慢性淋巴细胞白血病B细胞在乳样细胞共培养和BCR刺激后高水平表达T细胞趋化因子CCL3和CCL4

摘要

介绍

B细胞慢性淋巴细胞白血病（CLL）的特点是单克隆CD5的积累⁺血液、次级淋巴组织和骨髓中的B细胞。¹大多数循环中的白血病细胞在G₀/G公司₁细胞周期的阶段；因此，主要缺陷可能是对凋亡的抵抗，而不是加速细胞分裂。²然而，体外CLL细胞发生自发凋亡，这表明这种体外条件缺乏白血病细胞生存所必需的因素，并且对凋亡的抵抗并非白血病B细胞固有的。CLL细胞的体外凋亡可以通过与作为CLL微环境的一部分的不同辅助细胞（例如单核细胞衍生的苗圃样细胞（NLCs））共培养来防止，^三–6间充质骨髓基质细胞（MSCs），^三,7,8或滤泡树突状细胞，⁹为CLL细胞提供生存信号。NLC从单核细胞分化为大的、圆形的粘附细胞，吸引CLL细胞，并以接触依赖的方式保护它们免受自发或药物诱导的细胞死亡。^三,4,10因为这些细胞与培育发育中的胸腺细胞的胸腺护理细胞具有共同的特征，¹¹我们将这些细胞命名为“nurselike细胞”^三CLL患者的脾脏和次级淋巴组织中可以发现NLC⁴从而代表了次级淋巴组织微环境的模型。高水平的CD68使NLC与CD68相当⁺滤泡性淋巴瘤中的淋巴瘤相关巨噬细胞。¹²尽管仍有争议，但一些研究表明高CD68⁺微环境中的细胞含量与滤泡性淋巴瘤的侵袭性临床病程和不良预后相关，^12–14提示淋巴瘤细胞和单核/巨噬细胞系辅助细胞之间的细胞间相互作用在支持淋巴组织中肿瘤B细胞的生长和耐药性中发挥作用。此外，T细胞是CLL微环境的组成部分。在CLL假卵泡（PFs）中，CLL细胞与T细胞呈增殖簇分布。^15,16PFs是CLL组织病理学的一个标志性发现，被认为是该疾病的增殖室。^17–19在PFs中，T细胞与CLL细胞密切接触并表达活化标记物，如CD40配体（CD154）。^15,20此外，接触活化的CD4⁺T细胞诱导Survivin¹⁵和CD38表达¹⁶在PFs的CLL细胞中，表明T细胞在这些区域促进CLL细胞的激活和增殖。^16,17然而，促进T细胞与CLL细胞共定位的因素在很大程度上尚不清楚。¹⁶

最近，基于体外工作和对CLL组织标本的相关研究，已经确定了一些参与CLL细胞与其微环境之间相互作用的分子。我们表征了CXCL12（SDF-1），一种由MSCs组成分泌的趋化因子²¹和NLC，^三作为CLL细胞的趋化和抗凋亡因子，通过其同源受体CXCR4发挥作用，CXCR4在CLL细胞上高水平表达。^21,22CXCR4拮抗剂使CLL细胞在基质共培养中对化疗药物敏感，^10,23因此，我们建议将CXCL12-CXCR4轴作为CLL的治疗靶点。^三,10然而，我们最初^三以及随后的研究⁶表明CXCR4-CXCL12轴不是CLL-NLC串扰中唯一的生存途径。^10,23最近，我们报道了NLC表达另一种趋化因子CXCL13，该趋化因子与CLL细胞上高水平表达的CXCR5趋化因子受体结合。^24,25与CXCL12类似，CXCL13是另一种由B细胞卵泡中的基质细胞组成性分泌的稳态趋化因子，它将循环B细胞募集到卵泡中。^26,27除CXCL12和CXCL13外，NLC还表达肿瘤坏死因子（TNF）家族（BAFF）的B细胞激活因子，BAFF是一种增殖诱导配体（APRIL），⁶CD31和丛蛋白B1，⁵这也保护了CLL细胞免于凋亡，表明NLC使用多种不同的途径支持CLL细胞存活。

