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EMBO分子医学。2016年7月；8(7): 729–744.
2016年5月25日在线发布。 数字对象标识：10.15252/emmm.201505925
预防性维修识别码：项目经理4931288
PMID：27226027

内质网应激通过以下途径增强纤维化爱尔兰共和国1α介导的miR‐150降解和XBP公司‐1拼接

Femke Heindryckx公司,1,† 弗朗索瓦·比奈,1,† 马凯拉·蓬蒂科斯,2 克里斯塔·隆布茨,三 刘乔伊（Joey Lau）,1 约翰·克鲁格,1,‡和帕尔·格温通讯作者1,4,‡
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摘要

急诊室应激导致未折叠蛋白反应的激活，并与纤维化疾病的发展有关。在本研究中，我们表明急诊室应力引起的爱尔兰共和国1α信号通路，使用抑制剂4μ8C阻断TGF公司β诱导的肌成纤维细胞活化在体外，减少肝脏和皮肤纤维化体内，并恢复从系统性硬化患者分离的活化肌成纤维细胞的纤维化表型。通过使用爱尔兰共和国1α−/−成纤维细胞和爱尔兰共和国1α-突变蛋白缺乏内核糖核酸酶活性，我们证实爱尔兰共和国1α在肌成纤维细胞活化过程中起重要作用。爱尔兰共和国1α可以裂解miR-150，从而释放miR-150对α的抑制作用座椅模块组件通过c‐Myb表达。抑制爱尔兰共和国1α也被证明可以阻断急诊室通过扩展XBP公司‐依赖性途径。综合起来，我们的结果表明急诊室应激可能是纤维化发病机制中一个重要且保守的机制急诊室应激途径可能与治疗纤维化疾病相关。

关键词：内质网应激、纤维化、肝硬化、肌成纤维细胞、硬皮病
主题类别：消化系统、药理学和药物发现、皮肤

介绍

纤维化的特征是纤维结缔组织过度堆积，通常是由于有毒物质、感染、机械损伤或自身免疫反应引起的慢性炎症而引起的（Darby&Hewitson，2007; 克拉曼等,2013; Kendall&Feghali‐Bostwick，2014). 结缔组织的逐渐积累最终导致组织结构的破坏和器官功能障碍，这在终末期肝病、肾病、肺纤维化和心力衰竭中是致命的。慢性自身免疫性疾病，如硬皮病、溃疡性结肠炎、克罗恩病和类风湿性关节炎，是以纤维化为显著病理特征的其他疾病（Gilbane等,2013; Li&Kuemmerle，2014; 帕特奈克等,2015). 尽管纤维化几乎影响身体的每一个组织，并且是各种疾病发病率和死亡率的主要原因，但很少有专门针对纤维化发病机制的治疗方法。

虽然病因和发病机制可能差异很大，但纤维化总是涉及活化的肌成纤维细胞过度生产和沉积胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白。肌成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA），并作为组织损伤触发的修复机制的一部分而形成和激活（Kendall&Feghali‐Bostwick，2014). 有几种细胞类型被证明是肌成纤维细胞的祖细胞：住宅成纤维细胞、上皮细胞（通过上皮细胞向间充质细胞转化）以及称为纤维细胞的血源性间充质祖细胞。在肝脏中，来源于肝星状细胞（HSC）的活化肌成纤维细胞是负责基质沉积的主要成纤维细胞类型。

肌成纤维细胞的形成和功能由许多分泌的可溶性因子促进，如细胞因子、生长因子和基质相关因子，这些因子在纤维化的发展中起协同作用（Kramann等,2013). TGFβ被认为是协调实质细胞、炎症细胞和肌成纤维细胞之间相互作用的关键因素（Leask和Abraham，2004). 因此，转基因小鼠中TGFβ的过度表达导致多器官纤维化（Sime等,1997; 常务副校长等,1999; 拉赫穆图拉等,2013).

内质网（ER）中蛋白质折叠的稳态调节受三条进化保守路径的控制：IRE1α‐XBP‐1、PERK‐eIF2α和ATF6（Schroder&Kaufman，2005). 这些途径，也被称为未折叠蛋白反应（UPR），是对内质网应激的反应而被激活的，当细胞必须应对蛋白质折叠机制中增加的负担时，就会发生内质网应激。重要的是，UPR决定细胞的生死，内质网应激的最终结果是恢复和存活或凋亡，这取决于内质网胁迫的严重程度和持续时间（Sovolyova等,2014). UPR的所有三条通路都对未折叠蛋白的积累形成协调反应，一些研究表明，不同通路（山本等,2004; 阿拉伊等,2006; 阿达奇等,2008). 内质网应激和UPR激活可由机械损伤、炎症、基因突变、感染和氧化应激引起，并与导致内脏纤维化重塑的疾病有关，如慢性肝病（Galligan等,2012; 小腿等,2013; 季，2014)、肺纤维化（Baek等,2012; 坦乔尔等,2012,2013)、肾纤维化（Chiang等,2011)心血管疾病（Spitler&Webb，2014)和炎症性肠病（Bogaert等,2011; 曹等,2013).

IRE1α是一种位于内质网膜上的激酶，通过内质网脂质双层（Tirasophon等,2000). ER蛋白负载量增加和未折叠蛋白的存在导致ER伴侣GRP78/BiP从IRE1α中分离。然后，游离IRE1α二聚并自磷酸化，从而激活胞浆中的IRE1β核糖核酸酶结构域。受调节的IRE1α依赖的mRNA衰变（RIDD）减少了蛋白质翻译和蛋白质进入内质网（Hollien&Weissman，2006). 此外，IRE1α具有剪接XBP‐1 mRNA的能力，这是翻译活性XBP­1所必需的。转运到细胞核后，XBP‐1与UPR启动子元件结合，启动基因表达，增强ER处理未折叠蛋白质的能力，包括分子伴侣（如BiP）和转录因子（如CHOP）。内质网应激还与内质网体积增大有关，这被解释为增加蛋白质折叠能力的适应性机制（斯里布里等,2004).

