跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
集成生物（Camb）。作者手稿；2017年6月13日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
集成生物（Camb）。2016年6月13日；8(6): 720–728.
数字对象标识：10.1039/c6ib00027d
PMCID公司：项目经理4905794
尼姆斯：NIHMS785653
PMID：27162057

逐步软化水凝胶模拟肝星状细胞在纤维化消退过程中的行为

史蒂文·卡利亚里,1 玛丽娜·佩雷佩利尤克,2 伊丽莎白·M·索拉斯,1 李吉云,1 丽贝卡·G·威尔斯,2和杰森·A·伯迪克1
作者信息 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

细胞外基质（ECM）为常驻细胞提供了一组不断演变的机械线索。我们开发了含有稳定和水解可降解交联物的甲基丙烯酸透明质酸（MeHA）水凝胶，为细胞提供逐渐软化（但不完全可降解）的环境，模拟纤维化消退等生理事件。为了证明这种细胞培养系统的实用性，我们研究了在这种软化环境中大鼠肝星状细胞的表型，它是纤维原性肌成纤维细胞的主要肝前体。在组织培养塑料上进行机械预处理的星形细胞获得了肌成纤维细胞表型，当接种到坚硬（~20 kPa）水凝胶上时，该表型持续存在。然而，刚-软（~20至~3 kPa）水凝胶上机械激发的星状细胞在14天内表现出肌成纤维细胞表型的逆转，细胞面积减少，肌成纤维标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，以及带有PDZ结合基序的Yes相关蛋白/转录辅活化因子（YAP/TAZ）的表达与刚性水凝胶上的星状细胞相比，细胞核定位。然而，硬到软的水凝胶上的细胞并没有完全恢复。他们表现出胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达降低，并对肌成纤维细胞进行异常快速的再激活，以应对通过引入额外交联物而使水凝胶重新硬化的反应。据报道，这些特征是具有中间表型的星状细胞的典型特征体内随着纤维化的消退和再损伤。总之，这些数据表明力学在纤维化回归中起着重要作用，将动态力学线索整合到模型系统中有助于捕捉观察到的细胞行为体内.

关键词：水凝胶、动力学力学、肝纤维化、肝星状细胞、YAP/TAZ、肌成纤维细胞

图形摘要

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-7885653-f0001.jpg

1.简介

组织纤维化在发达国家普遍存在，是导致40%以上死亡的因素。1肝纤维化和原发性肝癌（在大多数情况下与纤维化相关）每年在全世界造成170多万人死亡。2纤维化机制的关键是，常驻成纤维细胞和周细胞根据机械和可溶性线索进行肌纤维母细胞分化，成为成纤维细胞并合成过多的纤维细胞外基质（ECM）蛋白，如I型胶原。这一过程的可逆性因器官而异，但在肝脏中尤其显著，肝脏在去除有害刺激后会经历显著的纤维化消退。有趣的是，虽然最近使用小鼠模型的研究表明，纤维化肝脏中约一半的肌纤维母细胞肝星状细胞（主要肌成纤维细胞群）发生凋亡，但其余的肌成纤维纤维细胞获得了一种“中间”表现型与健康星状细胞相似，但以基因表达异常和反复损伤后肌纤维母细胞异常快速再分化为特征，这一发现可能对肝纤维化患者的护理具有重要的临床意义。三,4虽然力学在星状细胞向肌成纤维细胞分化中起着关键作用，但组织力学在回归（和重复分化）期间介导星状细胞表型变化中的作用尚不清楚。

鉴于组织硬化是纤维化进展的临床指标，并且ECM硬化可能是纤维化和肿瘤形成开始的重要因素，5-7因此，组织软化可能在纤维化消退中发挥作用。水凝胶已被证明是研究细胞机械传导的有用基质，因为它们能够模拟显著的ECM特性，包括力学、含水量和促进细胞粘附。然而，大多数细胞培养研究使用的是机械静态材料，无法再现纤维化进展和消退等过程的动态本质。

已开发出几种水凝胶系统，利用DNA交联、，8水解降解交联剂，9,10或光可分解基团。11-13特别是，Anseth小组使用可光降解的软化水凝胶来研究干细胞分化，11成纤维细胞机械传导，12以及细胞对不同机械剂量的机械记忆反应。13虽然这些方法利用了水凝胶刚度的阶跃变化，但组织力学是以渐进的方式发展的，因此应用尽可能模拟这种行为的系统是有用的。Zustiak等人使用聚乙二醇基水凝胶与含有水解可溶酯基团的交联剂聚合，合成了一系列水解可降解水凝胶，其降解时间按天的顺序逐渐增加9适用于蛋白质输送等生物医学应用。10然而，由于这些材料完全可降解，因此不适合研究长期的细胞-微环境相互作用。

