I型干扰素和色氨酸微生物代谢产物通过芳香烃受体调节星形胶质细胞活性和中枢神经系统炎症

星形胶质细胞中的IFN-I信号限制CNS炎症

IFN-I是感染、自身免疫和其他生理过程中炎症的重要调节因子^16——18为了研究IFN-I信号在EAE期间星形胶质细胞中的作用，我们敲除了干扰素α/β受体1(伊夫纳1)使用在GFAP启动子控制下表达的慢病毒递送shRNA（shIfnar1），该启动子在该载体中也控制绿色荧光蛋白（GFP）的表达^11,19(图2a). EAE诱导后第7天和第15天，将慢病毒经脑室注入CNS；携带非靶向shRNA的慢病毒被用作对照（shControl）。IFNAR1沉默使EAE恶化，如较高的疾病评分和未能恢复所示(图2a).

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图2

星形胶质细胞中的I型干扰素信号限制CNS炎症

用MOG主动免疫诱发EAE_35-55在C57Bl/6 WT小鼠中，在疾病诱导后第7天和第15天脑室注射伊夫纳1靶向（shIfnar1）或对照（shControl）慢病毒。（a）上图：星形细胞特异性shRNA靶向慢病毒载体示意图。中心性尿路终止；土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；mir30，micro-RNA30。底部：shControl或shIfnar1注射小鼠的临床得分n个=每组10只小鼠；双向方差分析）。(b条)感染shControl或shIfnar1的星形胶质细胞通过EAE峰值处的GFP表达进行鉴定，并通过FACS分选进行分离。GFP指示基因的qPCR分析⁺星形胶质细胞（上排）和整个CD11b⁺CD45型^洛小胶质细胞种群（下行）；n个=每组4只小鼠，代表两个独立实验；学生的t吨-测试；归一化为shControl小胶质细胞Irf9型). (c（c）)根据纳米线分析确定的峰值疾病期间shIfnar1和shControl小鼠分类星形胶质细胞指示基因mRNA表达的折叠变化（根据log确定的相对表达的折叠改变₂（shIfnar1/sh控制））。两个独立的星形胶质细胞集合实验的代表性n个=每组3只小鼠。(d日)qPCR分析阿赫和Cyp1b1周期星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达(b条);n个=每组4只小鼠，代表两个独立实验；学生的t吨-测试；归一化为星形胶质细胞shIfnar1塞浦路斯1b1. (e、 （f）)促炎基因簇的纳米线分析(补充表3)来自分类的小胶质细胞(e（电子）)和Ly-6C^你好促炎单核细胞(（f）); shIfnar1与shControl的计数之比；两个独立的小胶质细胞和巨噬细胞混合实验的代表性n个=每组3只小鼠。显著性水平：*P（P）<0.05时**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001），n.s.：无统计学意义。

根据qPCR评估，伊夫纳1GFP中的表达被有效抑制⁺从shIfnar1处理的小鼠中分离出星形胶质细胞，但在小胶质细胞中没有(图2b). 与IFN-I应答相关的成绩单，如Mx1型和IFN-I信号通路的其他基因(状态1,状态2,Irf9型)在shIfnar1处理的星形胶质细胞中下调，但在小胶质细胞中未下调(图2b). 为了应对EAE的恶化，使用定制的NanoString计数器阵列(补充表2)我们检测到促炎症基因上调(Ifng公司,伊尔6,2个,Ccl2公司和伊利23a）shIfnar1处理小鼠的星形胶质细胞(图2c). 此外，Ifnar1敲除降低免疫调节转录因子芳基烃受体的表达(阿赫)及其靶基因Cyp1b1周期在星形胶质细胞中(图2c、d). 尽管IFNAR1敲除仅限于星形胶质细胞，但它也与小胶质细胞和Ly-6C中促炎转录物的表达增加有关^你好单核细胞(图2e、f和补充表3)表明IFN-I信号调节星形胶质细胞和髓细胞之间的功能性相互作用。综上所述，这些数据表明，星形胶质细胞中的IFN-I信号限制CNS炎症并诱导AhR表达。

IFN-I诱导星形胶质细胞AhR表达

AhR通过影响免疫系统的几个组成部分调节炎症^20,21我们首先研究了AhR的表达是否受星形胶质细胞中IFN-I信号的控制。与之前报道的干扰素-βIFN-β类似²²，的表达式阿赫及其靶基因Cyp1b1周期EAE期间星形胶质细胞增加(图3a). 与我们的体内发现，IFN-β上调治疗阿赫以IFNAR1依赖的方式在原代小鼠星形胶质细胞中表达(图3b).