除了降解mRNA（Binet等,2013)，最近有研究表明，IRE1α也具有降解微小RNA（miRs）的能力（Upton等,2012). miR是由17–25个核苷酸组成的短的非编码RNA寡核苷酸，通常通过与靶mRNA 3′非翻译区的互补序列结合来抑制基因表达，以抑制mRNA翻译或诱导mRNA切割。miR调节增殖、分化和凋亡等多种细胞功能，在包括纤维化（Bowen）在内的多种人类疾病中观察到异常miR表达等,2013).

最近开发了专门针对UPR个别成分的抑制剂。在IRE1α内核糖核酸酶结构域中稳定结合赖氨酸907的选择性抑制剂4μ8C已被证明抑制RIDD活性和XBP‐1剪接（交叉等,2012). 高水平的4μ8C对细胞没有可测量的毒性，浓度在80至128μM之间的4μC完全阻断XBP‐1剪接，而不影响IRE1α激酶活性（交叉等,2012). 因此，抑制剂4μ8C既是一种潜在药物，也是描述IRE1α功能的重要工具体内IRE1α基因敲除小鼠在胚胎发育过程中死亡。

在本报告中，我们表明抑制IRE1α可以阻止肌成纤维细胞的激活，并减少肝和皮肤纤维化动物模型中的纤维化。我们发现，药物抑制IRE1α可以逆转从硬皮病患者分离的活化肌成纤维细胞的纤维化前表型，这表明在制定治疗纤维化疾病的新策略时，应考虑ER应激抑制剂。

结果

激活肌成纤维细胞需要IRE1α的RNase活性

细胞外基质蛋白分泌增加以及αSMA表达增加是成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的典型特征（Baum和Duffy，2011). 用转化生长因子β治疗人胎肺成纤维细胞（HFL1）可导致肌成纤维细胞的形成，这可以通过αSMA的表达增加来判断（图1A） 和胶原蛋白I（图1B） ●●●●。由于I型胶原产量增加可能会增加蛋白质折叠需求并激活UPR，我们测量了几种内质网应激途径成分的表达，发现CHOP和BiP的mRNA表达增加（图1C） 以及CHOP蛋白水平的增加（图1D） 并增加了XBP‐1的拼接（图1C和E）。为了研究内质网应激的这种激活，特别是IRE1α的激活是否与肌成纤维细胞的激活有关，我们使用抑制剂4μ8C抑制IRE1的功能，该抑制剂通过αSMA的mRNA表达和蛋白水平来阻断TGFβ诱导的成纤维细胞激活（图1A和F）和胶原蛋白I（图1B和G）。此外，TGFβ诱导的αSMA mRNA表达在过度表达缺乏RNase活性的两种不同IRE1α突变形式的细胞中降低（图1H） 或使用IRE1α进行完全功能丧失实验时−/−MEF电池（图1一） ●●●●。

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这个RN公司酶活性爱尔兰共和国激活肌成纤维细胞需要1α

  1. αSMA mRNA中的级别TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞和爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C*P（P）= 0.001.
  2. 胶原蛋白1α2信使核糖核酸中的级别TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞±爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C*P（P）= 0.01.
  3. 信使核糖核酸的级别急诊室应激相关基因TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞*P（P） CHOP公司 = 0.045, *P（P）Bip=0.023*P（P）拼接的XBP公司‐1P（P）=0.001，与相应的对照组相比。
  4. 蛋白质印迹CHOP公司蛋白质水平TGF公司β处理的高频激光1个单元格±爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C。
  5. 显示拼接和未拼接的琼脂糖凝胶XBP公司‐1信使核糖核酸在里面TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞±爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C。
  6. α的免疫组织化学染色座椅模块组件在里面TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞±爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C。比例尺=20μm。
  7. 分泌可溶性胶原蛋白的定量TGF公司β处理的高频激光1个单元格±爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C*P（P）= 0.049.
  8. αSMA mRNA中的表达式TGF公司β处理的高频激光1个细胞过表达2个RN公司酶死亡突变体（K599A和K907A）爱尔兰共和国1α. *P（P）K599A=0.013*P（P）K907A=0.0008与重量.
  9. αSMA mRNA中的表达式TGF公司β处理的爱尔兰共和国1α−/−或重量MEF单元格*P（P）= 0.025.

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给出了值。误差条表示s.e.m。n个= 3英寸（A–C）和（G–I）。可在线获取此图的源数据。

miR‐150具有抗纤维化作用，并被IRE1α直接切割

IRE1α最近被证明能直接裂解miR（Upton等,2012)因此，假设4μ8C可以通过阻止参与肌成纤维细胞活化的miR的分裂来调节纤维化。miR‐29水平降低（Khalil等,2015)，miR‐148（范凯伦‐延森等,2015)和miR‐150（本田等,2013; 郑等,2013)与纤维化组织重塑有关，因此被选择进行分析。用TGFβ和4μ8C联合治疗HFL1成纤维细胞导致miR‐150显著增加（图2A） miR-29和miR-148的水平未受影响（图电动汽车1). 这些结果表明，IRE1α依赖的信号通路可能负责调节miR‐150的水平。这进一步得到HFL1成纤维细胞中RNase非活性IRE1α突变体过度表达导致miR‐150水平升高以响应TGFβ的发现的支持（图2B） ●●●●。此外，TGFβ处理的IRE1α中miR‐150水平也较高−/−MEF电池与WT电池（图2C） ●●●●。为了进一步研究IRE1α介导的miR‐150的裂解是否有助于TGFβ诱导的肌成纤维细胞活化−/−用抗miR‐150‐5p miRNA抑制剂转染MEF细胞，结果表明，该抑制剂可以抑制miR‐50的水平（图2D） 并增加αSMA mRNA对TGFβ的反应（图2E） ●●●●。基于此，假设miR‐150直接参与αSMA表达的负调控。

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miR‐150具有抗纤维化作用，可直接被爱尔兰共和国1α