在这项工作中，我们使用了一种透明质酸（HA）水凝胶系统，该系统包含稳定的和水解可降解的交联物，为细胞提供一个逐渐软化的环境。选择HA是因为它易于化学修饰14及其过去在机械生物学研究中对几种细胞类型的应用，包括肝星状细胞。15,16我们对水凝胶进行了机械表征，并研究了活化的肝星状细胞对软化环境的反应，作为纤维化消退的验证性研究。最后，我们研究了我们的机械动态培养平台是否能够捕获所观察到的与临床相关的中间星状细胞表型的元素体内在纤维化消退后，无论是在重复侮辱（再强化）事件之前还是之后。

2.材料和方法

2.1 MeHA合成

如前所述，透明质酸（HA）被甲基丙烯酸酯修饰17(图1A). 将透明质酸钠（Lifecore，75 kDa）以2 wt%溶解于去离子水中，并与甲基丙烯酸酐（5.6 mL/g NaHA）在冰上反应6 h，同时持续保持pH值在8.0-9.5范围内。然后将溶液在室温下相对于去离子水透析7天（SpectraPor，6-8kDa分子量截止值）并冻干。甲基丙烯酸酯对初级羟基的改性程度为~90%，测量方法如下1核磁共振氢谱（布鲁克）。用1 mM硫代RGD（GCGYG）进一步修饰MeHARGD公司-SPG，GenScript）通过Michael型添加（45分钟，室温，pH 9），以允许细胞粘附。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-785653-f0002.jpg
逐步软化水凝胶基质的制备方法

（A） 用甲基丙烯酸酯（MeHA）和RGD修饰的透明质酸（HA），通过HA上的甲基丙烯酸酯和RGD肽上的硫醇之间的迈克尔型加成。（B） 交联剂，用于RGD改性MeHA的交联，以产生稳定（DTT）或含酯类水解不稳定性（DTT，PETMA）水凝胶。（C） 通过DTT交联设计为具有相对静态机械性能的软或硬水凝胶，或通过DTT和PETMA的组合交联设计为动态软化（刚到软）水凝胶。

2.2 MeHA水凝胶制造

通过Michael型添加剂制备RGD改性MeHA水凝胶。仅使用二硫苏糖醇（DTT，Sigma）或DTT和季戊四醇四（巯基乙酸）的组合（PETMA，TCI Chemical）交联3 wt%MeHA(图1B). 对于软静态组和硬静态组，DTT与MeHA混合，分别消耗20%和65%的可用网络甲基丙烯酸酯。用DTT（0.2硫醇：甲基丙烯酸盐比率）和PETMA（0.6硫醇：甲丙烯酸盐比率。将水凝胶前体溶液（pH 9，50μL）移到甲基丙烯酸酯盖玻片之间18（22×22mm）和未经处理的盖玻片（18×18mm），然后在室温下聚合3h，形成共价附着在甲基丙烯酸盖玻片上的水凝胶薄膜（~100μm厚）。

2.3水凝胶力学和溶胀特性

使用动态力学分析（DMA、TA仪器）测量水凝胶弹性模量。水凝胶样品在37°C的PBS中储存14天，并在第0、1、3、5、7、10和14天进行力学分析。以每分钟10%的应变率压缩样品，并根据10-20%应变之间的应力应变曲线斜率计算弹性模量。体积膨胀比(问五)根据水凝胶湿重计算(米w个)在每个时间点和原始水凝胶干重(米d日)，使用以下方程式，其中水凝胶聚合物的密度（ρ第页)和溶剂（ρ秒)假设为1.23 g mL−1和1 g mL−1分别地19:

问五=1+ρ第页ρ秒(米w个米d日−1)

2.4水凝胶降解定量

在14天的过程中，评估了水解过程中的水凝胶降解。水凝胶在37°C的PBS中培养，在每个机械测试时间点后进行缓冲液更换。缓冲样品在−80°C下保存，直至分析。测量缓冲液样品中的尿酸含量以确定HA质量损失。20

