糖进行冷冻保存，以及8µ米如前所述从黄斑切下切片(Lutty等人，1993年).

2.3. 免疫组织化学

如前所述，使用硝基蓝四氮唑（NBT）发育系统在冷冻保存的组织切片上进行链霉亲和素碱性磷酸酶（APase）免疫组化(布托等人，2004年). 简而言之，8µ米厚厚的冰冻切片用无水甲醇渗透，并用2%的正常山羊血清在Tris缓冲盐水（TBS；pH 7.4，1%BSA）中封闭。此外，还使用抗生物素复合物（ABC）阻断试剂盒（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories，Inc.）对各节段进行阻断。在TBS中清洗后，用1%牛血清蛋白（BSA）在TBS稀释后，在4°C下用兔抗人重组PEDF（1:60 000；P.Tong）、小鼠抗人PEDF（1:16 000；Chemicon，Temecula，CA）或兔抗人VEGF（1:8000；SC152，Santa Cruz，California）孵育切片过夜。在邻近组织切片中用小鼠抗人CD-34（1:800；Signet Laboratory，Dedham，MA）抗体对脉络膜血管进行免疫标记。在TBS中清洗后，组织切片在室温下与稀释为1:500的适当生物素化二步抗体孵育30分钟（Kierkegaard和Perry，Gaithersburg，MD）。最后，用链霉亲和素碱性磷酸酶（1:500；Kierkegaard和Perry，Gaithersburg，MD）培养切片，然后用BCIP-NBT试剂盒（Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA）培养碱性磷酸酶活性，并添加1 m米（−）-盐酸四米索（Sigma），在抗体结合位点产生蓝色反应产物。包括抗体在内的所有免疫组织化学试剂对所有标本都是相同的。在每个实验中，至少有三名AMD患者和三名正常老年人同时接受处理。

为了确定VEGF和PEDF免疫标记的特异性，VEGF抗体在4°C下与使用抗原的100倍摩尔过量的VEGF肽预孵育过夜，PEDF抗体与100倍摩尔过剩的人类重组PEDF预孵化过夜，然后将抗体稀释至最终浓度。将预孵育抗体的免疫反应性与在相同浓度的BSA中孵育过夜的抗体以及用新稀释抗体孵育的切片的免疫反应进行比较。还将多克隆PEDF的免疫反应性与单克隆抗人PEDF肽（Chemicon，Temecula，CA）的免疫反应进行了比较。本研究中的所有结果均使用多克隆抗体生成。

2.4. PAS-酶染色法

如前所述，使用周期性酸性希夫（PAS）/碱性磷酸酶（APase）染色法鉴定活的脉络膜毛细血管（APase-活性：蓝色反应产物）、基底膜和基底层沉积物（BLD）（PAS染色：粉红色(McLeod和Lutty，1994年). 简言之，将切片在37°C的APase缓冲液中培养15分钟，然后在几次蒸馏水中清洗。将切片放入新制备的0.5%周期酸中5分钟，然后在蒸馏水中进行短暂清洗。然后将切片在希夫试剂中处理10分钟，并在自来水中多次显影，直到水变得清澈。除非另有说明，否则所有试剂均从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）购买。

2.5. 组织漂白

为了在脉络膜Bruch膜-RPE复合体水平上进行免疫组织化学定性和定量评估，我们采用我们公布的技术对RPE和脉络膜黑色素细胞中的黑色素进行了漂白(布托等人，2004年). 简言之，在链霉亲和素APase免疫组织化学染色后，立即将切片在4%多聚甲醛中于4°C下过夜固定。在蒸馏水中清洗载玻片，将其浸入0.05%高锰酸钾溶液（美国威斯康星州密尔沃基市奥尔德里奇化学公司）中25分钟，然后在蒸馏水中冲洗。在室温下用35%过氧乙酸（FMC Corp.，Philadelphia，PA）在加湿容器中覆盖切片20分钟，然后用蒸馏水清洗。最后用凯撒甘油凝胶安装盖玻片。

2.6. 免疫反应性分级系统

三个独立的蒙面观测者，使用先前描述的评分系统(Page等人，1992年;McLeod等人，1995年)，对不同结构的每个抗体的免疫反应强度进行分级。标记强度定性分级为：8，免疫反应均匀；7，斑片状和强烈；6、均匀适中；5、斑块状、中度；4、均匀弱；3、斑块状、软弱；2、均匀且很弱；1、斑块状，非常脆弱；0，无。