本研究的目的是分析纯化的CLL细胞与NLC共培养后诱导的基因表达变化。首先，我们对这种实验方法的可行性感兴趣，该方法用于解剖CLL细胞与其微环境之间的分子串扰。除了上调B细胞成熟抗原(BCMA公司)在先前关于该分子在CLL-NLC相互作用中重要性的研究中，这似乎并不特别令人惊讶，^6,28我们发现了2种T细胞趋化因子的强大上调，CCL3级和CCL4级在CLL细胞中与NLC共培养。我们还发现，CLL与NLC共培养物中有大量CCL3和CCL4蛋白，而NLC被一种特定的Syk抑制剂抑制。B细胞受体（BCR）触发也可诱导CCL3和CCL4分泌。这些新发现表明，CLL细胞在创造支持性微环境中发挥积极作用，并可以解释为什么CLL细胞与T细胞在组织微环境中，尤其是在PF中散布。

方法

结果

CLL细胞与NLC共培养后的基因表达反应

我们观察到，与NLC共培养后，CLL细胞的基因表达反应相对均匀。表1基于至少6个配对样本中至少3倍的上调和所有样本中的总体平均上调，显示了NLC共培养中上调最多的10个基因。图1A显示了相应的热图，显示了NLC共培养后CLL细胞中前10个上调和下调基因相对于从PB分离后立即基线表达的情况。如中所述表1，NLC共培养诱导的前10个基因是CC趋化因子CCL4级，的BCMA公司(TNFRSF17型)，早期生长反应蛋白3基因(埃及镑3)，CC趋化因子CCL3级，磷酸丝氨酸氨基转移酶1(PSAT1型)，N-myc原癌基因(MYCN公司)，早期生长反应蛋白2基因(表皮生长因子2)，未标记的基因序列KIAA0101号机组，犬尿氨酸3-羟化酶(哈萨克斯坦国家石油公司)和Fc受体样5基因(FCRL5型). 因为高级表达和CCL3级和CCL4级以前没有在CLL中进行过研究，我们随后的研究重点是这两种趋化因子。微阵列数据可以在基因表达综合数据库中的登录号下找到GSE13811标准(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

表1

CLL细胞与NLC共培养后上调的基因

基因名称	调节超过3倍的病例数	9个样本的平均上调，倍数变化
CCL4级	7	10.16
TNFRSF17型	7	6.72
埃及镑3	7	5.97
CCL3级	6	6.09
PSAT1型	6	4.98
MYCN公司	6	4.96
表皮生长因子2	6	4.84
KIAA0101号机组	6	4.39
哈萨克斯坦国家石油公司	6	3.93
FCRL5型	6	3.31

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此表按降序显示与NLC共培养后CLL细胞中前10个上调基因。左列显示基因名称。中间一栏显示显示3倍以上基因上调的CLL配对标本数量（共9例）。右栏显示了所有9例患者中基因的平均上调。

CCL4级表示CC趋化因子；TNFRSF17型，B细胞成熟抗原(BCMA公司);埃及镑3早期生长反应蛋白3基因；CCL3级CC趋化因子；PSAT1型，磷酸丝氨酸氨基转移酶1；MYCN公司，N-myc原癌基因；表皮生长因子2早期生长反应蛋白2基因；KIAA0101号机组无特征基因序列；哈萨克斯坦国家石油公司，犬尿氨酸3-羟化酶；和FCRL5型，Fc受体样5。