2.5肝星状细胞分离

如前所述，分离Sprague-Dawley大鼠肝星状细胞。21所有研究都是按照宾夕法尼亚大学动物护理和使用委员会的规定，按照美国国立卫生研究院的《实验动物护理与使用指南》（NIH出版物85-23，1996年修订）进行的。简言之，就地肝脏酶消化通过依次灌注0.4%的蛋白酶（罗氏诊断）和0.04%的胶原酶II（沃辛顿）进行。然后将所得浆液在最小基本培养基（MEM）中稀释，并通过粗棉布过滤。将总的细胞悬浮液在0.002%DNase（Worthington）中洗涤两次。通过使用9%Nycodenz（Sigma）1400 g溶液进行密度梯度离心25分钟，从总细胞群中分离星形胶质细胞。然后，在接种到水凝胶或组织培养聚苯乙烯（TCPS）/玻璃之前，将星形胶质细胞在MEM中清洗并储存在冰上。

2.6肝星状细胞机械启动

分离星状细胞后，将细胞直接接种到软水凝胶（见下一节）上，或将细胞接种到TCPS（用于水凝胶的后续实验）或玻璃盖玻片（用于成像）上7天。长时间接触高硬度培养基(E类TCPS/glass>GPa）被广泛认为会导致肝星状细胞肌成纤维细胞活化。22机械启动7天后，星状细胞被胰蛋白酶化并转移到水凝胶中。

2.7 MeHA水凝胶上的肝星状细胞培养

在准备细胞接种时，水凝胶在37°C的PBS中一夜膨胀。然后使用杀菌紫外线（UV）照射对水凝胶消毒2小时，并在接种星状细胞之前在培养基中培养至少30分钟。培养基由无酚红M199培养基（Invitrogen）组成，补充有10v/v%胎牛血清（Sigma）、2v/v%.青霉素-链霉素（Invitorgen）和1v/v%fungizone两性霉素B（Invit罗gen）。将星形细胞接种在无菌水凝胶上，水凝胶放置在6孔板中，密度为5×10三细胞/厘米2。第二天将水凝胶移至新鲜平板和培养基中，随后每3天更换一次培养基。

2.8细胞成像、染色和量化

使用NIH ImageJ分析在蔡司Axiovert 200倒置显微镜（Hitech Instruments，Inc.）上采集的细胞需要水凝胶的相位对比图像，确定星形细胞扩散面积。使用荧光显微镜测定肌动蛋白组织（α-SMA）和F-肌动蛋白）、具有PDZ结合基序的Yes相关蛋白/转录共激活因子（YAP/TAZ）核定位以及神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。星状细胞凝胶在10%的福尔马林缓冲液中固定15分钟，在0.1%Triton X-100中渗透15分钟，并在室温下在PBS中的3%牛血清白蛋白（BSA）中封闭1小时。然后将样品与一级抗体（在封闭缓冲液中稀释）在4°C下孵育过夜。主要抗体靶点包括α-SMA（鼠单克隆抗α-SMA克隆1A4 Ab，Sigma，1:400）、YAP/TAZ（兔多克隆抗YAP，Santa Cruz Biotechnology，1:200）或GFAP（兔单克隆抗GFAP，Abcam，1:2000）。然后将水凝胶在PBS中洗涤三次，并在室温下与适当的二级抗体（AlexaFluor®488山羊抗鼠IgG或AlexaFlu®488羊抗兔，Invitrogen，1:200）孵育2小时，或与罗丹明指骨肽孵育，以可视化F-actin（Invitrogen，1:2000）。最后，水凝胶在PBS中清洗两次，用DAPI核染色（1:10000）处理1分钟，再在PBS内冲洗，并在黑暗中4°C保存在新鲜PBS中，直到成像。所有荧光成像均使用奥林巴斯BX51显微镜（B&B显微镜有限公司）。成像时使用相同的设置（每个通道的曝光时间）以及图像后分析（亮度、对比度）。NIH ImageJ用于计算YAP/TAZ核和细胞质强度。

2.9现场水凝胶再硬化

使用就地我们之前描述的光交联方法在肝星状细胞存在下是细胞相容的，因为在初始交联后仍有甲基丙烯酸酯可用。16在软化14天后，在含有6.6 mM酰膦酸锂（LAP）光引发剂的培养基中培养恒星细胞种子硬-软水凝胶23,24在37°C下保持30分钟。然后用蓝光在10 mW cm照射注入LAP的水凝胶10 min−2使用牙科治疗灯（ESPE Elipar 2500，3M）。光照后，将重新加固的水凝胶在PBS中冲洗两次，以去除多余的LAP，然后放置在新鲜介质中。