  1. miR‐150在TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞和爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C*P（P）= 与对照组相比为0.046。
  2. miR‐150在高频激光1成纤维细胞过度表达2RN公司酶死亡突变体（K599A和K907A）爱尔兰共和国1α. *P（P）= 0.0043（K599A），P（P）= 0.043（K907A），与对照组相比。
  3. miR‐150在TGF公司β处理的重量(爱尔兰共和国1α+/+)和爱尔兰共和国1α−/− MEF公司单元格*P（P）= 0.018. 结果表示为与Ctrl相比的折叠变化。
  4. miR‐150在爱尔兰共和国1α−/− MEF公司未被转染的细胞(美国犹他州)或转染mi核糖核酸抑制剂控制（siCtrl）或miR‐150‐5p mi核糖核酸抑制剂*P（P）= 0.034与美国犹他州.
  5. αSMA mRNA中的表达式TGF公司β处理的爱尔兰共和国1α−/− MEF公司未被转染的细胞(美国犹他州)或转染mi核糖核酸抑制剂控制（siCtrl）或miR‐150‐5p mi核糖核酸抑制剂*P（P）= 0.043与美国犹他州.
  6. miR‐150在高频激光1用对照质粒（Ctrl）或miR-150表达质粒（miR-150）转染成纤维细胞*P（P）= 0.038.
  7. c-Myb蛋白的Western blotTGF公司β处理的高频激光1个未转染的成纤维细胞(美国犹他州)，用对照质粒转染(保时捷中心trl）或miR-150表达质粒（miR-150）*P（P）= 0.0206英寸美国犹他州Ctrl与超声心动图β和P（P）= 0.0126英寸保时捷中心trl控制与保时捷中心trl公司TGF公司β.
  8. α的蛋白质印迹座椅模块组件在与（G）相同的实验装置中*P（P）= 0.0405英寸美国犹他州Ctrl与超声心动图β、 和P（P）= 0.0284英寸保时捷中心trl控制与保时捷中心trl公司TGF公司β.
  9. c‐我的信使核糖核酸未转染水平高频激光1个单元格(美国犹他州)和转染对照si的细胞核糖核酸（siCtrl）或si核糖核酸针对c‐Myb（sicMyb）*P（P）= 0.00001与美国犹他州.
  10. αSMA mRNA未转染的表达高频激光1个单元格(美国犹他州)和转染对照si的细胞核糖核酸（siCtrl）或带有si核糖核酸针对c‐Myb（sicMyb）*P（P）= 0.0042英寸美国犹他州Ctrl与超声心动图β.
  11. 假定爱尔兰共和国根据序列分析，miR‐150中的1α解理位点用箭头表示。
  12. 体外重组卵裂试验爱尔兰共和国1α和miR‐150（左）或XBP公司‐1（右）。
  13. miR‐150表达于高频激光‐1个用TGF公司β在不存在4μ8C的情况下，然后用放线菌素D（ActD）处理4和24小时*P（P）= 0.027与TGF公司β.

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给定值。误差条表示s.e.m。n个=3英寸（A–E，G–J，M）和n个=4英寸（F）。可在线获取此图的源数据。

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miR-29和miR-148的水平不受4μ8C治疗的影响

误差条表示s.e.m。n个= 4.

根据TargetScan（Lewis等,2003). 一些研究表明，miR‐150抑制c‐Myb表达（Lin等,2008; 冯等,2014; 杨等,2015)而c‐Myb反过来可以增加αSMA的表达（Kitada等,1997; 巴克等,2000; 郑等,2013). 因此，我们研究了miR‐150是否可以调节HFL1成纤维细胞中c‐Myb和αSMA的表达。用miR‐150表达质粒转染HFL‐1成纤维细胞（图2F） 导致c‐Myb和αSMA蛋白表达降低（图2G和H）支持miR‐150的抗纤维化功能。为了进一步建立c-Myb和αSMA之间的联系，用靶向c-Myb的siRNA转染HFL1成纤维细胞（图2一） ●●●●。与之前的研究一致（Kitada等,1997; 巴克等,2000; 郑等,2013)c‐Myb沉默可降低TGFβ诱导的αSMA表达（图2J） ●●●●。

pre-miR‐150的序列分析显示存在几个推测的IRE1α裂解位点，其中一个位于5′末端10 bp处（图2K） ●●●●。IRE1α可能直接切割miR‐150的可能性是使用在体外裂解试验，使用32P标记的前miR‐150作为底物，与XBP‐1底物对应的合成干环RNA作为阳性对照。发现重组IRE1α裂解前miR‐150，产生约10 bp的小裂解产物（图2五十） ●●●●。添加4μ8C几乎完全抑制了前miR‐150和XBP‐1干环控制的裂解，这证实了4μ8C是IRE1αRIDD活性的抑制剂（图2五十） ●●●●。接下来，用TGFβ和4μ8C预处理HFL1细胞，并用放线菌素D抑制转录4和24小时，以观察miR‐150的稳定性是否受到影响。事实上，4μ8C可以减缓TGFβ处理的HFL1细胞中miR‐150的降解（图2M） ●●●●。因此，miR-150的降解可由IRE1α直接介导，IRE1βRNase活性的丧失导致miR-150水平的增加，从而导致c-Myb抑制和TGFβ诱导的αSMA基因表达的降低。

肌成纤维细胞内质网扩张与XBP‐1剪接耦合

UPR通路的激活，尤其是XBP‐1的剪接，与内质网扩张和分泌能力增加有关（Sriburi等,2004; 波米萨米等,2009). 因此，我们假设内质网应激通过IRE1α剪接XBP‐1介导内质网扩张，并且至少部分是TGFβ诱导的肌成纤维细胞活化和细胞外基质分泌所必需的。TGFβ刺激HFL1成纤维细胞导致内质网扩大（图三A和B）与之前关于肌成纤维细胞的研究（Baum和Duffy，2011). 用4μ8C处理细胞可抑制TGFβ诱导的内质网扩张，表明IRE1α起着核心作用（图三A和B）。为了专门研究XBP‐1的作用，我们用靶向XBP‐）的siRNA处理HFL1成纤维细胞，这导致XBP-1基因表达降低85%（图三C） 并抑制TGFβ诱导的内质网扩张（图三A和B），以及胶原蛋白分泌（图三D） ●●●●。这些观察结果表明，IRE1α-XBP‐1轴通过扩大内质网来应对增加的蛋白质折叠需求，从而有助于肌成纤维细胞的激活。

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急诊室肌成纤维细胞的扩张与XBP公司‐1拼接

  1. 分析急诊室尺寸英寸高频激光1个成纤维细胞用TGF公司β在没有（Ctrl）或爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C，或in高频激光1个细胞转染了si核糖核酸控制si核糖核酸（siCtrl）或带有si核糖核酸瞄准XBP公司‐1（硅XBP公司‐1). 这个急诊室用可视化急诊室追踪红和细胞核用Hoechst染色（左，标尺=20μm）或用电子显微镜染色（右，标尺=200 nm），其中红线标记急诊室.
  2. 量化急诊室（A）中实验装置中相对于原子核的尺寸*P（P）= 按Ctrl键为0.0001，和*P（P）= 0.0223英寸。
  3. XBP公司‐1信使核糖核酸未转染的表达高频激光1个单元格(美国犹他州)以及在用对照si转染的细胞中核糖核酸（siCtrl）或si核糖核酸瞄准XBP公司‐1（硅XBP公司‐1). *P（P）= 0.0001.
  4. 胶原蛋白水平TGF公司β处理的高频激光1按（C）所述转染成纤维细胞*P（P）= 0.005.