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图3

β干扰素诱导星形胶质细胞AhR表达

(一)qPCR分析阿赫和Cyp1b1周期从幼年小鼠和EAE评分峰值（平均值+s.e.m。，n个=3，学生的t吨-测试；归一化为天真阿赫). (b条)中指示基因的mRNA表达在体外用shControl或shIfnar1慢病毒转导培养的星形胶质细胞并用干扰素-β或载体处理(n个=3，代表三个独立实验；单因素方差分析，然后进行Tukey多重比较测试；归一化为车辆-干扰素-β伊夫纳1). (c（c）)I型干扰素信号通路示意图¹⁷. (d日)用IFN-β或载体刺激的WT星形胶质细胞中pStat1表达的FACS分析；左直方图：红线：同型，灰线：未模拟；蓝线：抗pStat1；条形图右侧：绿色荧光蛋白的定量⁺; 两个独立实验的代表；单因素方差分析，然后进行Tukey多重比较测试；(e（电子）)干扰素应答基因（ISG）的mRNA表达Mx1型和阿赫由干扰素β激活的星形胶质细胞和I型干扰素途径抑制剂的qPCR测定(n个=3，代表两个独立实验，；单因素方差分析，然后进行Tukey多重比较测试；标准化为控制Mx1型). (（f）)通过生物信息学分析确定的AhR启动子中预测的Stat1和ISRE结合位点示意图。(克)与干扰素β或对照培养的WT星形胶质细胞的ChIP在体外使用抗STAT1或非特异性抗体来确定STAT1与其在AhR启动子中的结合位点的结合(n个=3，代表两个独立实验，单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试；克和小时归一化为车辆非特定状态1（1,2））。(小时)在WT和Ifnar1 KO动物中诱导EAE，通过FACS分选在疾病高峰期纯化星形胶质细胞，并对AhR启动子中STAT1结合进行ChIP分析，如(克). (我)用AhR-反应性报告基因（pGud-Luc）转染HEK293细胞，并按照IFN-β或AhR抑制剂CH-223191的指示进行处理(n个=3，代表三个独立实验，单因素方差分析，然后是Tukey的多重比较测试；归一化为车辆）。显著性水平：*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001.

星形胶质细胞产生IL-27²³IL-27被认为有助于干扰素-β对MS的治疗作用²⁴虽然IL-27上调DC和CD4中AhR的表达⁺Tr1调节细胞^25——27，IFN-β治疗也上调了IL-27受体缺陷星形胶质细胞中AhR的表达，表明IFN-β诱导AhR表达独立于IL-27(补充图3a).

然后我们分析了干扰素-β对AhR表达的直接调节。IFNAR1激活触发JAK1/TYK2依赖的STAT1磷酸化，STAT1与磷酸化的STAT2二聚体¹⁷STAT1/STAT2异二聚体与IRF9组装形成一个称为IFN-刺激基因因子3（ISGF3）的三分子复合物，该复合物转移到细胞核并结合特定的IFN-反应元件（ISRE）以控制干扰素刺激基因（ISG）的表达(图3c). 与这些发现一致，星形胶质细胞原代培养物暴露于干扰素-β导致STAT1和STAT2的磷酸化，在15分钟后达到峰值(图3d). 曲古抑菌素A抑制ISGF3的组装或氟化钠（NaF）损伤ISGF3向细胞核的转运抑制了ISGF3靶基因的上调Mx1型和Ahr公司(图3e).

对AhR启动子的生物信息学分析确定了一个ISRE，该ISRE可被IFNAR1激活后形成的含STAT1/STAT2的ISGF3复合物靶向，以及4个STAT1结合位点，在STAT1激活后可被其他刺激物识别，如IFN-γ(图3f).体外干扰素β激活星形胶质细胞导致STAT1和STAT2在阿赫启动子，但不是染色质免疫沉淀（ChIP）分析中确定的STAT1结合位点(图3g). 这些数据表明，STAT1被招募到ISRE，作为包含STAT2的IFN-I依赖性ISGF3复合物的一部分。STAT1和STAT2也在阿赫EAE期间星形胶质细胞中的启动子以IFNAR1依赖的方式(图3h). 考虑上调阿赫EAE期间依赖IFNAR1的星形胶质细胞的表达(图2c、d)，这些数据表明ISGF3驱动阿赫中枢神经系统炎症期间星形胶质细胞的表达。此外，它增加了STAT1结合位点的招募伊夫纳1击倒表明IFN-I限制了STAT1对这些站点的访问体内可能通过STAT1/STAT2异二聚体的形成和/或表观遗传机制。

为了进一步研究干扰素-β对AhR依赖性转录调控的影响，我们使用一个AhR应答启动子控制荧光素酶表达的结构进行了报告分析²⁸.HEK293细胞暴露于IFN-β后，AhR-应答启动子被反式激活(图3i). 这种反式激活由AhR介导，AhR特异性拮抗剂CH-223191对其抑制就是证明(图3i). 总之，这些发现表明，在星形胶质细胞中组装的ISGF3对干扰素-β的反应可诱导AhR依赖性转录程序。

星形胶质细胞中AhR的表达限制CNS炎症

为了研究星形胶质细胞表达的AhR在中枢神经系统炎症调节中的作用，我们通过交叉AhR来删除星形胶质细胞中的Ah R^{飞行/飞行}在GFAP启动子控制下表达Cre重组酶的小鼠²⁹.在GFAP-Cre中诱导EAE^{销售时点情报系统}；阿赫勒^{飞行/飞行}（GFAP-AhR缺陷）和GFAP-Cre^否定；AHR公司^{飞行/飞行}（对照组）监测小鼠和病程。GFAP-AhR缺陷小鼠的EAE疾病评分更差，主要表现为在疾病的慢性期未能恢复(图4a和补充表4).

