可卡因自我给药和消亡导致伏隔核核心星形胶质细胞GFAP表达和形态计量学特征降低

行为训练

每天同一时间，在标准大鼠模块化试验室（Med Associates）中进行所有操作训练（2h/次）。在开始自我服用可卡因之前，动物接受了一次食物训练课程（10-12小时），在该课程中，主动杠杆按压导致服用一粒45毫克的食物颗粒（Bio-Serv）。在食物训练后，动物每天摄入约20克食物。可卡因的自我给药是按照FR1计划进行的，每次输注0.2毫克，配以灯光和音调（70–72分贝）。每次输液后都有20秒的超时时间。在自我给药的前两天，输液上限为40次，此后不受限制。自我给药的标准是接受至少10次可卡因注射10天，然后进行14-16次绝灭训练。可卡因由NIDA药物供应计划提供。头孢曲松（Hospira Worldwide，Inc.，Lake Forest，IL 100 mg/kg，i.p.）或溶媒（无菌盐水）在最后十次灭绝前30分钟服用。

蛋白质印迹和免疫组织化学

在免疫印迹法中，动物在最后一次灭绝训练24小时后被迅速斩首。在0.32M蔗糖、10mM HEPES（pH 7.4）和蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（Thermo Scientific）中均质组织。在1000×g离心10 min后，通过12000×g离心20 min，将上清液分离为粗膜部分和粗细胞溶质部分。通过BCA方法（Thermo Scientific）测定S2细胞溶质中的蛋白质含量在Bio-Rad BisTris凝胶上分离10µg，并转移到PVDF膜上，然后使用抗GFAP（Abcam，ab7779，1:1000）和抗GAPDH（Cell Signaling，1:2000）进行探测。

对于GFAP免疫组化，动物在最后一次消光后24小时用戊巴比妥进行深度麻醉，并灌注150 mL 1×PB，然后灌注200 mL 4%多聚甲醛（PFA）于1×PB。大脑在4%PFA中1×PB中过夜固定。然后将大脑转移到含0.1%NaN的1×PB中的30%蔗糖中_三在4°C下放置1-2天，然后转移到1×PBS中，并在低温恒温器上切片45µm。对连续切片（每6个切片，在Bregma前约2.6至1.0mm）进行GFAP染色，并使用VIP过氧化物酶底物进行可视化，如下所示：用10%正常山羊血清（NGS）在PBST中封闭切片一小时，并在室温下在含有3%NGS的PBST中的抗GFAP（Abcam ab7779，1:1000）中探测过夜。切片在含有3%NGS的PBST中洗涤三次（每次10分钟），并在PBST+3%NGS中的生物素化山羊抗兔（Vector Labs，1:200）中室温孵育1小时。然后在PBST+3%NGS中清洗切片两次，在PBS中清洗一次。切片在室温下与ABC（Vector Labs）孵育，并在PBS内清洗三次，然后在VIP中显影15秒（Vectors Labs，SK-4600）。切片再次在PBS中清洗三次（每次10分钟），然后在PB中清洗3×10分钟。将切片装入PB中的干净载玻片（Superfrost Plus）上，在乙醇中干燥和脱水，并使用Permount添加盖玻片。

体视细胞计数

使用无偏的体视学细胞计数方法定量估计NAc核心中GFAP免疫反应（GFAP-ir）神经元的总数(23,24). 简单地说，光学分馏器系统包括一个计算机辅助图像分析系统，包括一个尼康Eclipse E-600显微镜，该显微镜与Previor H128计算机控制x个–年–z（z）机动舞台、Olympus-750摄像机系统、Micron Pentium III 450计算机和体视学软件（Stereoinder，MicroBrightField Inc.；Colchester，VT）。在低倍镜（10倍）下，通过NAc核心的口-口范围，每6个截面勾画出NAc核心，并采用解剖器计数框（100×100µm）的系统随机设计测量轮廓区域。实际安装截面厚度为35–37µm，每个截面的顶部和底部设置了2µm的保护区。使用带有1.4数值孔径的40×物镜对计数框内的细胞进行计数。从位于嘴侧位置的NAc核心中选择第一个切片是随机的，每6个切片都进行计数，这是一个系统的随机设计。计算GFAP-ir神经元总数。为NAc核心细胞计数绘制的轮廓包括含有GFAP-ir细胞的区域，不包括前连合。

星形胶质细胞成像和共定位

为了进行荧光成像和共定位研究，用戊巴比妥（100 mg/kg）对动物进行深度麻醉，并灌注200 mL PB，然后灌注200 mL 4%多聚甲醛于1×PB中。大脑固定4-5小时，然后在4°C下转移至1×PBS。在振动仪上制备伏隔肌冠状片（100µm），并在含有2%Triton-X100的1×PBS中洗涤3次5 min，然后用含有2%Triton X-X100的2×PBS的2%NGS封闭1 h。然后在4%℃下将切片与兔抗突触蛋白-1多克隆抗体（Abcam Ab8，1:500）在2%的NGS-PBST中孵育过夜。切片在1×PBST中清洗三次，每次5分钟，然后在室温下用Alexa-594结合羊抗兔抗体（1:1000，Life Technologies）清洗8小时，然后在使用ProLong Diamond Antifade（Life Technologies）进行滑盖安装之前再清洗三次。