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给定值。误差条表示s.e.m。n个=3英寸（B、C）和n个=4英寸（D）。

IRE1α的药理抑制作用减轻肝纤维化

UPR在几种肝病（Malhi和Kaufman，2011). 为了研究抑制IRE1α是否可以减少肝硬化的发展，我们使用了酒精和CCl诱导肝纤维化的小鼠模型4（吉尔茨等,2008). 小鼠出现典型的桥接性肝纤维化，METAVIR评分增加，反映F3‐F4肝硬化（Bedossa&Poynard，1996)（图4A和B）。用4μ8C治疗可减少纤维化（图4A和B）以及中央周围区域αSMA阳性肌成纤维细胞的数量（图4C） ●●●●。纤维化肝脏的大小和重量通常会增加，用4μ8C治疗会降低肝脏与体重的比率，从而进一步支持抑制UPR可以减少疾病进展的假设（图4D） ●●●●。为了验证4μ8C影响UPR的激活，测量了UPR途径的标志物。BiP的mRNA水平（图4E） 和XBP‐1的拼接（图4F） 经4μ8C处理的小鼠肝脏中的含量减少。为了支持miR‐150发挥抗纤维化作用的模型，我们发现从4μ8C处理的小鼠分离的肝组织中miR‐150水平增加（图4G） ●●●●。

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药物抑制爱尔兰共和国1α减轻肝纤维化

  1. The effect of the爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C开启科科斯群岛我4C57诱导的肝纤维化BL公司/组织学测量的6只小鼠美他韦分数。Ctrl键(n个 = 8); 控制键+4μ8C(n个 = 6);科科斯群岛我4(n个 = 6);科科斯群岛我4+4μ8摄氏度(n个 = 8). *P（P）= 0.0077.
  2. 代表性肝组织切片用天狼星红染色以检测胶原蛋白（顶部）和α座椅模块组件（底部）。比例尺=50μm。
  3. α的百分比座椅模块组件‐（A）中实验装置中小鼠肝脏中央周围区域的阳性细胞*P（P）= 0.036.
  4. （A）中实验装置的肝与体重比*P（P）= 0.0031. Ctrl键(n个= 8); 控制键+4μ8C(n个= 6); CCl公司4(n个= 6); CCl公司4+4μ8摄氏度(n个= 8).
  5. 商业保险信使核糖核酸小鼠肝组织中的表达如（A）所示*P（P）= 0.020. Ctrl键(n个= 5); 控制键+4μ8C(n个= 5); CCl公司4(n个= 5); CCl公司4+4μ8摄氏度(n个= 5).
  6. 显示拼接和未拼接水平的典型凝胶XBP公司‐1来自对照组和科科斯群岛我4诱导的肝硬化小鼠和4μ8C治疗的效果。
  7. miR‐150在小鼠肝组织中的表达（A）*P（P）= 与未经处理的对照组相比，为0.032。Ctrl键(n个= 5); 控制键+4μ8C(n个= 5); CCl公司4(n个= 5); CCl公司4+4μ8摄氏度(n个= 5).
  8. αSMA mRNA从小鼠肝脏分离的原代星状细胞中的水平，然后用或不用TGF公司β±4μ8C*P（P）= 0.031,n个 = 3.
  9. 商业保险信使核糖核酸从小鼠肝脏分离的原代星状细胞中的水平，然后用或不用TGF公司β±4μ8C*P（P）= 0.008,n个 = 3.
  10. 小鼠原代肝星状细胞BiP（顶部）或α染色的显微图像座椅模块组件（底部）。比例尺=20μm。
  11. Western blot显示BiP蛋白在原代小鼠肝星状细胞中的表达。
  12. 量化信使核糖核酸表达水平CTGF公司原代人肝星状细胞中的胶原蛋白TGF公司β±4μ8C。

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给定值。误差条表示s.e.m。可在线获取此图的源数据。

肝脏切片的免疫组织化学染色显示，肌成纤维细胞标记物αSMA与UPR标记物BiP和CHOP共定位，这表明活化的HSC有助于观察到的UPR活化增加（图电动汽车2A和B）。此外，从小鼠和在体外用4μ8C处理抑制TGFβ诱导的αSMA和BiP的表达（图4H–K）表明4μ8C的减纤维化作用是通过抑制内质网应激和减少HSC的激活。同样，4μ8C抑制TGFβ诱导的人肝HSC中I型胶原和结缔组织生长因子（CTGF）mRNA的表达（图4五十） ●●●●。这些结果表明，抑制IRE1αRNase活性可以通过阻止HSC成为激活的肌成纤维细胞来减轻肝纤维化。

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活化的肝星状细胞表达UPR（不间断电源）肝纤维化的标志物

  1. 的代表性图像科科斯群岛我4C57诱导的肝硬化BL公司/6只小鼠。肝脏与抗‐α共染色座椅模块组件和抗BiP抗体。比例尺=50μm。
  2. 抗‐α共染肝脏的代表性图像座椅模块组件和反CHOP公司抗体。比例尺=50μm。