2.7. 统计分析

平均得分±标准偏差根据所有分级者对每种脉络膜结构的得分来确定各组。Kolmogorov和Smirnov方法证明了这些分数的高斯分布。这个第页通过比较老年对照组脉络膜的平均得分和患有AMD的眼睛的得分来确定这些值t吨-检验并假设方差不等和两个尾数。A类第页值<0.05被认为是显著的。所有值均表示平均值±标准偏差所有统计分析均使用InStat软件（加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad软件2.0版）进行。三。

结果

3.1. PEDF和VEGF在老年对照脉络膜中的免疫定位

PEDF和VEGF免疫反应均存在于RPE-Bruch的膜毛细血管复合体中，包括RPE基底膜、毛细血管间隔和老年对照脉络膜的脉络膜基质。VEGF的免疫染色在脉络膜毛细血管和毛细血管间隔中最为显著(图1（C）)然而，PEDF染色在毛细血管间隔周围显著，在脉络膜基质中明显但弥散(图1（D）). RPE细胞基底部VEGF和PEDF均阳性，而RPE细胞顶面VEGF免疫染色较弱。在大型脉络膜血管中，VEGF和PEDF的免疫染色呈斑片状且较弱。VEGF和PEDF的免疫反应性并不一致，而是异质性的，因此分级者在整个组织切片中都有一个特定的结构。在一些脉络膜组织切片中，脉络膜血管腔内以及脉络膜基质中的白细胞也被VEGF强烈免疫染色。

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用来自老年对照眼的VEGF和PEDF抗体孵育的眼下脉络膜切片（病例8）。（A） CD-34的免疫染色与包括脉络膜毛细血管在内的脉络膜血管有关。（B）在脉络膜毛细血管和大脉络膜血管中存在蓝色APase反应产物，在Bruch膜和血管基底膜中存在粉红色PAS染色。VEGF（C）和PEDF（D）的免疫染色在某些区域的RPE基底膜、Bruch膜、脉络膜毛细血管基底膜、毛细血管间隔膜中显著，在脉络膜基质中不太强阳性。切片（A、C、D）中的色素被RPE和脉络膜黑素细胞漂白。

在切片上使用VEGF肽或人重组PEDF之前，将抗体与VEGF多肽或人PEDF预孵育，以证明VEGF和多克隆抗人PEDF-抗体的结合特异性。预培养消除了组织中的大部分染色(图2). 兔抗人PEDF抗体在脉络膜中的定位和染色强度与市售单克隆抗体（数据未显示）相似。所有显示的结果和免疫反应等级均来自于用多克隆抗人PEDF抗体孵育的切片。使用相同的多克隆抗人PEDF抗体，我们在镰状细胞视网膜和脉络膜中报告了PEDF免疫标记(Kim等人，2003年).

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用兔抗人VEGF（A）和兔抗人PEDF（B）免疫染色的老年对照眼（病例7）的脉络膜切片，用BSA预孵育过夜，显示布鲁赫膜、脉络膜毛细血管基底膜和毛细血管间隔膜的显著标记。PEDF的免疫反应产物强度高于VEGF。这些被认为是“模拟嵌块”样本，因为它们与一种控制蛋白BSA预先孵育。通过将抗体与抗原、VEGF肽（C）和重组人PEDF（D）预先孵孵育过夜，脉络膜免疫反应几乎被消除。强烈的VEGF和PEDF免疫反应与水肿有关（箭头所示）。RPE（箭头）也有PEDF免疫反应。（星号、脉络膜血管）。