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图1

DNA微阵列分析确定了与NLC共培养后CLL细胞的均匀基因表达反应（A）这些热图描述了与NLC共培养14天（14d NLC）前后9个不同CLL细胞样本中上调（图中前10行）或下调（图中后10行）的前10个基因。在Ficoll分离和CD19纯化后以及NLC培养开始之前（黑色方块），描述了每个基因相对于其表达水平的基因表达变化。根据热图下方显示的颜色方案，红色和绿色阴影分别表示特定基因的上调或下调。显示了9个不同CLL患者样本的表达反应，如上横轴所示。（B） 为了说明ZAP-70型表达式和CCL3级和CCL4级归纳，ZAP-70型根据微阵列分析的结果，将单个CLL患者的基因表达分为高或低，并与CCL3级和CCL4级NLC共培养前后的表达。在CLL病例中ZAP-70型基因表达（病例1、3、6、7和9），NLC共培养一致诱导CCL3级和CCL4级而在ZAP-70基因表达低的病例中，反应更为异质（没有诱导CCL3级和CCL4级情况2；病例4、5和8的中间诱导）。

CLL-NLC共培养上清液中CCL3和CCL4蛋白的高水平表达

为了确定我们是否观察到CCL3级和CCL4级微阵列分析的基因表达与相应蛋白的产生和分泌增加有关，我们通过ELISA检测了长期培养的CLL细胞上清液中的CCL3和CCL4蛋白。培养2天后(图2)CCL3和CCL4水平通常较低，CCL4的水平较高且异质性更强(图2C） ●●●●。相反，我们在培养7天和14天后检测到两种趋化因子的高水平，这与NLCs的生长相吻合。我们早些时候报道，早在培养开始后的3到4天，就可以在CLL PBMC培养物中观察到NLC，7天后，可以观察到NLCs平台的数量。^三 图2说明了20名不同患者CLL细胞上清液中CCL3和CCL4蛋白表达的动力学和可变性，说明了不同时间点的平均CCL3及CCL4水平(图2A） 以及单个患者的CCL3蛋白水平(图2B） 和CCL4(图2C） ZAP-70中⁺和ZAP-70⁻患者。表S1和S2中详细列出了与这些数字相对应的准确蛋白质浓度。ZAP-70的CLL-NLC共培养⁺患者通常表现出较高水平的CCL3(图3A） 和CCL4(图3B） ZAP-70以上⁻患者。然而，这些差异在统计学上并不显著（表S3、S4）。

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图2

在CLL-NLC共培养中诱导CCL3和CCL4蛋白表达如“NLC共培养前后从CLL B细胞中分离RNA”所述，将CLL PBMC与NLC一起生长放置在长期培养物中。为了确定CCL3和CCL4蛋白表达诱导的动力学，我们通过ELISA分析了水平轴上所示时间点的上清液样本。（A） 由线条连接的不同符号表示指定时间点20名不同CLL患者样本中CCL3和CCL4的平均浓度。根据微阵列数据，我们发现CCL4蛋白表达高于CCL3。（B，C）20例CLL病例中CCL3和CCL4的个体蛋白质表达数据以点图显示。ZAP-70型⁺病例（•）可与ZAP-70区分⁻病例（○）。

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图3

ZAP-70中CCL3和CCL4蛋白的表达⁺和ZAP-70⁻CLL案例显示了ZAP-70上清液中CCL3（A）和CCL4（B）蛋白浓度的平均值和SEM⁺CLL样本(，n=10）或ZAP-70⁻CLL样本(，n=10）。在ZAP-70中⁺CLL样本中，我们发现所有时间点的CCL3和CCL4水平都较高。然而，这些差异并没有达到统计学意义。

抗IgM刺激保护CLL细胞免受凋亡

自身或自身抗原可以持续刺激CLL细胞上的BCR，与来自微环境的其他信号一起，似乎对促进CLL细胞生存和生长至关重要。¹BCR与抗IgM的交叉链接在体外模拟了这一途径，尽管并非所有CLL病例（仅～50%）对BCR刺激都有反应，但在非突变的ZAP-70中对抗-IgM有优先反应⁺CLL病例。^1,39,40根据已发表的研究，生存，^31,41而不是凋亡，⁴²似乎CLL细胞对抗IgM刺激更常见的反应，使用10至20μg/mL的抗-IgM浓度。^31,41在我们的患者样本中，我们注意到轻度到中度的增加(图4)与仅在培养基中培养的对照CLL细胞相比，抗IgM刺激24小时和48小时后存活率降低（100%）。24小时后，14μg/mL的对照组的平均生存率为125.8%±23.4%（平均±SD，n=4），42μg/mL抗IgM的对照组为124.9%±25.1%（平均±标准偏差，n=4）。48小时后，使用14μg/mL抗-IgM的平均生存率为121.8%±24.3%，使用42μg/mL的抗-IgM111.6±31.9%。