抑制IRE1α减少皮肤纤维化

为了研究在IRE1α水平上对内质网应激的干扰是否会影响其他模型中的纤维化，因此可能具有更广泛的适用性，我们使用了皮肤纤维化小鼠模型，其中TGFβ通过皮下植入的微渗透泵持续输注。TGFβ在皮下引起纤维化反应，活化的αSMA表达的肌成纤维细胞数量增加，沉积的胶原蛋白数量增加，在4μ8C处理的小鼠中显著减少（图5A–C）。通过激光捕获显微切割对皮下组织进行选择性分析（图5D） 证实用4μ8C处理降低了αSMA mRNA的表达（图5E） 以及miR‐150水平增加的趋势（图5F） ●●●●。TGFβ处理小鼠的皮肤切片染色显示，肌成纤维细胞标记物αSMA与UPR标记物BiP和CHOP在皮下共定位，这证实了肌纤维细胞中UPR的激活（图电动汽车3A和B）。用4μ8C处理原代小鼠皮肤成纤维细胞同样抑制TGFβ诱导的αSMA表达（图5G和H）和4μ8C也降低了UPR的活性（图5I–K）并增加miR‐150水平（图5五十） ●●●●。这进一步支持了4μ8C通过阻止肌成纤维细胞活化来抑制纤维化。

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抑制爱尔兰共和国1α减少皮肤纤维化

  1. The effect of the爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C开启TGF公司β诱导C57皮肤纤维化BL公司/6只小鼠，通过皮下天狼星红区的百分比进行测量。Ctrl键(n个 = 6); 控制键+4μ8C(n个 = 5);TGF公司β (n个 = 8);TGF公司β+4μ8C(n个 = 8). *P（P）= 0.046.
  2. 代表性皮肤组织切片用天狼星红染色以检测胶原蛋白（顶部）和α座椅模块组件（底部）。比例尺=50μm。
  3. α的百分比座椅模块组件‐（A）中实验装置小鼠皮下的阳性细胞*P（P） = 0.024.
  4. 激光捕获显微切割所选区域的代表性图像（比例尺=100μm）。
  5. α的表达水平SMA mRNA在激光捕获显微切割获得的皮下组织样本中。Ctrl键(n个=5），Ctrl+4μ8C(n个 = 5),TGF公司β (n个 = 5),TGF公司β+4μ8C(n个 = 5). *P（P）= 0.044.
  6. 如（E）所示，相同样本中的miR‐150表达水平。
  7. α的免疫组织化学染色座椅模块组件在用TGF公司β±4μ。比例尺=20μm。
  8. αSMA mRNA小鼠原代皮肤成纤维细胞经TGF公司β±4μ8C*P（P）= 0.049,n个 = 4.
  9. 显示拼接和未拼接水平的琼脂糖凝胶XBP公司‐1在按照指示处理的原代小鼠皮肤成纤维细胞中TGF公司β和4μ8C。
  10. 商业保险信使核糖核酸小鼠原代皮肤成纤维细胞经TGF公司β在4μ8C的存在和不存在下*P（P）= 0.00007用于TGF公司β与Ctrl和P（P）= 0.00002用于TGF公司β与TGF公司β+4μ8C。n个 = 4.
  11. 蛋白质印迹显示CHOP公司按指示处理的原代小鼠皮肤成纤维细胞的蛋白表达TGF公司β和4μ8C。
  12. miR‐150信使核糖核酸按指示处理的原代小鼠皮肤成纤维细胞中的水平TGF公司β和4μ8C*P（P）= 0.00031与未经处理的对照组相比，n个 = 3.

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给定值。误差条表示s.e.m。可在线获取此图的源数据。

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肌成纤维细胞表达UPR（不间断电源）皮肤纤维化的标志物

  1. 对照组或4μ8C处理的C57皮肤的代表性图像BL公司/6只老鼠TGF公司β诱导的皮肤纤维化。皮肤切片与anti-α共染色座椅模块组件和抗BiP抗体。比例尺=50μm。
  2. 小鼠皮肤与抗‐α共染色的代表性图像座椅模块组件和反CHOP公司抗体。比例尺=50μm。

抑制IRE1α可以恢复硬皮病患者肌成纤维细胞的纤维化表型

硬皮病或进行性系统性硬化症（SSc）是一种结缔组织疾病，其特征是严重的多器官纤维化，这是由肌成纤维细胞过度合成细胞外基质（Gilbane等,2013). 为了探索IRE1α可能成为治疗SSc的潜在治疗靶点的可能性，从SSc患者中分离的成纤维细胞用4μ8C治疗。这些实验表明，IRE1α的药理抑制显著降低了CTGF的mRNA水平（图6A） 和胶原蛋白I（图6B） 可溶性胶原蛋白表达（图6C） 在皮肤（dSSc）和肺（LSSc）的成纤维细胞中。SSc患者的成纤维细胞也显示BiP水平升高，用4μ8C治疗后BiP水平降低（图6D） ●●●●。为了进一步研究4μ8C治疗的一般适用性，将来自囊性纤维化（CF）、慢性阻塞性肺病（COPD）和哮喘等炎症性肺病患者的原代肺成纤维细胞暴露于4μ8C。慢性阻塞性肺病、慢性阻塞性肺疾病和哮喘是引起气道慢性炎症的疾病，包括肌成纤维细胞活化和细胞外基质沉积。与对照组相比，哮喘患者的原代成纤维细胞（而非CF或COPD患者分离的成纤维细胞）表达的αSMA和BiP水平显著增加，而经4μ8C治疗后，其水平降低（图6E和F）。这些结果表明，抑制IRE1α不仅可以阻止肌成纤维细胞的形成和激活，而且可以逆转纤维化患者细胞中肌成纤维纤维细胞的纤维化表型。

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抑制爱尔兰共和国1α逆转硬皮病患者肌成纤维细胞的纤维化表型