使用配备氩（Ar 488nm）、氪（Kr 568nm）和氦氖（He-Ne 633nm）激光线的徕卡激光扫描共聚焦显微镜（徕卡SP6旋转盘共聚焦）获得Z堆栈。GFP使用488 nm波长和荧光素滤光片组进行激发，Alexa 594标记的突触蛋白使用568 nm波长及罗丹明样滤光片集进行采集。所有图像均使用63倍油浸物镜和1倍数字变焦因子采集。采集设置如下：1024×1024帧大小，12位图像分辨率，帧平均值为4，步长为2µm。Z堆叠通常在22–35µm的范围内。注意确保所选星形胶质细胞通过x、y和z平面完整，且不重叠(图S2). 获取的Z堆栈被导出到BitPlane Autoquant反褶积软件（10次迭代）(25). 反褶积后，使用Bitplane Imaris 3D图像分析软件（瑞士苏黎世）进行彩色化分析。只有当病毒转导发生在伏隔核核内时，才拍摄Lck-GFP图像(22).

使用同位化模块，使用Imaris软件分析了去卷积的3D z堆栈。所有图像在分析之前都会被裁剪，以减小文件大小并隔离单个单元格。对于背景校正，使用同位化模块（ImarisColoc）的2D散点图为每张图像根据经验设置GFP和Alexa 594信号阈值。在手动设置阈值、阈值后，手动检查3D z堆栈的每个切片，以确保准确确定共定位。计算每个通道的阈值信号强度/总信号强度。我们还记录了数据集共定位的百分比（相对于体素总数的归一化共定位百分比）。成像和分析是星形胶质细胞以无偏见的方式进行的，对各组都是盲的。

可卡因自我给药和绝灭后，Accumbens核心星形胶质细胞的表面积、体积和与突触标记物的共定位减少

类似于富含星形胶质细胞的蛋白质GLT-1和xCT(9)，我们观察到在可卡因自我给药和绝灭后，NAc核心中GFAP的表达降低。然而，GFAP只占星形胶质细胞总体积的一小部分，并不局限于神经元和突触接触的外周过程(26,27). 为了验证下调的GFAP与星形胶质细胞形态学的可量化改变相关的假设，我们在GFAP启动子的控制下，用编码膜相关GFP（Lck-GFP）的AAV病毒载体转导NAc核心细胞。将11个氨基酸Lck标签包含在用于标记星形胶质细胞的载体中，通过将荧光标记的表达限制在质膜上，大大增强了精细外周星形胶质细胞过程的可视化(21,28). 病毒输注产生的转导细胞场显示出NAc核心的星形胶质细胞形态(图2,S1（第一阶段）). 检测并选择具有隔离边缘的星形胶质细胞进行分析(补充图S2). 在免疫组织化学实验中，除了标记星形胶质细胞的精细突起外，GFP表达细胞还与GFAP共同注册(图S1)，表明Lck-GFP的胶质细胞型特异性表达。

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图2

AAV5 GFAP Lck GFP驱动GFP向NAcore星形胶质细胞的膜表达

A） Lck-GFP转导的NAcore星形胶质细胞的10×图像。病毒GFP表达以绿色显示，GFAP免疫组化以红色显示。合并图像（以及IMARIS中的3D共定位分析以白色显示）显示GFP和GFAP信号的大量共注册，表明星形胶质细胞特异性转导。最右边的白色面板显示包含病毒GFP和GFAP IHC信号的体素。比例尺为150 um。B）单个转导星形胶质细胞的63×Z系列图像显示绿色的膜定位GFP表达，红色的GFAP免疫组化。合并图像和白色共同定位分析均显示GFP和GFAP信号的共同定位，再次表明GFP在NAc核心中的星形胶质细胞特异性表达（参见图S1对于来自高倍率z系列数据集的各个平面的图像）。比例尺为10µm。

在自我给药实验中，训练动物对FR1强化可卡因或生理盐水的时间表作出反应。自我给药后，通过反复的消退训练，反应消失，按压杠杆不会导致给药可卡因或生理盐水(图3A). 在最后一次灭绝后24小时，制作了脑切片并进行了成像。在图像采集之后，使用IMARIS软件测量了每只动物4–12个细胞的表面积和体积，并对每个星形胶质细胞基于强度的空间填充模型进行了反褶积和渲染(图3B、C). 这些分析表明体积减少了19%（生理盐水31242+/-1722微米^三，可卡因25313+/−1110微米^三; （t）₍₂₆₎=2.894，p=0.008）(图1D)表面积减少21%（生理盐水27008+/−1035微米²，可卡因23279+/-1063微米²; t吨₍₂₆₎=2.513，p=0.019）服用可卡因后(图3B).