2.10统计分析

使用学生的t检验（两组）或单向方差分析（ANOVA）对数据集进行分析，然后进行Tukey-HSD事后检验（两个以上的组）。在所有分析中，至少分析了3种水凝胶和/或30个细胞。单单元格数据的Tukey盒图由对应于数据集第二和第三个四分位的方框组成，带有表示最大值和最小值的误差条（或四分位范围的1.5倍，以较小者为准）。除非另有规定，否则条形图和散点图中的误差是平均值的标准误差。显著性用*、**或***表示，对应于P（P）分别<0.05、0.01或0.001。

3.结果和讨论

3.1具有稳定和可降解交联的水凝胶表现出逐渐软化

我们使用甲基丙烯酸改性透明质酸（MeHA）制造水凝胶，水凝胶逐渐软化，但不会完全降解(图1A). MeHA首先用RGD修饰以允许细胞附着，然后与硫代交联剂组合反应形成水凝胶(图1B). 使用了二硫苏糖醇（DTT）和季戊四醇四（巯基乙酸）（PETMA），这是一种四官能团交联剂，含有用于交联的硫醇基团和用于逐渐水解的酯基团。我们预计，仅用DTT交联的水凝胶将保持相对稳定的机械性能，而用DTT和PETMA组合制备的MeHA水凝胶将因酯水解而逐渐软化，但由于存在稳定的DTT交联，不会完全降解(图1C).

先前的研究表明，肝星状细胞是肝脏中成纤维肌成纤维细胞的主要前体，当在硬度水平类似于纤维化肝脏的坚硬水凝胶上培养时，会分化为成纤维肌成纤维细胞（弹性模量(E类)>10 kPa），而星状细胞培养在柔软、柔顺的水凝胶上，类似于健康肝脏的硬度(E类~1-3 kPa）保持其正常、静止状态，不进行肌成纤维细胞激活。15,25,26因此，对于与DTT交联的软性和硬性静态水凝胶，我们的目标是分别对应于病变和健康肝组织的~15-20 kPa和~1-3 kPa的起始弹性模量。对于刚到软的水凝胶，我们的目标是在14天后达到~15-20 kPa的初始力学，~1-3 kPa的最终力学。水凝胶在14天内的力学特性表明，软质组和硬质组的力学相对稳定(图2A). 尽管僵硬组的弹性模量从~19 kPa降至~12 kPa，但最终僵硬仍能促进肝星状细胞肌成纤维细胞的分化。25

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-785653-f0003.jpg
静态和动态水凝胶的表征

（A） 仅与DTT交联（软或硬）或与DTT和PETMA可降解交联剂组合（硬对软）的水凝胶配方的水凝胶弹性模量、（B）体积膨胀比和（C）HA质量损失。n个>每组每个时间点3个水凝胶。

同时，刚-软组的弹性模量从约17 kPa的初始刚度逐渐降低至约3 kPa，与第14天的软组相比，最终弹性模量没有显著差异。交联密度的逐渐降低也如预期的那样改变了水凝胶的溶胀行为，在14天内观察到刚-软组的溶胀相应增加(图2B). 重要的是，这些水凝胶在14天内没有完全降解并保持其结构完整性。所有实验组均显示出类似的HA质量损失曲线(图2C)确认由于DTT交联，整个HA网络保持类似的稳定性；然而，力学性能的降低表明水解不稳定基团中的交联密度降低。此外，弹性模量(E类)刚性-柔性基团的数据显示了伪一级指数衰减动力学，对应于酯水解导致的交联密度逐渐降低，如下所示：

E类= E类0e（电子）−千吨

降解时间常数(k个)刚-软组为0.124天−1.

3.2肝星状细胞在硬到软的水凝胶上培养时扩散减少

根据我们的水凝胶配方的机械特性，我们评估了在静态和动态MeHA水凝胶上培养的肝星状细胞表型。由于观察到的肿胀行为差异可能会改变RGD配体呈现给星状细胞进行粘附的局部密度，因此我们进行了对照实验，以证明星状细胞与HA水凝胶的粘附是由RGD介导的，并且较低的RGD浓度（0.5 mM对1 mM）没有导致细胞附着减少(图S1).