  1. CTGF mRNA皮肤中的表达水平(分布式支持系统c） 和肺(LSS公司c） 从硬皮病患者中分离成纤维细胞并用爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C*P（P）= 0.018适用于分布式支持系统c（c）(n个=6）和P（P）= 0.003适用于LSS公司c（c）(n个 = 3).
  2. 胶原蛋白1α2信使核糖核酸与（A）中相同样本中的表达水平*P（P）= 0.0030适用于分布式支持系统c和P（P）= 0.0036适用于LSS公司c。
  3. 定量（A）中相同样品中的胶原蛋白水平*P（P）= 0.010.
  4. 免疫组织化学染色检测经4μ8C治疗或未经治疗的硬皮病患者分离的成纤维细胞中的BiP蛋白。比例尺=20μm。
  5. 信使核糖核酸α水平座椅模块组件从囊性纤维化患者中分离的原发性肺成纤维细胞(穿越火线)、慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺病)或哮喘*P（P）= 0.00001用于哮喘与健康对照，以及P（P）= 哮喘患者的ctrl值为0.00003，对照组为4μ8C。
  6. 量化信使核糖核酸与（E）中相同样品中BiP的水平*P（P）= 哮喘与健康对照组之间为0.0023P（P）= 哮喘患者成纤维细胞的4μ8C治疗和对照治疗之间的0.0031。

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给定值。误差条表示s.e.m。n个=3英寸（E，F）。

讨论

越来越多的证据表明，内质网应激和UPR激活是由不同病因引起的不同器官纤维化的特征。在细胞水平上，肌成纤维细胞被认为在纤维化的发展中起着核心作用，但关于内质网应激如何影响成纤维细胞向肌成纤维纤维细胞的激活，人们知之甚少。已有研究表明，用TGFβ处理成纤维细胞可诱导内质网应激和肌成纤维细胞的形成，而这种应激可通过提高内质网蛋白折叠能力（Baek等,2012). 在本报告中，我们进一步定义了UPR在肌成纤维细胞分化中的直接作用，因为我们提供了抑制IRE1α阻止TGFβ诱导的肌成纤维纤维细胞形成的证据。

最近的研究发现，IRE1α能够降解miR，除了众所周知的降解mRNA的能力外，还提供了调节肌成纤维细胞活化（Upton等,2012). IRE1α、miRs和RISC机制的组件位于粗面ER膜（丹尼尔斯）的细胞溶质侧等,2009; 锂等,2013; 斯塔尔德等,2013)，这将允许IRE1α和miR之间直接相互作用。miR‐150的序列分析揭示了几个推测的IRE1α裂解位点（‐TGCT‐）（Upton等,2012)我们的数据表明，IRE1α直接裂解miR‐150，为在TGFβ处理的成纤维细胞中抑制IRE1β时观察到的miR‐的水平增加提供了一种机制。IRE1α对pre-miR-150的裂解可能会破坏pre-miR‐150的稳定性，从而阻止Dicer进一步加工，如另一种核糖核酸酶MPCP1（铃木等,2011). 先前对分离的HSC的研究同样表明，TGFβ降低了miR‐150水平，mi‐150的过度表达抑制了TGFβ诱导的αSMA和I、IV型胶原的表达（Buck等,2000; 郑等,2013). 这些结果与miR‐150在纤维化条件下降低并与疾病严重程度相关的报道相结合（Honda等,2013)表示miR‐150的抗纤维化功能。

miR‐150的首要靶基因之一是转录因子c‐Myb（Lin等,2008; 冯等,2014; 杨等,2015). 已知c‐Myb与αSMA启动子结合，HSC中c‐Myb的过度表达增加αSMA的表达，而反义c‐Myb抑制αSMA表达（Buck等,2000). 此外，miR‐150已被证明通过调节转录因子SP1（Zheng等,2013). 这些发现表明，TGFβ等纤维化诱导剂通过激活IRE1α诱导内质网应激。激活的IRE1α随后降解miR-150，消除miR-150对转录因子（如c-Myb和SP1）表达的抑制作用。这些转录因子水平的增加对肌成纤维细胞的形成至关重要，因为它们可以诱导αSMA和I型胶原的表达。在正常条件下，miR‐150会持续抑制纤维化前转录因子的表达，并阻止肌成纤维母细胞的形成。

激活的IRE1α使通常抑制蛋白质翻译的miR失活的类似机制已被证明用于其他生物反应。例如，先前已经证明，增加caspase‐2表达和诱导凋亡可能是IRE1α激活导致miR破坏的结果，而miR在正常条件下抑制caspase∙2表达（Upton等,2012). 在没有任何额外刺激的情况下，抑制这些miR可增加caspase‐2。此外，另一项研究表明，由于激活的IRE1α破坏miR‐17，导致硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）增加，而miR-17则介导TXNIPmRNA的降解（Lerner等,2012).

在平行通路中，当成纤维细胞受到TGFβ刺激时，我们观察到IRE1α和XBP依赖性ER大小增加。增大的内质网可使肌成纤维细胞在伤口愈合和纤维化过程中增加细胞外基质蛋白的生成和折叠。有人认为，XBP‐1的剪接以及因此对内质网应激的激活通过增加内质网膜中磷脂的生物合成促进内质网容量的增加（Sriburi等,2004). XBP‐1在膜生物生成中的功能作用最初被描述为将B淋巴细胞分化为分泌抗体的血浆B细胞（Reimold等,2001)后来也用于胰腺β细胞内质网扩张（Lee等,2005)肝细胞（Lee等,2008).

总之，我们的研究表明，UPR的激活是各种器官纤维化病理的保守机制，用抑制剂4μ8C靶向IRE1αRNase活性可能是进展性纤维化疾病患者的潜在治疗策略。我们认为IRE1α参与肌成纤维细胞活化有两种机制（图7). 首先，IRE1α的RIDD活性负责降解抗纤维化miR‐150，使c-Myb活性增加，导致αSMA表达增加，从而导致肌成纤维细胞的形成增加。其次，IRE1α介导XBP‐1的剪接，导致内质网扩张，从而增强分泌细胞外基质蛋白所需的分泌能力。

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角色模型爱尔兰共和国肌成纤维细胞激活中的1α

如果没有急诊室应激，miR‐150抑制c‐Myb表达以防止c‐Myb诱导的α座椅模块组件表达式。急诊室例如，由于纤维化刺激而产生的压力会激活爱尔兰共和国1α直接裂解和灭活miR‐150，导致c‐Myb表达增加，从而导致α表达增加座椅模块组件以及肌成纤维细胞的激活。此外，爱尔兰共和国1α介导的XBP公司‐1信使核糖核酸导致急诊室细胞外基质蛋白的扩张和分泌能力增强。抑制内核糖核酸酶活性爱尔兰共和国1α乘以4μ8C将导致miR‐150水平增加，随后c‐Myb和α降低座椅模块组件水平。用4μ8C处理也会减少XBP公司‐1剪接，急诊室基质蛋白的产生、扩增和分泌。