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图4

星形胶质细胞中的AhR限制中枢神经系统炎症

GFAP-AhR缺乏小鼠或对照小鼠的EAE。(一)排名靠前：临床得分（平均值±标准偏差；在五个独立实验中具有代表性n个=每组10只小鼠；双向方差分析）。底部：疾病高峰期分类GFAP-AhR缺陷和对照星形胶质细胞的促炎症簇中RNA丰度的比值（相对表达的倍数变化由对数确定₂（GFAP-AhR/控制）。两个独立实验的代表n个=每组3只小鼠。(b条)CNS浸润CD11b绝对数⁺赖氨酸-6C^你好通过FACS分析评估单核细胞。n个=每组5个，代表五个独立实验，学生的t吨-测试。(c（c）)左两图：促炎基因簇的纳米串分析(补充表3)来自已排序的CD11b⁺CD45型^洛小胶质细胞（左）和CD11b⁺赖氨酸-6C^你好单核细胞（右）；GFAP-AhR的数量除以控制；两个独立的小胶质细胞和巨噬细胞混合实验的代表性n个=每组3只小鼠；学生的t吨-测试。右三图：疾病高峰期WT和GFAP-AhR小鼠星形胶质细胞中指示基因的RNA表达。(n个=3，学生的t吨-测试；标准化为控制Ccl2公司) (d日)左图：使用CD11b进行迁移分析时，研究了LPS或载体刺激的WT或GFAP-AhR缺陷星形胶质细胞的上清液⁺赖氨酸6C^你好WT单核细胞作为迁移细胞（绝对细胞数；n个= 3; 三个独立实验的代表；单向方差分析，Tukey的多重比较测试）。右图：使用所示阻断抗体或IL-27R KO巨噬细胞进行迁移分析（折叠细胞数；n个= 3; 三个独立实验的代表；治疗组内的单因素方差分析，土耳其的多重比较测试）。(e（电子）)左侧面板：排序的CD11b⁺赖氨酸6C^你好单核细胞与活化对照或GFAP-AhR缺陷星形胶质细胞共培养，重新分离并通过qPCR分析基因表达(n个=3，代表两个独立实验；学生的t吨-测试；标准化为控制Ccl2公司在里面c（c）). 右图：LPS或载体激活后，用对照或GFAP-AhR缺陷星形胶质细胞的上清液进行神经毒性试验n个=3，代表两个独立实验，单向方差分析，Tukey多重比较测试）。(（f）)LPS激活后对照组或GFAP-AhR缺陷星形胶质细胞中NF-kB（p65）与Ccl2、Csf2和Nos2启动子结合的ChIP分析。(n个=3，代表两个独立实验，单向方差分析，Tukey多重比较测试）。(克)SOCS2启动子中预测的AhR结合位点（XRE）示意图（上图），以及在指定条件刺激后星形胶质细胞中AhR与SOCS2的启动子结合的ChIP分析（下图）。(n个=3，代表两个独立实验，单向方差分析，Tukey多重比较检验；（f）,克归一化为pCcl2控制rIgG）。(小时)的相对表达式社会2用LPS刺激后WT或GFAP-AhR星形胶质细胞（两个独立实验中的代表性实验；单向方差分析，Tukey的多重比较试验；归一化为对照载体）。(我)Western blot检测NF-kB（p65；左）和量化（右）WT、GFAP-AhR和SOCS2的核质比^−/−在指定条件下刺激星形胶质细胞（代表性的三个独立实验，单向方差分析，Tukey的多重比较测试）。(j个)表达水平的qPCRCcl2公司,Csf2型、和2个控制和SOCS2^−/−LPS刺激后的星形胶质细胞（两个独立实验中的代表性实验；学生的t吨-测试；标准化为控制Ccl2公司). 显著性水平：*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001.

GFAP也在CNS外表达，包括肠神经系统的细胞³⁰因此，GFAP-AhR小鼠EAE恶化可能是由这些细胞而非星形胶质细胞中的GFAP驱动的AhR缺失所致。研究AhR在GFAP中的作用⁺在EAE期间，我们构建了一种慢病毒，其中在GFAP启动子（shAhR-LV）的控制下表达AhR-靶向shRNA，并用它来敲除阿赫GFAP中的表达⁺星形胶质细胞。服用shAhR-LV导致EAE严重恶化(补充图3b、c)表明GFAP-AhR小鼠的疾病恶化是由于GFAP中AhR缺乏所致⁺星形胶质细胞而非GFAP⁺CNS外的细胞。

星形胶质细胞中AhR缺乏并不影响外周细胞增殖或细胞因子产生方面的回忆性T细胞反应，也不影响效应和调节性T细胞向中枢神经系统的募集(补充图3d–f). 然而趋化因子的表达（例如，Ccl2公司,Ccl20公司和Cxcl10公司)、细胞因子（例如。伊尔6,伊尔12,伊利23)和促炎标记物，如维姆,2个、和Csf2型在EAE期间AhR缺乏的星形胶质细胞中增加(图4a,下部面板). 与趋化因子生成增加一致，星形胶质细胞中AhR缺失与CD11b数量增加相关⁺CD45型⁺赖氨酸-6C^你好CNS浸润单核细胞(图4b和补充图3f). 此外，GFAP-AhR小鼠的小胶质细胞和单核细胞中与炎症和神经退行性变相关的标志物的表达增加(补充表3和图4c).