为了评估星状细胞对改变力学的反应，我们首先通过将新分离的星状细胞接种到塑料或玻璃上7天来诱导肌成纤维细胞分化(图3A). 此机械启动步骤(E类TCPS/glass>GPa）被广泛认为会导致肝星状细胞肌成纤维细胞活化。22然后将星形细胞移到软的、硬的或硬到软的水凝胶中再放置14天。我们假设软环境和硬环境将分别促进获得性肌成纤维细胞表型恢复到静止表型或永存，而硬到软环境组将反映中间表型的逐渐恢复体内其中纤维化的解决需要数周时间。三,4作为对照，将新分离的星状细胞平行直接接种到软静态水凝胶上（无机械启动），并在整个实验期间（总共21天）留在这些水凝胶上。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-785653-f0004.jpg
肝星状细胞在硬到软的水凝胶上培养时，扩散逐渐减少

（A） 水凝胶上星状细胞培养的实验设计示意图。星形细胞最初被镀在TCPS/玻璃上，或在分离后直接镀在软静态水凝胶上。在7天的机械启动后，细胞被移动到软或硬（静态）水凝胶或硬-软水凝胶上。作为对照，将新分离的细胞接种到软水凝胶上，在没有机械启动的情况下再培养14天（总共21天）。（B） 机械启动7天期间的星形细胞相位对比图像和扩散区域。***：P（P）<0.001，玻璃组显著大于软（第7天）组。（C） 在水凝胶上电镀并再培养14天后，星形细胞相位对比图像和扩散面积。***：P（P）<0.001，刚-软组显著大于软组。比例尺：100μm。n个>每组37个细胞/时间点。

正如预期的那样，镀在玻璃上的星状细胞迅速扩散，失去脂滴，7天后呈现成肌纤维母细胞样形态，而接种在软水凝胶上的星形细胞保持圆形，扩散明显减少(图3B). 在预处理后14天的培养过程中，移动到硬水凝胶的活化细胞保持了一致的扩散形态，而软水凝胶上的活化星状细胞迅速适应新的机械环境并变得圆形(图3C). 同时，刚-软水凝胶上的星形细胞逐渐从扩散的肌纤维母细胞样表型转变为更圆的形状，类似于软水凝胶中的星形细胞。14天后，刚-软实验组和软实验组的星形细胞扩散面积没有显著差异。虽然在这些实验中，一些星状细胞可能死亡并脱落，但我们通过活头染色证实，粘附在水凝胶上的星状细胞基本上是活的（>95%，图S2).

3.3机械激发的肝星状细胞在硬-软水凝胶培养后失去肌动蛋白应力纤维组织

除了测量星状细胞扩散面积外，我们还研究了定义成纤维细胞的细胞骨架特征。尤其是，α-SMA的表达和组织成应力纤维是肌成纤维细胞表型的标志。在这里，我们检测了α-SMA和F-actin的组织和应力纤维的形成(图4). 在7天的机械启动后，约70%的星状细胞显示有组织的α-SMA应力纤维，几乎所有（约95%）显示有组织F-actin应力纤维(图4A、B). 相反，软水凝胶上的星状细胞比例明显较低，在应力纤维中显示出α-SMA或F-actin组织。机械激发的星状细胞在刚性水凝胶上保持其肌动蛋白组织，在额外的14天后，90%以上的细胞显示出α-SMA组织(图4C、D). 相反，14天后，软质组和刚-软质组的α-SMA和F-actin应力纤维组织均显著减少，达到与软静态组相当的水平（虚线，图4D). 尽管与软组织组相比，硬组织-软组织组中的细胞显示有组织的F-actin应力纤维的比例明显较高，但预计随着软组织环境中培养时间的延长，这一差距将缩小。此外，虽然先前对肺成纤维细胞的研究表明，当细胞从硬（100 kPa）基质转移到软（5 kPa）基质时，α-SMA表达几乎没有降低，但这可能是由于上述工作中的机械启动时间延长（2周而不是1周），以及细胞类型、生物材料平台、，和刚度调查。27

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-785653-f0005.jpg
机械激发的肝星状细胞在硬-软水凝胶培养后失去肌动蛋白应力纤维组织

（A） 在软水凝胶或玻璃上培养7天的新鲜分离星状细胞的肌动蛋白组织的代表性图像和（B）量化。蓝色：核，绿色：α-SMA，红色：F-肌动蛋白。（C） 在软水凝胶（软静态，虚线）上培养21天的星状细胞的代表性图像和（D）肌动蛋白组织量化，或在软、硬或硬-软水凝胶上培养14天的机械激发星状细胞。蓝色：核，绿色：α-SMA，红色：F-肌动蛋白。(虚线：软静态控制）。***：P（P）< 0.001. 比例尺：100μm。n个>每组26个细胞。