材料和方法

细胞培养和试剂

人胎肺成纤维细胞（HFL1，ECACC）常规培养于补充了非必需氨基酸、25 mM HEPES（Sigma）、10%FBS（Gibco）、2 mM谷氨酸（Gibco2）和1 mM丙酮酸钠（Gibco-1）的MEM中。细胞在37°C和5%CO下培养2饥饿时，使用无FBS的刺激和迁移生长培养基。

用组织块生长法从皮肤和肺中分离出原代细胞。不久，从成年小鼠尸体上获得新鲜组织，用PBS冲洗，切割成5毫米2切片，随后加入培养基（DMEM、10%FCS、青霉素、链霉素和真菌带）的培养板中，使成纤维细胞生长。使用蛋白酶/胶原酶消化法分离小鼠肝星状细胞，然后进行Nycodenz梯度离心（Maschmeyer等,2011). 如前所述分离人肝星状细胞（Rombouts等,2012). 从硬皮病患者或正常对照受试者的皮肤或肺组织中移植和培养成纤维细胞（英国皇家自由医院Chris Denton教授馈赠的礼物）。患者符合美国风湿病学会标准。所有样本均在知情同意后获得，并经当地研究伦理委员会（皇家自由医学院地方研究伦理委员会）（Ponticos等,2015). 本研究中的每个原代细胞系都来自不同的个体或小鼠。

在补充有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养WT或IRE1α缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）（来自桑福德-伯纳姆研究所R.J.考夫曼的礼物）。在FGM‐2培养基（CC3131和CC4134，Lonza）中培养哮喘患者（194912，Lonsa）、COPD患者（195277，Lonze）和CF患者（194843，Lonz）以及健康对照组（CC-2512；Lonza）的原代肺成纤维细胞。

对于在体外实验中，使用胰蛋白酶-EDTA（Gibco）分离细胞，再悬浮在生长培养基中，并以5×10的密度进行电镀三细胞/厘米2细胞在饥饿16小时之前可以附着并保持8小时不受干扰。之后，添加含有指示生长因子或物质的新鲜饥饿培养基。除非另有说明，否则将细胞暴露在5 ng/ml TGFβ和/或100μM 4μ8C的温度下48小时。先前的研究表明，浓度高达128μM的4μ8C不会产生可测量的毒性，浓度为100μM会完全抑制XBP‐1剪接（交叉等,2012). 将放线菌素D（A1410，Sigma）以5μg/ml的浓度添加到细胞中。

miR裂解分析

前-miR‐150由赛默飞世尔科学公司使用miRBase中已发表的序列合成(网址：www.mirbase.org). 去磷酸化前miRNA的末端标记为32P-ATP，并在37°C的反应缓冲液（20 mM Hepes、50 mM NaCl、1 mM DTT、10 mM ATP）中与2.5μg重组IRE1α孵育6小时。使用15%变性聚丙烯酰胺凝胶溶解裂解产物。将干燥的凝胶暴露在放射自显影胶片上过夜。XBP‐1微茎环由Integrated DNA Technologies合成，处理过程与miR‐150前相似。预miR‐150和XBP‐1微阀杆回路序列见表EV1.

mRNA或miRNA的定量RT-PCR和XBP‐1剪接分析

根据制造商的说明，使用Qiagen miRNeasy Mini试剂盒从组织或细胞培养物中分离RNA。简单地说，使用miScript II RT Kit逆转录500 ng miRNA/mRNA，并使用总结于表EV2。使用行动B/RPS18/TBP（待定）对于mRNA和鼻子68/序号95通过将半定量PCR产物与PstI酶在37°C（Calfon等,2002). 上部未消化产物对应于XBP‐1剪接变体，如在1.5%琼脂糖凝胶中迁移后所示。

转染和核感染

使用脂质体LTX和PLUS试剂将300 ng IRE1αWT、K599A或K907A和miR‐150表达质粒（由D.Bartel提供，Addgene#26310）瞬时转染HFL1细胞24小时。在Ingenio电穿孔溶液（Mirus Bio LLC）中使用Amaxa Nucleofector程序S‐05完成了siXBP‐1（sc‐38627，Santa Cruz）、sic‐Myb（4392420，Life Technologies）、si‐miR‐150（219300，Qiagen）或siCtrl（100 pmol）的核作用。隔夜饥饿细胞，然后用5 ng/ml TGFβ和/或4μ8C（100μM）处理48小时。

动物实验

从Scanbur（丹麦）获得8周龄雄性C57Bl/6小鼠。小鼠被安置在标准条件下，具有正常的暗-光循环。让动物适应环境1周，并给予随意在整个实验过程中获得水和食物。在开始实验之前，将小鼠随机分为不同的治疗组。在实验期间，每周给小鼠称重两次，并使用卡罗林斯卡研究所健康监测模板评估其健康状况，总分>0.4或单项得分>0.3被视为安乐死的人道终点。样本量根据以往经验确定（Geerts等,2008; 范德维尔等,2010; 范·斯坦基斯特等,2011).

皮肤纤维化模型

在异氟烷（Forane）麻醉下，在32只小鼠皮下植入含有TGFβ（在0.1%生理盐水中加入200 ng）或对照物（在生理盐水中注入0.1%BSA）的微型渗透泵（Alzet 1003D，1μl/h）。术后镇痛（Temgesic）每天提供3天。小鼠每天在植入部位附近皮下注射10μg/g 4μ8C生理盐水或0.08%二甲基亚砜生理盐水（对照）。3天后，使用4毫米活检针进行皮肤活检。

肝硬化模型

16只小鼠每周注射两次CCl4将（Sigma）（1:1溶于橄榄油；1 mg/kg）和5%乙醇添加到饮用水中。同样，16只对照小鼠接受生理盐水溶液（1 ml/kg），不添加酒精。小鼠每周注射两次10μg/g 4μ8C生理盐水或0.08%二甲基亚砜生理盐水（对照组）。15周后，对小鼠实施安乐死，并从肝脏取样。