为了研究AhR在星形胶质细胞中的作用，我们研究了培养中WT和AhR缺陷的原代小鼠星形胶质细胞。的表达式Ccl2公司,Csf2型和2个用LPS激活AhR-缺陷星形胶质细胞后增加(图4c). 星形胶质细胞生成因子与炎症单核细胞向中枢神经系统的募集有关³¹刺激星形胶质细胞的上清液促进CD11b的迁移⁺赖氨酸-6c^你好在transwell分析中，这种促迁移活性在缺乏AhR的星形胶质细胞的上清液中增加(图4d). CCL-2、GM-CSF和/或M-CSF的阻断抗体干扰了星形胶质细胞上清液诱导的单核细胞迁移，表明这些分子在缺乏AhR的星形胶质细胞中的表达增加是其趋化活性增加的原因(图4d).

星形胶质细胞产生的因子调节小胶质细胞和单核细胞的极化，也可能具有直接的神经毒性作用^8,11激活的AhR缺陷星形胶质细胞与单核细胞共培养增加了促炎标记物的表达(伊尔6,第12页,伊利23a,2个,Ccl2公司)并降低再分离单核细胞中IL-10的表达(图4e). 此外，AhR缺乏的星形胶质细胞培养上清液具有更大的神经毒性在体外与来自WT星形胶质细胞的上清液相比(图4e). 综上所述，这些数据表明星形胶质细胞中的AhR信号控制调节Ly-6C募集的转录程序^你好中枢神经系统的炎症性单核细胞、小胶质细胞和单核细胞的激活以及EAE期间的星形细胞神经毒性活性。

AhR诱导星形胶质细胞SOCS2限制NF-κB活化

转录因子NF-κB调节中枢神经系统炎症期间星形胶质细胞对活化的反应及其潜在的致病活性^32,33为了研究AhR调节星形胶质细胞功能的机制，我们通过ChIP分析了NF-κB对星形胶质细胞的募集Ccl2公司,Csf2型和2个启动子，因为这些基因与炎症单核细胞向中枢神经系统的募集、单核细胞和小胶质细胞的神经毒性活性诱导以及星形胶质细胞的直接神经毒性活性有关^4,8,11.以下在体外活化，NF-κB与Ccl2公司,Csf2型和2个AhR缺乏的星形胶质细胞中启动子增加，表明AhR限制了星形胶质细胞NF-κB的活化(图4f).

据报道，AhR可诱导B细胞中SOCS2的表达³⁴干扰NF-κB活化³⁵.星形胶质细胞的激活在体外与LPS或IFN-β诱导AhR募集到社会2以及AhR依赖性上调社会2表达式(图4g，h). LPS激活AhR或SOCS2缺陷星形胶质细胞在体外导致NF-κB活化增加，支持SOCS2在AhR抑制星形胶质细胞活化中的作用(图4i). 的表达式Ccl2公司,Csf2型和2个年增加了在体外激活的SOCS2缺陷星形胶质细胞(图4j). 因此，这些数据表明，在EAE期间，AhR通过以SOCS2依赖的方式限制NF-κB的激活来控制星形胶质细胞的致病活动。

星形胶质细胞AhR介导干扰素β的抑制作用

干扰素-β是MS的一线治疗药物并抑制EAE^36,37以前对小鼠的研究主要集中于外周注射干扰素β对T细胞和单核细胞的影响，因为干扰素-β不跨越血脑屏障³⁷为了研究AhR在EAE期间对IFN-β对星形胶质细胞作用的作用，我们通过鼻内注射（i.n.）IFN-β，因为这种给药途径会导致中枢神经系统中IFN-β的积聚³⁸为了支持静脉注射干扰素-β的CNS限制性生物分布，我们检测到Mx1在星形胶质细胞中表达，但在WT小鼠脾细胞中不表达(图5a). 疾病诱导后7天开始给予IFN-β可降低WT的EAE评分，但GFAP-AhR缺陷小鼠的EAE评分没有降低(图5b). 相反，CX3CR1-CreERT2小胶质细胞中AhR的特异性缺失；阿赫勒^{飞行/飞行}小鼠，用三苯氧胺治疗一个月后³⁹，没有改变注射干扰素-β的效果(补充图4a、b). 静脉注射干扰素-β后，WT小鼠星形胶质细胞中促炎细胞因子和激活标记物的表达降低。这在GFAP-AhR缺陷小鼠的星形胶质细胞中没有观察到(图5c 左边). 值得注意的是，与对照小鼠相比，GFAP-AhR中IFN-I应答基因Mx1的表达没有改变，表明AhR依赖性和非依赖性IFN-I调节基因共存。Il10号机组AhR缺乏的星形胶质细胞表达上调(图5c 左边)，表明AhR不驾驶Il10号机组T细胞在星形胶质细胞中的表达^25,27,40,41.CNS浸润单核细胞的数量(图5c 中间的)促炎分子的表达(图5c 正确的)注射IFN-β后，WT降低，但GFAP-AhR缺陷小鼠未降低。因此，星形胶质细胞中的IFN-β信号以AhR依赖性方式限制CNS炎症。