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图4

BCR参与保护CLL细胞免受凋亡给出了一名患者的CLL B细胞轮廓图，定义了相对绿色（DiOC₆)CLL细胞在水平轴和垂直轴上的红色（PI）荧光强度。在单独培养基（对照）或补充有抗IgM单克隆抗体的培养基中培养24小时后，在上述各等高线图所示的浓度下测定存活率。这种染色使我们能够进入重要的细胞群（DiOC₆^明亮的，PI^排除)、凋亡细胞（DiOC₆^昏暗的，PI^排除)和死亡细胞（DiOC₆^昏暗的，PI^积极的). 每个门旁边都显示了每个细胞群的百分比。在这种情况下，抗IgM刺激保护了大约20%的细胞免于凋亡，在14μg/mL抗IgM时产生56.5%的存活群体，在42μg/mL抗IgM时产生55.1%的存活群体。右下角的条形图显示，在4种不同的CLL样本中用抗IgM培养后，CLL细胞的活性增加。将CLL细胞培养在单独培养基（对照）或补充有指定浓度的抗IgM单克隆抗体的培养基中，并在24和48小时后通过DiOC染色评估存活率₆和PI。显示的是4个不同患者样本的平均值正负SD。

IgM刺激诱导CLL细胞分泌CCL3和CCL4蛋白

在这里，我们用不断增加的抗IgM浓度培养CLL细胞，并在24小时后通过ELISA检测CLL上清液中的CCL3和CCL4蛋白。如所示图5，将CLL细胞与抗-IgM孵育24小时后，CCL3和CCL4的剂量依赖性诱导介于0.5和10μg/mL抗-IgG之间，在浓度大于10μg/mL时达到稳定。仅在培养基中或补充抗CD40的CLL样品未显示出任何显著的CCL3或CCL4水平（表S6、S7）。

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图5

BCR作用后CLL细胞诱导CCL3和CCL4蛋白表达：抗IgM剂量反应将CLL细胞置于补充了不同浓度抗IgM的培养基中，如纵轴所示。以单独培养的CLL细胞作为对照。24小时后，取上清液并通过ELISA检测CCL3（A）和CCL4（B）蛋白的表达。显示的是CCL3和CCL4的平均浓度（±SD，n=3），如横轴所示。虽然抗IgM诱导CCL3和CCL4的剂量依赖性诱导，但仅在培养基中培养的CLL细胞并没有显著表达CCL3或CCL4。

BCR刺激对CLL细胞分泌CCL3和CCL4蛋白的影响

在本实验中，我们用15μg/mL的抗IgM刺激CLL细胞不同时间，并在指定的时间点测定CLL上清液中的CCL3和CCL4蛋白水平(图6). 培养开始后2小时，检测到上清液中CCL3和CCL4水平的首次增加，并且在随后的几个小时内，直到24小时的时间点，水平持续增加(图5). 24小时后，CCL3和CCL4水平趋于稳定，表明24小时达到最佳反应。

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图6

BCR参与后CLL细胞表达CCL3和CCL4蛋白的时间进程将CLL细胞置于培养基中，并用15μg/mL抗IgM刺激。在横轴上指示的时间点取下上清液，并通过ELISA检测CCL3（A）和CCL4（B）蛋白的表达。由线条连接的不同符号表示指示时间点4个不同CLL样本中的CCL3和CCL4浓度。