3.4机械激发的肝星状细胞在刚-软水凝胶上显示核YAP/TAZ减少

接下来我们研究了参与肝星状细胞机械转导的信号通路。YAP/TAZ机械感受复合物通过其将细胞外信号传递至细胞核以启动下游转录事件的作用，被认为是机械传递的关键调节器。28近年来，YAP/TAZ已被证明在包括间充质干细胞（MSC）分化在内的多种细胞功能中发挥着关键作用28以及诱导纤维化。29,30有趣的是，YAP/TAZ也被鉴定为与MSC机械记忆相关的细胞内变阻器；长时间暴露于僵硬微环境的MSC表现出核定位测量的YAP/TAZ信号持续激活，并偏向成骨分化。13正如预期的那样，与软水凝胶上的星状细胞相比，机械预处理7天的星形细胞显示出明显更高的核YAP/TAZ(图5A). 当活化的星状细胞在硬水凝胶上培养14天后，核YAP/TAZ定位升高，而软组和硬-软组在细胞核和细胞质之间的YAP/TAZ分布大致相同，这与无机械启动的软水凝胶培养的细胞相似（虚线）(图5B). 这表明YAP/TAZ可能不是肌成纤维细胞机械启动时间的机械记忆标记物。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-785653-f0006.jpg
机械激发的肝星状细胞在刚-软水凝胶上显示核YAP/TAZ减少

（A） 在软水凝胶或玻璃上培养7天的新鲜分离星状细胞的代表性图像和YAP/TAZ染色定量。蓝色：核，绿色：YAP/TAZ公司。（B） 在软水凝胶（软静态，虚线）上培养21天的星状细胞的代表性图像和YAP/TAZ染色定量，或在软、硬或硬-软水凝胶上培养14天的机械激发星状细胞。蓝色：核，绿色：YAP/TAZ公司。(虚线：软静态控制）。***：P（P）<0.001，显著高于其他实验组。比例尺：20μm。n个>每组26个细胞

3.5通过GFAP表达测定，硬-软水凝胶上的星形胶质细胞显示中间表型

虽然星状细胞在刚-软水凝胶上没有维持核YAP/TAZ水平的升高，但我们也评估了其他标记物的表达，这些标记物可能表明活化的肌成纤维细胞和静止的星状细胞之间存在中间表型。先前的一项研究描述了星状细胞采用中间表型体内在纤维化消退过程中，虽然细胞表现为静止状态，大多数标记物（如α-SMA）在消退期间恢复到健康水平，但其他标记物（例如GFAP）则没有。三GFAP是肝内星形细胞群的标记物，在肌成纤维细胞分化过程中下调。然而，在上述研究中，即使在消退一个月后，GFAP的表达仍然下调。三在我们的实验期间，在软静态水凝胶上培养的近80%的肝星状细胞GFAP染色呈阳性（虚线，图6). 然而，所有三个实验组的GFAP阳性细胞比例显著降低（<25%），这些实验组在TCPS上进行了7天的机械启动，然后再被水凝胶（软、硬、硬-软）包裹。至关重要的是，这些结果表明基质力学的变化可能在所观察到的中间星状细胞表型中起重要作用体内.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-785653-f0007.jpg
刚-软水凝胶上星状细胞的GFAP染色显示中间表型

在软水凝胶（软静态，虚线）上培养21天的星状细胞的代表性图像和GFAP染色定量，或在软、硬或硬-软水凝胶上再培养14天的机械激发星状细胞。(虚线：软静态控制）。蓝色：核，绿色：GFAP.***：P（P）< 0.001. 比例尺：20μm。n个>每组23个细胞。