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图5

色氨酸和干扰素β的微生物代谢产物通过AhR抑制星形胶质细胞的CNS炎症

(一)每日用5.000 IU hIFN-β或PBS鼻内注射治疗2天的幼年WT小鼠分选的星形胶质细胞和脾脏DC、巨噬细胞或T细胞的qPCR(n个=3，学生的t吨-测试；归一化为星形胶质细胞阿赫). (b条)经鼻注射干扰素-β治疗的对照组或GFAP-AhR小鼠的EAE。对照组（左侧）或GFAP-AhR-缺陷组（右侧）小鼠的临床得分（左侧图表中的平均值±标准偏差）；三个独立实验中的代表性实验n个=每组10只小鼠；双向方差分析）。(c（c）)左侧面板：来自指示基因的对照和GFAP-AhR星形胶质细胞的RNA丰度(n个=3，代表两个独立实验，单向方差分析，Tukey多重比较检验；标准化为控制车辆维姆). 中间图：中枢神经系统浸润CD11b的定量⁺赖氨酸6C^你好炎性单核细胞；三个独立实验中的代表n个=每组10只小鼠；单向方差分析，Tukey的多重比较测试。右图：分选单核细胞促炎基因簇的RNA分析；特定治疗组的计数与对照组的计数之比；两个独立的混合单核细胞实验的代表性n个=每组3只小鼠；单向方差分析，Tukey的多重比较测试。(d日)从EAE诱导后第22天开始，GFAP-AhR缺乏动物和接受指示治疗的对照动物（TDD：缺乏色氨酸的饮食；Trp：色氨酸；临床评分，平均值±标准偏差；两个独立实验中的代表性n个=每组10只小鼠；双向方差分析；Tukey的多重比较测试）。(e（电子）)的qPCRCcl2公司和2个在指定的处理条件下，如(c（c）; 归一化为控制TDD+TrpCcl2，单向方差分析，Tukey多重比较测试）(f、 g、i)EAE诱导后第22天开始，在指定条件下治疗的WT小鼠的临床得分（平均值±标准偏差；在两个独立实验中代表性n个=每组5只小鼠；双向方差分析；Tukey的多重比较测试）(小时)左：相对mRNA丰度的qPCRCcl2公司和2个从第36天从实验组分类的星形胶质细胞中（f）,克、和我; (n个=3，代表两个独立实验；单向方差分析，然后Tukey的多重比较测试归一化为VehicleCcl2公司). 右：测量实验组第36天采集的尿样中的I3S，如f、 g、i(n个= 3; 两个独立实验的代表；单向方差分析，然后进行Tukey的多重比较测试）。(j个)EAE诱导后第36天从指示组粪便样本中分离的罗伊氏乳杆菌DNA的SYBR Green qPCR(n个=每组4个，代表两个独立实验；单向方差分析（ANOVA），然后是Tukey的多重比较测试（归一化为TDD+Trp）。显著性水平：*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001.

饮食色氨酸通过AhR限制CNS炎症

AhR的活性由小分子调节，其中一些由饮食和共生菌群提供²⁰IFN-β的AhR依赖性抗炎作用表明，饮食和微生物AhR配体可能调节星形胶质细胞和中枢神经系统炎症中的IFN-I信号传导。色氨酸（Trp）是由饮食提供的一种必需氨基酸，代谢为几种AhR配体²⁰为了研究饮食对星形胶质细胞调节中枢神经系统炎症的AhR依赖性影响，我们在WT和GFAP AhR缺陷小鼠中诱导EAE，并从第22天开始，按照说明给小鼠喂食缺乏Trp的饮食（TDD）或补充Trp的TDD（TDD+Trp）⁴².缺乏膳食Trp使EAE得分恶化(补充图5a)不影响色氨酸或其分解代谢产物5-羟色胺和氰尿酸的水平(补充图5b). 补充Trp可以逆转对照组EAE评分的恶化，但不能逆转GFAP-AhR缺陷小鼠的EAE评分恶化(图5d)表明AhR的Trp衍生配体通过星形胶质细胞发挥作用。膳食Trp缺乏与增加Ccl2公司和2个GFAP-AhR缺陷小鼠星形胶质细胞中的表达（补充Trp无法恢复）(图5e).

Trp衍生的AhR激动剂通过共生酶和宿主酶催化的复杂生化途径生成^42——44事实上，对氨苄青霉素（Amp）敏感的万古霉素（Vanco）抗性细菌从膳食Trp中产生AhR激动剂⁴⁴因此，我们测试了口服抗生素对晚期EAE的影响，发现Amp而非Vanco干扰了疾病恢复(图5f).