3.2. PEDF和VEGF在AMD脉络膜中的免疫定位

AMD眼脉络膜VEGF免疫染色模式和强度与老年对照眼相似；RPE-Bruch的膜-毛细血管复合体包括RPE基底膜、毛细血管间隔和脉络膜基质，具有显著的VEGF免疫反应性（相比之下图1（C）和3（C）). 老年对照组和AMD组的脉络膜结构中VEGF定位得分无显著差异(图5（B）). AMD眼脉络膜Bruch膜RPE复合体中PEDF免疫反应性较低(图3（D）)与老年对照眼相比。在一些脉络膜组织切片中，在AMD患者脉络膜的病理和非病理区域，PEDF的表达是可变的。在同一受试者的非病理区（病例11），PEDF的免疫反应性与老年对照眼的VEGF相似（比较图3和​和4）。4). 然而，在RPE细胞中，PEDF的免疫反应评分明显较低(第页=0.0073），RPE基底层(第页=0.0141），布鲁赫膜(第页<0.0001）和脉络膜基质(第页=0.0161）AMD脉络膜患者比老年对照眼患者(图5（A）). 与老年对照眼相比，AMD眼脉络膜毛细血管、毛细血管间隔和脉络膜大血管中PEDF的免疫反应性评分没有显著差异。老年对照组与AMD组的脉络膜结构的所有平均免疫反应评分如所示图5.

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AMD眼的眼下脉络膜切片（病例11）。（A） CD-34免疫染色显示脉络膜毛细血管排列良好，而PAS染色（B）显示BLD（箭头）。VEGF（C）的免疫染色在脉络膜结构中显示出强烈的免疫反应性，而PEDF免疫反应性（D）比VEGF弱。BLD（箭头）对VEGF也呈阳性，而PEDF仅与BLD弱相关。

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血管内皮生长因子和PEDF在AMD眼的免疫定位（病例11），与图3切片是从脉络膜鼻腔到视神经头的非病理区域。（A） CD-34的免疫染色与脉络膜毛细血管相关，而APase/PAS染色（B）显示正常的脉络膜形态。VEGF（C）和PEDF（D）抗体的免疫染色与老年对照眼相同。

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平均免疫反应分数±标准偏差用于老年对照组（黑色）和AMD（白色）眼睛的脉络膜结构。RPE中PEDF（A）的免疫反应性评分显著降低(第页=0.0073），RPE基底层(第页=0.0141），布鲁赫膜(第页<0.0001）和脉络膜基质(第页=0.0161）。AMD眼和老年对照眼的脉络膜结构VEGF免疫反应评分（B）无显著差异(第页= 0.4444).

AMD患者（病例15）的眼部色素上皮明显脱落（PED）标本显示，BLD、内脉络膜和PED中假定的白细胞VEGF呈强阳性，而PEDF免疫反应在BLD和Bruch膜之间的液体中最为强烈(图6). 另一只患有局部萎缩的AMD眼（病例12）显示出与视网膜外移行细胞相关的强烈VEGF免疫反应(图7（C）)而较低强度的PEDF与迁移细胞相关(图7（D）). 比较非漂白APase/PAS染色切片(图7（B）)VEGF和PEDF免疫反应的漂白切片(图7（C–D）)一些VEGF阳性细胞可能是色素沉着的巨噬细胞或迁移的RPE细胞。BLD的VEGF和PEDF免疫反应均阳性(图3和​和6）。6). 连续切片PAS染色证实BLD的身份(图3（B）,6（B）). 在晚期AMD患者（受试者16、17、18和20）中，存在盘状疤痕和小CNV形成。椎间盘状瘢痕是PEDF中染色最深的结构(图8（D）)而CNV只有低水平或无PEDF免疫反应。VEGF染色在CNV中表现突出(图8（C）)以及包括脉络膜毛细血管在内的脉络膜血管，而与盘状瘢痕和脉络膜基质相关的VEGF免疫反应较弱。

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AMD眼（病例15）伴色素上皮脱离（PED；*）。CD-34（A）免疫染色与脉络膜血管相关，PED下脉络膜毛细血管明显脱落。PAS染色（B）显示PED中的BLD、浆液和白细胞成分（B、C和D中的箭头）。请注意，BLD、内脉络膜和PED中的白细胞VEGF（C）呈强阳性，而PEDF免疫反应性（D）在BLD和Bruch膜之间的液体中最为强烈。

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AMD患者（病例12）的视网膜和脉络膜切片显示，与迁移细胞（箭头）相关的VEGF（C）免疫反应强烈，而PEDF（D）在细胞中的强度较小，但在BLD中更为强烈。PAS（B）染色清楚显示细胞（箭头）和BLD。CD-34（A）显示脉络膜毛细血管明显脱落。