Syk抑制剂R406在与NLC共培养的CLL细胞中抑制CCL3和CCL4的分泌

用特异性Syk抑制剂R406孵育CLL细胞几乎完全消除了与NLC共培养的CLL细胞对CCL3和CCL4分泌的诱导作用。R406在24小时和48小时显著降低了CLL-NLC共培养上清液中可检测到的CCL3和CCL4水平(P（P）<.05，n=4），如所示图7表明在CLL-NLC共培养中诱导CCL3和CCL4分泌是Syk依赖性的，因此可能涉及BCR。

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图7

Syk抑制剂R406消除与NLC共培养的CLL细胞对CCL3和CCL4分泌的诱导横轴上显示，条形代表4名不同患者的CLL细胞上清液中CCL3和CCL4的平均（±SEM）浓度，这些患者在有或无Syk抑制剂R406的情况下与NLC孵育24或48小时。如星号所示，R406显著抑制CLL细胞分泌CCL3（A）和CCL4（B）的诱导P（P）24小时（*）和48小时（**）时的值小于0.05。单独在NLCs的上清液中未检测到显著的CCL3或CCL4浓度（数据未显示）。

慢性淋巴细胞白血病患者血浆中CCL3和CCL4水平升高

CLL细胞在体内对BCR刺激（或微环境中的其他刺激）可能产生CCL3和CCL4；因此，预计CLL患者的这些趋化因子水平会升高。因此，我们用ELISA检测了CLL患者和健康志愿者的血浆样本中的CCL3和CCL4蛋白。CLL患者的平均CCL3血浆水平为47.2±7 ng/mL（平均±SEM，n=67），而健康对照组为20.5±0.3 ng/mL。CLL患者的平均CCL4血浆水平为107.7±29 ng/mL（平均±SEM，n=67），而健康对照组为35.7±5.1 ng/mL(图8). 然而，CLL患者和对照组的血浆水平之间的差异没有达到统计学意义。具有不良预后特征的CLL患者血浆中CCL3和CCL4水平较高，尤其是β-2微球蛋白大于4mg/dL、IgVH基因非突变状态或CD38大于20%⁺CLL单元格（未显示数据）。

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图8

慢性淋巴细胞白血病患者和健康志愿者血浆中CCL3和CCL4蛋白水平此条形图显示了67份CLL患者和正常献血者（n=9）血浆样本中CCL3和CCL4的平均（±SEM）浓度，如横轴所示。与正常血浆相比，CLL血浆中CCL3和CCL4的水平较高，表明CLL细胞在体内分泌这些趋化因子。

讨论

尽管在过去几年中，人们越来越重视探索肿瘤微环境作为潜在的治疗靶点，但我们目前面临着寻找合适的方法来剖析肿瘤细胞与宿主之间复杂的细胞和分子相互作用的困难。在本研究中，我们共培养了CLL细胞和NLC，以模拟CLL细胞与CD68之间的相互作用⁺体内NLC。尽管体外模型永远无法完全概括体内微环境，但最近的几项研究表明，该模型与组织室（如次级淋巴组织）中的体内微环境非常接近。CLL患者的淋巴组织中检测到完全分化的NLC，⁴在这个系统中，正常B系细胞生物学所必需的几个分子途径是可操作的。因此，我们决定使用该模型对CD19-纯化的CLL细胞与NLC共培养前后的基因表达进行系统分析，以发现CLL细胞与其微环境之间相互作用的新分子途径。

首先，这项研究证明了这种方法的可行性，正如一个相对均匀的基因表达谱所表明的那样，它可以诱导和下调一些与微环境相互作用和/或CLL细胞存活有关的有趣基因(图1A） ●●●●。根据已发表的文献，3个基因的诱导，CCL3级,CCL4级、和BCMA公司，对于CLL细胞与微环境的相互作用显得尤为重要。BCMA在CLL细胞与NLC相互作用中的重要性已经被一些最近的研究所强调，^6,28因此，我们重点研究趋化因子CCL3和CCL4的表达、诱导和可能的功能。