细菌色氨酸酶（TnAse）催化膳食色氨酸转化为吲哚，吲哚在肝脏中用作合成AhR激动剂吲哚-3-硫酸盐（I3S）的前体^43,45在无菌小鼠中未检测到I3S，表明其生成依赖于共生菌群⁴³事实上，服用Amp降低了I3S尿水平(图5h 正确的). 此外，外周注射的I3S穿过BBB并激活星形胶质细胞中的AhR(补充图5c). 总之，这些数据表明，由Amp敏感性共生细菌产生的I3S参与了AhR对星形胶质细胞活性的调节。

I3S或吲哚补充剂降低了Amp治疗小鼠的EAE疾病评分(图5g)并将I3S增加到水平(图5h 正确的)与在非Amp治疗小鼠中检测到的程度相似。此外，I3S或吲哚补充减少Ccl2公司和2个AhR依赖性方式在星形胶质细胞中的表达(图5h和补充图5e、f). 将重组TnAse灌胃给Amp处理的小鼠时，也获得了类似的结果(图5g和补充图5e、f).

共生细菌中的TnAse非依赖性酶反应也可以导致合成不同于I3S的AhR激动剂，如吲哚-3-丙酸（IPA）和吲哚3-醛（IAld）⁴⁴。补充IPA或IAld也会降低经Amp处理的小鼠的EAE评分，同时降低Ccl2公司和编号2星形胶质细胞中的表达(图5h，i). 然而，IPA或IAld给药并未恢复外周I3S浓度(图5h 正确的).

罗伊氏乳杆菌(罗伊氏乳杆菌)已被描述参与膳食Trp转化为AhR激动剂⁴⁴有趣的是，使用Amp而非Vanco治疗与减少罗伊氏乳杆菌治疗小鼠粪便中16S-RNA水平(图5j). 综合起来，这些数据表明罗伊氏乳杆菌和其他对Amp敏感的Vanco抗性共生细菌通过TnAse依赖性和非依赖性途径催化膳食Trp转化为调节EAE期间星形胶质细胞功能的AhR激动剂。

EAE诱导和治疗

用200μg MOG皮下免疫8～10周龄小鼠，诱发EAE_35–55每只小鼠在完全弗氏佐剂（CFA，Difco Laboratories）中乳化多肽，然后在第0天和第2天按说明给药200 ng百日咳毒素（PTX，List biological Laboratories，Inc.）²⁶根据以下得分评估EAE的临床症状：0，无疾病症状；1、尾部语调丧失；2、后肢麻痹；3、后肢瘫痪；4、四肢瘫痪；5，奄奄一息。如具体实验所述，每日经鼻或腹腔注射5.000 IU的人干扰素β1a（Rebif、Merck Serono）或载体对照。从EAE诱导后第22天开始，每天口服抗生素、Trp-indoles和TnAse，剂量如下：氨苄西林6 mg/20 g体重（BW）、万古霉素3 mg/20 g BW；吲哚、吲哚-3-丙酸、吲哚-醛（400μg/20g BW）、TnAse（200μg/20gBW）。I3S每日腹腔注射，剂量为200μg/20 g BW。所有药物均购自Sigma Aldrich。

成年小鼠中枢神经系统细胞的分离

如前所述，从CNS中分离出单核细胞¹¹星形胶质细胞、单核细胞和小胶质细胞如前所述进行分类¹¹并在中概述补充图1分离的CNS细胞用CD11b（M1/70，1:50）、CD45（90,1:50）、Ly6C（HK1.4）的荧光结合抗体染色。1:100）、CD105（N418，1:100），CD140a（APA5，1:100。除非另有说明，所有抗体均来自eBioscience或BD Pharmingen。小胶质细胞分类为CD11b⁺低CD45表达和低Ly6C（CD11b）的细胞⁺CD45型^低的赖氨酸6C^低的)，炎症单核细胞被认为是CD45^你好CD11b型⁺赖氨酸6C^高61星形胶质细胞分类为CD11b^低的CD45型^低的赖氨酸6C^低的CD105型^低的CD140a型^低的CD11b型^低的80层/四层^低的O4号机组^低的CD19型^低的排除淋巴细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、单核细胞后(补充图1). 分选细胞的GFAP大于85%⁺通过FACS分析(补充图1). 通过对星形胶质细胞标记物表达的qPCR分析，我们确认我们分离出了一个相对纯净的星形胶质细胞群体绿色食品添加剂,aldh1l1型和水通道蛋白4.

流式细胞术染色和采集

如前所述制备单核细胞悬浮液¹¹流式细胞仪抗体从eBioscience或BD Pharmingen购买，使用浓度为1:100，除非制造商另有建议。然后在LSRII或MACSQuant流式细胞仪上分析细胞（分别为BD Biosciences和Miltenyi Biotec）。如图所示，Th1细胞被定义为CD3⁺CD4细胞⁺干扰素-g⁺白介素-17⁻白介素-10⁻Foxp3系列⁻，Th17细胞作为CD3⁺CD4细胞⁺干扰素-g⁻白介素-17⁺白介素-10⁻Foxp3系列⁻，Treg细胞为CD3⁺CD4细胞⁺干扰素-g⁻白介素-17⁻白介素-10^−/+Foxp3系列⁺，小胶质细胞作为CD11b⁺CD45型^低的赖氨酸6C^低的，和作为CD45的促炎单核细胞^你好CD11b型⁺赖氨酸6C^你好.