染色和免疫组织化学

将组织样品在4%多聚甲醛中固定24小时，随后包埋在石蜡中。将5微米载玻片切割并干燥过夜。切片在染色前脱蜡并重新水化。胶原蛋白用苦味酸红染色法染色，培养时间为30分钟，然后在蒸馏水中洗涤10分钟。对于αSMA的免疫组织化学染色，在95°C的柠檬酸钠缓冲液中进行抗原回收，使用3%H阻断内源性过氧化物酶活性2O（运行）2在与一级抗体（A2547，Sigma）孵育1小时之前，使用小鼠对小鼠染色试剂盒（ab127055，Abcam）阻断内源性小鼠IgG，然后使用以DAB为底物的HRP偶联二级抗体孵育。在一级和二级抗体培养后3×10 min，在TBS‐T（0.1%Triton X‐100）中清洗载玻片。用迈尔苏木精对载玻片进行复染。对于皮肤和肝组织的免疫荧光染色，在95°C的柠檬酸钠缓冲液中进行抗原回收，并按照制造商的方案使用啮齿动物阻断缓冲液（ab127055，Abcam）阻断内源性小鼠IgG。样品在4°C下与抗αSMA（A2547，Sigma）、BiP（ab21685，Abcam）和/或CHOP（sc575，Santa Cruz）的一级抗体孵育过夜。二级抗体（Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555）的培养时间为20分钟，细胞核用Hoechst染色5分钟。

为了对培养中的细胞进行染色，将细胞固定在4%多聚甲醛中10分钟，用PBS清洗，并用PBS中的1%BSA+0.1%吐温封闭30分钟，然后用抗αSMA（克隆1A4，Sigma）或BiP（ab21685）抗体培养1小时。二级抗体（Alexa Fluor 488）用20分钟孵育，细胞核用Hoechst染色染色5分钟。使用配备DS‐Qi1Mc相机和尼康平面Apo物镜的尼康日食90i显微镜采集图像。NIS‐Elements AR 3.2软件用于保存和导出图像。使用ImageJ软件合并免疫荧光图像的不同通道（RGB）。如前所述（Ruifrok和Johnston，2001).

胶原蛋白测量

刺激48小时后收集细胞培养基，并按照制造商的方案，使用Sircol检测试剂盒（BCS1000，Nordic BioSite，Täby，Sweden）测量可溶性胶原蛋白的浓度。

免疫印迹法

对样品进行裂解，并使用BCA试剂测定蛋白质浓度。用标准SDS-PAGE技术分析等量的蛋白质。将膜与相应的抗体孵育（参见表EV2)并使用Li‐Cor Odyssey成像系统进行分析。

激光显微切割

将小鼠皮肤样本嵌入OCT中，切成8μm的切片，并安装在框架载玻片上（POL‐Membrane 0.9μm，Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）。将切片固定在丙酮中，用无核糖核酸酶的水清洗，然后用无核糖核糖核酶的苏木精（Arcturus®组织基因®染色液，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）1分钟，脱水，干燥。使用徕卡LMD6000 B显微镜对皮下组织进行激光显微解剖。如前所述，对显微切割层中的mRNA或miRNA表达进行量化。

ER膨胀的量化

对于ER染色，细胞用HBSS清洗一次，并用1μm ER‐Tracker Red（Invitrogen）培养30分钟。37℃下用3.7%甲醛固定5分钟后°C、 细胞用Hoechst进行复染，并用蔡司LSM 700共焦显微镜观察。利用ImageJ软件对内质网形态进行盲目量化。对于电子显微镜图像，细胞固定在2%多聚甲醛和0.25%戊二醛的PBS中，后固定在1%OsO中4，并嵌入Epon（美国弗吉尼亚州伯灵顿Ladd Research Industries）。在Jeol 1230电子显微镜（Jeol，Akishima，Tokyo，Japan）中在100kV下研究该材料。电子显微照片是使用Gatan 791型多扫描相机和Gatan数字显微照片软件3.6.4版（美国加利福尼亚州普莱森顿Gatan）拍摄的。

统计

数据以平均值±标准误差表示。未配对、双尾学生的t吨‐测试用于比较不同组；一P（P）<0.05被认为具有统计学差异。

研究批准

动物研究伦理委员会批准了所有涉及动物的方法（C45/13和C95/14）。

作者贡献

FH参与了研究设计、动物实验和在体外工作。FB参与了研究设计在体外实验。MP参与了硬皮病患者成纤维细胞的实验。KR为患者提供肝星状细胞。JL协助激光捕获显微解剖。JK和PG参与了研究设计和项目管理。所有的作者都为手稿的写作做出了贡献。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

论文解释道

问题

纤维化的特征是纤维结缔组织过度堆积，这通常发生在慢性炎症反应中。尽管纤维化几乎影响身体的每一个组织，并且是各种疾病发病率和死亡率的主要原因，但很少有专门针对纤维化发病机制的治疗方法。

结果

我们提供证据表明，内质网应激传感器IRE1α通过直接切割和灭活miR‐150来介导纤维化。在正常条件下，miR‐150抑制c‐Myb表达，从而抑制成纤维细胞中c‐Myb诱导的αSMA表达，从而阻碍激活的肌成纤维细胞的形成。此外，我们发现IRE1α介导的XBP‐1剪接是激活的肌成纤维细胞内质网扩张所必需的，这可能是支持细胞外基质蛋白分泌增强的机制。使用抑制剂4μ8C抑制IRE1α可以抑制TGFβ诱导的肌成纤维细胞活化在体外，减少肝脏和皮肤纤维化体内，并恢复从系统性硬化患者分离的活化肌成纤维细胞的纤维化前表型。

影响

我们的结果表明，内质网应激可能是纤维化发病机制中一个重要且保守的机制，内质网膜应激途径的靶向成分可能与治疗纤维化疾病相关。

支持信息

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审查流程文件

图1的源数据

图2的源数据

图4的源数据

图5的源数据

致谢

我们感谢Paul O'Callaghan博士在编写手稿期间提供的宝贵意见。FH由Wenner‐Gren基金会和Cancerfonden资助。PG由位于乌普萨拉的Barncancerfonden、Cancerfonden和狮子癌症研究基金资助。Cancerfonden支持JK。FB由魁北克圣母基金会支持。

笔记

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文章来自EMBO分子医学由以下人员提供自然出版集团