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AMD眼脉络膜切片（病例16），瘢痕内有盘状瘢痕，形成小的CNV。CD-34（A）和APase（B）标记显示有存活的CNV（箭头）和疤痕中的粉红色PAS染色（星号）。CNV具有与其相关的强烈VEGF免疫反应性（C）（箭头），而CNV中PEDF（D）呈阴性。疤痕（星号）的PEDF比VEGF多。此外，与VEGF相比，脉络膜中的PEDF免疫反应性较弱。

4.讨论

这项研究表明，与老年对照组相比，AMD患者脉络膜中的PEDF免疫反应显著降低，PEDF是一种有效的血管生成抑制剂。然而，VEGF定位和免疫反应评分在两组之间具有可比性。PEDF的显著降低可能为脉络膜新生血管的形成创造了一个宽松的环境。AMD受试者的数量不足以将AMD组分为早期和晚期亚组；对所有AMD患者数据进行汇总分析。

这项研究中的一个引人注目的发现是，与老年对照受试者相比，AMD受试者脉络膜和RPE中的VEGF水平并没有显著升高。这些结果使AMD与增生性糖尿病视网膜病变或缺血性视网膜中央静脉阻塞等疾病形成鲜明对比，在这些疾病中，玻璃体中的VEGF水平与正常对照组相比显著升高(Aiello等人，1994年;达摩，1994). 许多研究已经探讨了血管内皮生长因子在AMD相关CNV发病机制中的可能作用(Kvanta等人，1996年;Lopez等人，1996年). 这些研究与我们的研究之间的一个不同之处是，我们AMD队列中没有CNV形成处于生长阶段；所有患者均出现在盘状疤痕内，可能处于静止状态。盘状瘢痕是一种终末期瘢痕，通常有血管形成，几乎总是来自脉络膜循环，但有时也有视网膜下成分和视网膜下成分(绿色，1999). 然而，作为最终阶段，瘢痕中的CNV通常会退化或至少稳定，并且不会扩张。有趣的是，除了CNV附近的瘢痕区域外，盘状瘢痕是PEDF最突出的部位。

最近，许多研究人员通过过度表达VEGF在动物模型中成功诱导了CNV(Cui等人，2000年;Spilsbury等人，2000年;Schwesinger等人，2001年). 夸克及其同事(Kwak等人，2000年)已经证明，在激光诱导的CNV小鼠模型中，阻断VEGF活性会抑制血管生长。虽然上述研究表明，VEGF可能在CNV的发展中发挥作用，但目前尚不清楚脉络膜中的VEGF是否在人类这种疾病的自然病史中起主要致病作用。此外，对人类AMD中VEGF的其他研究侧重于CNV膜，而不是这些受试者的脉络膜和RPE(Amin等人，1994年;Kvanta等人，1996年;Lopez等人，1996年). 另一种可能性是白细胞产生的VEGF可能会引发CNV，这是Cousins最近的一篇综述中提出的(堂兄弟和萨克，2002年). 然而，我们的研究结果并没有显示AMD中VEGF更高，没有考虑AMD中VEGF阳性白细胞的数量，但白细胞在所有脉络膜中肯定具有高的VEGF免疫反应性。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGEF-C、VEGF-D和胎盘生长因子（PIGF）(Neufeld等人，1999年). 最近在人类CNV膜和实验CNV中发现了这些蛋白(Otani等人，2002年;Rakic等人，2003年). 目前研究中使用的抗体只识别VEGF-A，因此我们的研究没有阐明本文报道的组织中是否存在其他形式的VEGF。最近，一种新的VEGF-a亚型，VEGF1650亿已分离出一种内源性剪接变异体，在正常细胞和组织以及人血浆中表达。这种亚型在前列腺癌中下调，以与VEGF相同的亲和力结合VEGF受体2165，但不激活它或刺激下游信号通路。在两种不同的体内血管生成模型中，这种异构体不是血管生成的，而是抑制VEGF165-介导的血管生成，表明调控VEGF剪接可能是从抗血管生成表型到促血管生成表型的关键转换(Woolard等人，2004年). 关于血管内皮生长因子（VEGF）在人类AMD中的作用，一个更明确的答案可能来自正在进行的前瞻性临床试验，这些试验通过向玻璃体腔内注射抗血管内皮生长激素（VEGF）的抑制抗体来评估AMD对CNV的抑制作用(Genentech，1999年)或防止VEGF与其受体结合的适配体(维诺雷斯，2003年).