RNA测序

在疾病诱导后第28天处死小鼠，并按上述方法分离星形胶质细胞。RNA的测序采用特定于股的TruSeq协议。使用TopHat v2.0.11将高覆盖率（>50M）的股特异性配对基因76bp读取与mm10/GRCm38小鼠参考基因组对齐⁶²使用Cuffquant和Cuffnorm v2.2.1四分位标准化FPKMs估计38922 GenCode Release M2（GRCm38.p2）小鼠基因注释的基因表达水平，并使用Cuffdiff v2.2.1评估差异表达⁶².

n反向基因表达

在定制的星形胶质细胞靶向n反转录基因表达代码集中，将100 ng总RNA与报告和捕获探针杂交(补充表1)根据制造商的说明（NanoString Technologies）。使用nSolver分析软件分析数据。

定量PCR

用RNEasy试剂盒（Qiagen）提取RNA，制备cDNA并用于qPCR，结果归一化为Gapdh公司所有引物和探针均来自Applied Biosystems。鼠标：阿赫Mm00478932_m1，Ccl20公司Mm01268754万m1，Ccl2公司Mm00441242_m1，Ccl8公司Mm01297183_m1，Cxcl3公司Mm01701838_m1，Cyp1a1细胞Mm00487218_m1，Cyp1b1周期Mm00487229_m1，Gapdh公司99999915_g1毫米，同上1Mm00492590_m1，第二代00524210_m1，伊夫纳1Mm00439544_m1，Ifnb1号机组Mm00439552_s1，Il10号机组Mm00439614_m1，伊利12aMm00434165_m1，伊利23aMm01160011_g1，第27页Mm00461162_m1，伊尔6Mm00446190_m1，Irf9型Mm00492679_m1，Mx1型Mm00487796_m1，2个Mm00440502_m1，状态1Mm00439531_m1，状态2Mm00490880_m1，Tdo2号机组Mm00451266_m1，Tgfb1型Mm01178820_m1，Tnfa公司Mm00443258_m1，维姆Mm01333430_m1。人类：AHR公司Hs00169233_m1，CCL2级Hs00234140_m1，密码1b1Hs02382916_s1，IFNAR1Hs01066118_m1，IL6（IL6）Hs00985639_m1，红外f9Hs00196051_m1，MX1型Hs00895608_m1，NOS2号Hs01075529_m1，STAT1（状态1）Hs01013996_m1，定子2Hs01013123_m1，TNFA公司Hs01113624_g1。

T细胞增殖

脾细胞在X-VIVO 15培养基（Lonza）中培养，并以5×10的密度电镀72 h⁵MOG浓度增加时每孔的细胞数_35–55肽。在最后16小时内，用1 Ci对细胞进行脉冲处理[^三H] 胸腺嘧啶核苷（PerkinElmer），然后在玻璃纤维过滤器上收集并分析[^三H] β计数器中的胸苷（1450 MicroBeta TriLux；PerkinElmer）。对于细胞内细胞因子染色，用PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐；50 ng/ml；西格玛）、离子霉素（1μg/ml；西格玛）和莫能菌素（GolgiStop；2μM BD Biosciences）刺激细胞4小时。表面标记染色后，根据制造商的说明（BD Cytofix/Cytoperm Kit（BD Biosciences）或Foxp3 Fixation/Permeabilization（eBiosciency））固定细胞并使其具有渗透性。

原代星形胶质细胞培养

解剖1–3天龄新生小鼠的大脑皮层，小心地剥除脑膜，用0.25%胰蛋白酶-EDTA和DNAse I（1 mg/ml）消化15分钟，然后通过细胞过滤器（70μm）分散到单细胞水平。然后将细胞悬浮液在37°C的温度下培养在预先涂有175 cm多聚赖氨酸（Sigma）的5%CO2和95%空气中²细胞培养瓶。每4-5天更换一次培养基。7-10天后，细胞汇合，用胰蛋白酶-EDTA（0.06%）轻度胰蛋白酶化分离星形胶质细胞，如前所述¹¹。通过GFAP或GLAST染色确定细胞为>95%的星形胶质细胞，CD11b污染小于5%⁺小胶质细胞（未显示）。在隔离程序完成后，根据具体实验的需要，对细胞进行进一步电镀。LPS（Sigma）的药剂浓度为100 ng/ml，mIFN-β（R&D系统）为500 IU/ml，或3-吲哚基硫酸盐（Sigma50μg/ml）。除非另有说明，否则在治疗开始后24小时进行RNA分析。对于Western Blot，用干扰素-β或载体预处理细胞24小时，然后添加LPS，并在2小时后制备蛋白质。

质粒

编码STAT1和IRF-1以及pTK-Renilla的结构来自Addgene。报告质粒pAhR-Luc和pGud-Luc已经在前面描述过²⁸.pLenti-GFAP-EGFP-mir30-shAct1载体25是张广西安赠送的礼物¹⁹.