3.6再硬化水凝胶导致肌成纤维细胞快速活化

中间星状细胞表型的另一个重要（和临床相关）特征是能够快速进行肌成纤维细胞再分化，以应对重复损伤。三为了模拟重复损伤，我们利用我们的水凝胶设计，通过网络中未反应的甲基丙烯酸酯的光聚合来重新确定细胞环境16(图7A). 在这种情况下，将星状细胞机械预处理7天，在刚-软水凝胶上再培养14天，然后重新加固水凝胶，并将培养延长2天。力学特性表明，刚到软的水凝胶被重新加固至其对应于病变肝脏的初始刚度(图7B). 与刚-软水凝胶上的星状细胞相比，在2天内，再强化水凝胶上星状细胞迅速扩散，并重新表现出肌成纤维细胞表型，显示出明显更高的扩散面积、α-SMA和F-actin应力纤维组织以及核YAP/TAZ(图7C、D、E). 虽然重新分化后仅2天观察到的星状细胞表型与机械启动7天后观察到的表型相似，但这种行为可以通过延长培养时间来解释。16然而，这些结果反映了观察到的情况体内趋势和表明，刚-软水凝胶上的星状细胞可能有能力更快地再分化为肌成纤维细胞。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-785653-f0008.jpg
再硬化水凝胶导致肌成纤维细胞快速活化

（A） 水凝胶再硬化方案就地未反应水凝胶甲基丙烯酸酯的自由基聚合。（B） 光照前后刚-软水凝胶和再加固水凝胶的弹性模量。（C） 光照前后的星形细胞扩散面积（第14天硬到软细胞面积数据再现自图3用于比较）。（D） 再强化水凝胶上星状细胞肌动蛋白组织的代表性图像和量化。蓝色：核，绿色：α-SMA，红色：F-actin（从刚到软的actin组织数据复制自图4用于比较）。（E） 再强化水凝胶上星状细胞YAP/TAZ核定位的代表性图像和量化。蓝色：核，绿色：YAP/TAZ（从图5用于比较）。***：P（P）<0.001，显著大于刚-软组。比例尺：100μm（C，D），20μm（E）。n个>每组51个细胞。

4.结论

为了更好地理解细胞如何在发育、伤口修复和疾病发展的背景下解释微环境信号，需要捕获ECM动态机械特性的水凝胶平台。在这项工作中，我们开发了一种结合稳定和水解降解交联的水凝胶平台，以呈现逐渐软化的细胞微环境。我们表明，由于酯水解，水凝胶降解动力学遵循伪一级指数衰减动力学。然后，我们将该系统应用于概念验证研究，以研究肝星状细胞在纤维化解决方面的表型。在刚-软水凝胶上培养的活化星形细胞在14天后表现出扩散、核YAP/TAZ和肌动蛋白组织减少，表现出类似于软水凝胶中星形细胞的表型。然而，这些细胞也表现出中间表型的特征体内在纤维化消退后，GFAP的表达降低，微环境发生再硬化（再损伤）后迅速再激活。总之，这些数据表明，机械特性在介导纤维化进展和消退期间观察到的表型变化中可能很重要体内此外，这些结果强调了在在体外研究更忠实地捕捉观察到的信息体内现象。我们预计，动态水凝胶平台（如本文所述）也将有助于干细胞分化、机械记忆和表观遗传学以及其他器官纤维化的研究。

​

洞察力、创新、整合

迫切需要设计水凝胶系统，以重现生理和病理事件的动态力学性质。这项工作提出了一种逐渐软化和再硬化的水凝胶系统，以捕捉纤维化消退和重复损伤过程中微环境力学的变化。我们发现，肝星状细胞是肝纤维化的主要成纤维细胞，通过重组其肌动蛋白细胞骨架，对逐渐软化作出反应，以减少扩散和YAP/TAZ核定位。在软化水凝胶上培养的星形细胞也显示出病理相关的中间表型体内。我们的结果强调了在在体外研究以更准确地捕获体内现象。

补充材料

电子稳定指数

单击此处查看。（186K，docx）

洞察

单击此处查看。（64K，docx）

致谢

作者感谢Shannon Tsai分离大鼠星状细胞，感谢Chris Highley博士、Adrianne Rosales博士和Chris Rodell博士在核磁共振方面的帮助和有益的讨论。大卫和露西尔·帕卡德基金会（JAB）和国家卫生研究院（F32 DK103463，SRC；DK058123，RGW）支持这项工作。