巨噬细胞炎性蛋白-1（MIP-1）最初从内毒素（脂多糖）刺激的巨噬细胞上清液中纯化。⁴³随后对两种不同但高度相关的蛋白质MIP-1α和MIP-1β进行了表征；根据目前的趋化因子命名法，CC趋化因子亚家族的这些成员现在被称为CCL3和CCL4。⁴⁴CCL3和CCL4的表达可在大多数成熟造血细胞中诱导。B细胞和树突状细胞在各种刺激下产生CCL3和CCL4，如BCR触发、CD40配体、脂多糖或TNF-α。⁴⁵在Boyden小室趋化试验中，CCL3和CCL4是单核细胞的有效趋化剂⁴⁶和淋巴细胞，^47,48尽管这些趋化因子对不同T细胞亚群的活性仍存在争议。⁴³与CXCL12（SDF-1）相比，CCL3和CCL4是更有效的化学引诱剂，也就是说，它们需要更低的浓度才能达到最大活性（1-10 ng/mL）。^47,48CCL3通过趋化因子受体CCR1和CCR5发出信号，而CCL4仅通过CCR5趋化因子接收器发出信号。⁴⁴CCR5除了作为T细胞和单核细胞/巨噬细胞上的趋化因子受体的生理功能外，还作为嗜M型HIV-1菌株的辅助受体。⁴⁹CCL3和CCL4与多种人类疾病有关，如类风湿关节炎、，⁵⁰炎症性和自身免疫性中枢神经系统疾病，如多发性硬化，⁵¹或呼吸道炎症性疾病。⁴³在多发性骨髓瘤（MM）中，CCL3增强破骨细胞的形成并促进MM细胞的迁移和存活。⁵²活动性MM患者骨髓血浆中CCL3水平升高，⁵²微阵列研究确定，MM细胞的CCL3表达与疾病活动相关。⁵³这些研究得出结论，CCL3和CCL4的局部（过表达）诱导辅助细胞（尤其是淋巴细胞）的募集，也可能向肿瘤细胞提供生长信号。

最近的体外实验表明CCL3和CCL4在淋巴组织中具有更特异的功能⁵⁴和体内⁵⁵研究。与BCR结合的抗原在幼稚、记忆和生发中心B细胞中选择性诱导CCL3和CCL4。⁵⁴BCR刺激后正常B细胞中CCL3和CCL4蛋白释放的动力学与我们在CLL细胞中的观察结果非常相似，在最初的24小时内快速增加，随后趋于稳定(图6). 此外，Krzysiek等人报道，B细胞对CCL3和CCL4分泌的诱导仅限于BCR刺激，而抗CD40mAbs和白细胞介素-4（IL-4）刺激没有效果。⁵⁴因为观察到CD4⁺CD45RO⁺T细胞沿着BCR刺激的B细胞形成的趋化梯度以CCL3和CCL4依赖的方式迁移，Krzysiek等人认为，这种机制允许Ag特异性T细胞和B细胞之间的招募和同源相互作用。⁵⁴最近，Castellino等人强调了淋巴结中CCL3和CCL4表达在诱导特异性免疫反应期间T细胞募集到抗原呈递细胞（APC）T细胞相互作用位点的体内重要性。⁵⁵在一个优雅的疫苗接种模型中，他们证明CD8⁺T细胞上调CCR5，使这些T细胞迁移到CD4位点⁺针对CCL3和CCL4的T细胞/树突细胞相互作用。

T细胞在慢性淋巴细胞白血病发病机制中的作用仍存在争议。CLL细胞可以对T细胞传递的信号作出反应，如CD40配体（CD40L），这反过来可以促进CLL细胞的存活和增殖。^15,56此外，还有相当数量的CD4⁺CLL假卵泡中的T细胞，^20,57,58这种疾病的增殖室。¹⁷在此背景下，Ghia等人报道了CLL细胞对CD40结扎反应诱导另一种T细胞趋化因子CCL22。²⁰因此，CLL细胞可以根据刺激方式分泌至少3种不同的T细胞趋化因子。考虑到我们的模型中CCL3和CCL4的诱导是均匀的，CLL患者中这些趋化因子的血浆水平升高，以及体内证据表明CCL3与CCL4对T细胞向淋巴组织募集至关重要，⁵⁵似乎CCL3和CCL4在CLL-T细胞相互作用的T细胞招募中起主导作用。