之前的一份报告评估了VEGF和PEDF的分化RPE细胞表达水平以及VEGF与PEDF之间的临界平衡(Ohno-Matsui等人，2001年). 该研究提供了证据表明，VEGF通过VEGFR-1以自分泌方式上调人类RPE细胞产生PEDF。这种调节导致血管生成刺激物和抑制剂之间恢复正常平衡，这种平衡可能在维持视网膜血管系统的内稳态中起关键作用。VEGF和PEDF之间的相互作用可能是RPE的一个特征。RPE是已知的第一个产生PEDF的细胞。几项体内研究表明，VEGF是由正常眼睛中的RPE细胞组成的(Adamis等人，1993年;Yi等人，1998年).Blaauwgeers等人（1999）证明培养的人RPE细胞优先向基底（脉络膜）表面分泌VEGF，并且VEGF受体（VEGFR-2）特异性地定位于面向RPE的脉络膜毛细血管内皮细胞的视网膜或顶面。此外，视网膜色素上皮的变性导致脉络膜血管内皮的开窗消失(Neuhardt等人，1999年). 这些结果表明，脉络膜毛细血管和RPE在调节VEGF水平方面存在旁分泌关系，VEGF可能是血管内皮细胞的营养因子，或维持脉络膜血管内皮的开窗结构和高度通透性结构。这支持了目前在正常脉络膜中发现的显著VEGF。

PEDF最近被确定为眼睛中的主要血管生成抑制剂，其抗血管生成效力强于任何其他抗血管生成因子(Dawson等人，1999年). AMD患者玻璃体中PEDF水平降低与CNV相关(Holekamp等人，2002年). PEDF显著抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖和迁移(Duh等人，2002年). 在这项研究中，脉络膜中PEDF水平显著降低，表明脉络膜-布鲁赫膜-RPE复合体中PEDF-水平降低可能为AMD中CNV的形成创造了更宽松的环境。我们最近在年轻人的Bruch膜中观察到内皮抑素免疫反应性较高（未发表数据），与老年对照组相比，该免疫反应性随着年龄的增长而下降，AMD脉络膜中内皮抑素的免疫反应性进一步降低，而两组中的胶原XVIII水平相当(布托等人，2004年). 我们对内皮抑素的研究和本研究表明，布鲁赫膜中的内源性抗血管生成药物PEDF和内皮抑素可能起到阻止CNV生长的作用。这可以解释为什么除了激光损伤外，很难在小鼠体内诱导CNV，激光损伤会破坏和破坏布鲁赫膜。当视紫红质启动子过度表达VEGF时(Okamoto等人，1997年)或RPE65启动子(Schwesinger等人，2001年)，光感受器产生的VEGF诱导视网膜外新生血管（NV），RPE产生的VEGF诱导脉络膜内新生血管。NV都没有穿透和穿过布鲁赫膜，布鲁赫膜含有高水平的内皮抑素和PEDF。因此，我们的研究结果表明，两种血管生成抑制剂，PEDF和内皮抑素，显著存在于Bruch膜和脉络膜毛细血管周围，在AMD中减少。根据免疫反应，当两种天然拮抗剂减少或缺失时，该区域中正常水平的VEGF可能足以刺激新血管生长。

我们推测，在正常健康条件下，RPE通过分泌VEGF、，同时保持视网膜色素上皮内的感光层完全无血管，并通过VEGF诱导的PEDF自分泌性上调阻止视网膜下间隙CNV的发展。

总之，老年对照脉络膜中VEGF和PEDF的免疫染色在RPE-Bruch的膜毛细血管复合体中最强。在AMD中，RPE细胞和Bruch膜中的PEDF较低。这些数据表明，内源性抗血管生成药物如PEDF和内皮抑素之间存在临界平衡(布托等人，2004年)和VEGF，抗血管生成因子可能会抵消VEGF的血管生成潜能。在病理条件下，PEDF和内皮抑素减少，从而破坏这种平衡。这种平衡变化可能在允许涉及RPE细胞、RPE基底膜和Bruch膜的病理过程发生以及允许AMD中形成脉络膜新生血管方面具有重要意义。

致谢

这项工作得到了美国国家卫生研究院拨款EY-01765（威尔默）、迈克尔和玛丽·凯瑟琳·潘奇基金会（威默）以及与失明作斗争基金会（GL）的支持。作者对捐赠者及其亲属的慷慨表示感谢。

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