工具书类

1韦恩助教。病理学杂志。2008;214:199–210. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
2W.H.组织特定原因死亡率：2000-2011年区域估计数。2014
三。Kisseleva T、Cong M、Paik Y、Scholten D、Jiang C、Benner C、Iwaisako K、Moore-Morris T、Scott B、Tsukamoto H、Evans SM、Dillmann W、Glass CK、Brenner DA。美国国家科学院院刊。2012;109:9448–9453. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4.Troeger JS、Mederacke I、Gwak GY、Dapito DH、Mu X、Hsu CC、Pradere JP、Friedman RA、Schwabe RF。胃肠病学。2012;143:1073–1083. e1022。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5Levental KR、Yu H、Kass L、Lakins JN、Egeblad M、Erler JT、Fong SF、Csiszar K、Giaccia A、Weninger W、Yamauchi M、Gasser DL、Weaver VM。单元格。2009;139:891–906. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Georges PC、Hui JJ、Gombos Z、McCormick ME、Wang AY、Uemura M、Mick R、Janmey PA、Furth EE、Wells RG。美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2007;293：G1147–1154。[公共医学][谷歌学者]
7Liu F、Mih JD、Shea BS、Kho AT、Sharif AS、Tager AM、Tschumperlin DJ。细胞生物学杂志。2010;190:693–706. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8普雷维特M、特劳特K、维玛D、奇帕达U、施洛斯R、兰格拉纳N。Ann Biomed工程。2012;40:1061–1072.[公共医学][谷歌学者]
9.Zustiak SP，Leach JB公司。生物大分子。2010;11:1348–1357. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10.Zustiak SP，Leach JB公司。生物技术生物工程。2011;108:197–206. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Kloxin AM、Kasko AM、Salinas CN、Anseth KS。科学。2009;324:59–63. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Wang H、Tibbit MW、Langer SJ、Leinwand LA、Anseth KS。美国国家科学院院刊。2013;110:19336–19341. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13.Yang C、Tibbit MW、Basta L、Anseth KS。Nat Mater公司。2014;13:645–652. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Highley CB、Prestwich GD、Burdick JA。生物技术的当前观点。2016;40:35–40.[公共医学][谷歌学者]
15Guvendiren M、Perepelyuk M、Wells RG、Burdick JA。生物医学材料力学行为杂志。2014;38:198–208. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Caliari SR、Perepelyuk M、Cosgrove BD、Tsai SJ、Lee GY、Mauck RL、Wells RG、Burdick JA。科学报告。2016;6:21387. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17.Burdick JA、Chung C、Jia X、Randolph MA、Langer R。生物大分子。2005;6:386–391. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Guvendiren M、Yang S、Burdick JA。高级功能材料。2009;19:3038–3045. [谷歌学者]
19.Burdick JA、Chung C、Jia X、Randolph MA、Langer R。生物大分子。2005;6:386–391. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Bitter T、Muir HM、。分析生物化学。1962;4:330–334.[公共医学][谷歌学者]
21Uemura M、Swenson ES、Gaca MD、Giordano FJ、Reiss M、Wells RG。分子生物学细胞。2005;16:4214–4224. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Geerts A、Vrijsen R、Rauterberg J、Burt A、Schellick P、Wisse E。《肝病杂志》。1989;9:59–68.[公共医学][谷歌学者]
23马吉玛·T、施纳贝尔·W、韦伯·W。Makromolekulare化学公司。1991;192:2307–2315. [谷歌学者]
24Fairbanks BD、Schwartz MP、Bowman CN、Anseth KS。生物材料。2009;30:6702–6707. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Olsen AL、Bloomer SA、Chan EP、Gaca MD、Georges PC、Sackey B、Uemura M、Janmey PA、Wells RG。美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2011;301：G110–118。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26Saums MK、Wang W、Han B、Madhavan L、Han L、Lee D、Wells RG。朗缪尔。2014;30:5481–5487. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
27Balestrini JL、Chaudhry S、Sarrazy V、Koehler A、Hinz B。集成生物（Camb）2012;4:410–421.[公共医学][谷歌学者]
28杜邦S、Morsut L、Aragona M、Enzo E、Giulitti S、Cordennsi M、Zanconato F、Le Digabel J、Forcato M、Bicciato S、Elvassour N、Piccolo S。自然。2011;474:179–183.[公共医学][谷歌学者]
29Mannaerts I、Leite SB、Verhulst S、Claerhout S、Eysackers N、Thoen LFR、Hoorens A、Reynaert H、Halder G、van Grunsven LA。肝素杂志。63:679–688.[公共医学][谷歌学者]
30.Liu F、Lagares D、Choi KM、Stopfer L、MarinkovićA、Vrbanac V、Probst CK、Hiemer SE、Sisson TH、Horowitz JC、Rosas IO、Fredenburgh LE、Feghali-Bostwick C、Varelas X、Tager AM、Tschumperlin DJ。美国生理学杂志肺细胞分子生理学。2015;308：L344–L357。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]