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图3

可卡因或盐水治疗后单个NAcore星形胶质细胞的3D重建

A） 训练动物自我服用可卡因或生理盐水，然后进行灭绝训练。在绝灭训练期间，一组服用可卡因的大鼠接受了生理盐水或溶媒。B） 按照啮齿动物行为程序，使用来自AAV5 GFAP-Lck-GFP转导细胞的星形胶质细胞GFP信号生成三维空间填充模型。在对Z系列数据集进行反褶积后，构建了IMARIS生成的三维体，再现了用膜定位GFP转导的星形胶质细胞的形状和轮廓。然后使用空间填充模型确定表面积（微米²)和体积（微米^三)暴露于可卡因或生理盐水后NAc核心星形胶质细胞。C） 根据IMARIS空间填充星形胶质细胞模型的分析，可卡因暴露显著降低了星形胶质细胞的体积（如上所示图2). 双尾t检验显示，接触可卡因后显著减少。可卡因暴露也显著减少星形胶质细胞表面积，*p<0.05，**p<0.01。

如前所述，使用IMARIS共定位软件工具包对突触和星形胶质细胞GFP信号进行共定位分析(29)包括基于强度的Lck-GFP和突触素体素在3D体积中的联合注册测量。值得注意的是，这里测量的共定位并不表明突触蛋白在胶质细胞中表达或嵌入。由于精细星形胶质突起与神经元突起之间的密切关系(30)我们认为这种测量是星形胶质细胞过程和突触接近度的指标。我们的数据表明，星形胶质细胞Lck GFP和突触蛋白信号的配准显著降低，观察到包含这两种信号的高于阈值的体素百分比降低47%(图4A、B、D; （F）_(2,30)=4.678，p<0.05））。IMARIS将该值定义为共同定位的感兴趣区域百分比（%ROI）（生理盐水0.10+/-0.015%ROI；可卡因0.05+/-0.007%ROI）(图4D). 这些数据表明，接触可卡因后，NAc核心星形胶质细胞与突触的近端接触较少。重要的是，我们观察到GFP（生理盐水43%+/-2.3%，可卡因42.8%+/-1.7%）或突触素（生理盐水35%+/-3.3%，可可卡因36%+/-1.7%）信号的体素强度高于阈值的百分比没有显著差异，表明表达的变化不太可能解释观察到的共定位变化。

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图4

可卡因暴露后NAcore星形胶质细胞内突触素I与胶质细胞膜定位GFP的三维共聚焦分析

在生理盐水或可卡因自我给药后，用AAV5 GFAP-Lck-GFP病毒转导的动物脑组织用突触标记物突触蛋白染色。IHC后，对单个星形胶质细胞进行病毒GFP表达和突触蛋白酶成像。使用IMARIS，使用共定位工具包评估突触素和GFP之间的共定位水平。A） 给盐动物的病毒GFP显示为绿色，突触蛋白I显示为红色，这是一个合并图像以及共定位通道，其中包含这两个信号的体素显示为白色。B） 该面板显示了A中描述的相同情况，即动物在自给可卡因和绝灭训练后出现的情况。C） 与A中描述的情况相同，在自给可卡因和接受头孢曲松治疗的绝灭训练后的动物中。D） 使用IMARIS共定位工具包，计算每只动物4–12个细胞的星形胶质细胞膜特异性GFP和突触蛋白信号的共同定位感兴趣区域的百分比。可卡因自我给药和消退训练显著降低了星形胶质细胞GFP与突触素的共定位量，而在消退训练期间使用头孢曲松可以逆转这一现象。*p<0.05。

精神疾病中低反应性星形胶质细胞的证据

在脑损伤或炎症的情况下，GLT-1表达减少通常与反应性星形胶质细胞和GFAP表达增加有关(10–12,19). 然而，越来越多的证据表明，在精神病患者中，尤其是焦虑、压力或抑郁患者，GLT-1表达下降与GFAP表达下降相一致。例如，慢性而非急性皮质酮治疗后，皮层和海马中的GFAP mRNA下调，而星形胶质细胞标记物ALDH1L1不变(35). 慢性束缚应激导致GFAP和GLT-1在乳管周围灰质的表达降低(36)在前额叶皮层观察到GFAP免疫反应和星形胶质细胞GLT-1表达的缺失(37,38)和下丘脑(39)在抑郁症的动物模型中。此外，在抑郁症的临床前动物模型以及精神疾病的人类尸检研究中，GFAP的表达减少，尤其是抑郁症和精神分裂症（有关综述，请参阅(40–42)). 事实上，来自人类文献的大量证据表明，胶质细胞功能障碍、更具体地说是星形胶质细胞密度降低和星形胶质细胞介导的谷氨酸摄取可能反映了物质使用障碍和抑郁症之间高度共病的细胞特征(43).

这项工作得到了NIH拨款R00DA031790（KJR）和T32-DA07244（KLH）以及R015369和DA003906（PWK）的支持。作者感谢Baljit Khakh博士赠送Lck-GFP质粒。