ZAP-70是CLL的预后标志物，在CLL的BCR信号传导中起重要作用。⁴⁰在分析微阵列数据时，我们注意到CLL细胞的ZAP-70表达与NLC共培养中CCL3和CCL4 RNA的诱导之间的相关性(图1B和S1）。我们还注意到来自ZAP-70的上清液中CCL3和CCL4蛋白水平较高的趋势⁺CLL-NLC共培养(图3)然而，这并没有达到统计显著性。这组数据表明，ZAP-70标记了BCR反应更强烈的CLL病例，这些病例反过来可以对BCR刺激产生更显著的CCL3和CCL4反应。另一方面，当通过抗IgM关联ZAP-70和CCL3/CCL4蛋白诱导时缺乏显著性，这表明ZAP-70.CCL3/CCL4的信号可能不会直接参与，而CCL3/CC的信号可以通过其他BCR信号成分转导，例如Syk，而不是ZAP-70-正如我们使用Syk抑制剂R406的数据所表明的那样。

根据我们的发现，抗IgM刺激BCR可诱导CCL3/CCL4分泌(图5,​,6),6)，人们很容易推测，NLC共培养物中的CCL3和CCL4诱导可能是CLL细胞通过BCR激活以响应NLC呈递的抗原的结果。我们发现R406（一种特异性Syk抑制剂）显著抑制了CLL-NCL共培养中CLL细胞对CCL3和CCL4蛋白分泌的诱导，这一假设得到了加强(图7). 因为Syk（与ZAP-70一起）是BCR信号传导的关键分子，这一发现表明BCR确实被CLL-NCL相互作用激活。然而，还需要进行额外的实验来验证这一假设，并阐明参与这种相互作用的机制和可能的抗原。一种方法可能是确定NCL共培养诱导的CLL细胞表达谱，尤其是CCL3和CCL4的诱导是否为NLC特异性发现。在初步实验中，我们发现与MSCs共培养在CLL细胞中诱导了不同于NLC诱导的表达模式的不同表达模式。更具体地说，与NLC相比，MSCs没有诱导CLL细胞中CCL3和CCL4的表达（数据未显示）。我们小组目前正在进行的实验集中于CLL-MSC共培养诱导的CLL细胞表达谱的表征。

NLC表示BAFF和APRIL，⁶通常由单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞表达。BAFF和APRIL是正常B细胞发育和功能的有力调节器^59,60并保护肿瘤B细胞，如CLL细胞^28,61或MM单元格⁶²从经历细胞凋亡。BCMA是TNF超家族的一种受体，结合BAFF和APRIL，优先在浆细胞和扁桃体记忆B细胞上表达。⁶³调节BCMA表达的特定信号在很大程度上尚不清楚。在BAFF诱导记忆B细胞向Ig分泌B细胞分化的过程中，CD40和BAFF-R表达下调，而BCMA表达上调，^63,64表明BAFF通过BCMA上调促进分泌Ig的B细胞的存活。此外，用CpG/IL-2和IL-15刺激B细胞可诱导BCMA表达。⁶³因此，很容易推测与NLC共培养在CLL细胞中诱导类似的激活/分化反应，导致我们在NLC共培育后观察到的BCMA诱导(表1,图1).

总之，我们的数据表明CLL细胞在NLC共培养和BCR刺激下分泌CCL3和CCL4。白血病B细胞分泌这些趋化因子可以在淋巴结微环境中促进高效的CLL–T细胞相互作用，因此可能与微环境的其他信号一起参与CLL克隆的繁殖。Syk抑制剂R406在抑制CLL-NLC共培养物中CCL3和CCL4诱导方面的高效性为进一步探索CLL-NLC共培养物BCR激活的可能性提供了理论基础。此外，CLL细胞分泌T细胞趋化因子表明CLL细胞不是被动的“种子”，而是创造有利微环境的积极参与者。

致谢

脚注

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