转染和荧光素酶分析

HEK293细胞在补充有10%FBS的DMEM中生长，并转染Fugene-HD转染试剂（Roche）、报告构建物（pAhR-Luc/pTK-Renilla或pGud-Luc/pTK-Renila）以及转录因子表达构建物（p Stat1，pIrf9），如图所示。在一些实验中，转染细胞暴露于500 IU/ml的mIFN-β（Bio X细胞）或AhR抑制剂{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“CH223191”，“term_id”：“44935898”，“term_text”：“CH223191“}}CH223191号（西格玛）。为了测量人血清中的AhR配体，在用pGud-Luc和pTK-Renilla转染前24小时，将15000个HEK293细胞置于96孔板中。24小时后，将转染细胞与补充有10%患者血清的DMEM孵育。24小时后，使用双荧光素酶报告系统（Promega）分析荧光素素酶活性，并将其归一化为肾素荧光素酶活性。

体外用shRNA击倒

伊夫纳1在培养的小鼠原代星形胶质细胞中，使用携带伊夫纳1-靶向shRNA（TRCN0000374694），携带非靶向序列的慢病毒被用作对照（TRCN0000018782）（Sigma）。星形胶质细胞用慢病毒和8μg/ml聚溴乙烯（均来自Sigma-Aldrich）培养24小时，然后用mIFN-β（Bio-X-cell）或载体培养。GFP公司⁺对星形胶质细胞进行分类，并通过qPCR验证基因敲除。转导星形胶质细胞中GFP表达所确定的转导效率约为20%(图2b和未显示）。

体内shRNA慢病毒对星形细胞特异性敲除

shRNA序列对抗伊夫纳1或阿赫将一个非靶向对照shRNA克隆到pLenti-GFAP-EGFP-mir30-shAct1载体中¹⁹通过将shAct1替换为上述在体外验证shRNA序列伊夫纳1（5′-CCGGGAATGAGGTGATCCGTTATCTCGAGATAAACGGAACCTCATTTTTG-3′）或阿赫（5′-CCGGCATCGACATAACGGACGAATCTCGATTCGTCCGTTATGTCGATGTTTG-3′）如前所述¹¹通过转染HEK293FT细胞（Invitrogen）、新生成的pLenti-GFAP-EGFP-mir30-shRNA载体和ViraPower包装混合物（辅助质粒pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、Invitrogen）生成慢病毒颗粒。收集上清液，通过0.45μm PVDF过滤器过滤，并使用Lenti-X浓缩试剂盒（Clontech）浓缩过夜。使用Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒（Clontech）测定病毒滴度。对于体内将敲低免疫的小鼠在指定的时间点麻醉，放置在Kopf立体定向系统中，并注射10⁷使用Hamilton注射器在前角后方0.44 mm处、外侧1.0 mm处和颅面下方2.2 mm处注射shIfnar1或shControl病毒。注射系统缓慢缩回，皮肤切口用外科缝线小心闭合，小鼠在红光预热的特定笼子中醒来，然后每天检查三次。

亚细胞分级和免疫印迹分析

体外按照特定实验中的指示处理星形胶质细胞培养物，使用细胞分馏试剂盒（Cell Signaling）生成的亚细胞组分和10μg细胞核和细胞质组分用4–12%Bis-Tris Nupage凝胶（Invitrogen，美国）分离，并转移到PVDF膜（Millipore）上。作为主要抗体，我们使用了兔抗GAPDH单克隆抗体（14C10，细胞信号传导）、抗组蛋白H3兔多克隆抗体（EMD Millipore）、抗NF-κB p65兔单克隆抗体。所有抗体均以1:1.000的稀释度使用。使用SuperSignal West Femto Maximum灵敏度试剂盒（Thermo Scientific/Life Technologies）开发印迹。使用Image J软件1.48v（NIH）进行数据量化，并将特定信号归一化为GAPDH（细胞质）或组蛋白3（细胞核）。

染色质免疫沉淀（ChIP）

用1%多聚甲醛交联细胞，并用350μl裂解缓冲液（1%SDS，10 mM EDTA，50 mM Tris-HCl，pH 8.1）进行裂解，该裂解缓冲液含有1×蛋白酶抑制剂混合物（美国罗氏分子生物化学公司）。通过超声波剪切染色质，离心后收集上清液，并在ChIP培养缓冲液中稀释（1%Triton X-100，2 mM EDTA，150 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 8.0）。将10μg抗体与蛋白A-和蛋白g-Dynal磁珠（Invitrogen，美国）预结合6小时，并用冰镇PBS加1%BSA洗涤三次，然后添加到稀释的染色质中并旋转免疫沉淀过夜。然后在RIPA缓冲液（50 mM HEPES（pH 7.6）、1 mM EDTA、0.7%脱氧胆酸钠、1%NP-40、0.5 M LiCl）中洗涤磁珠-染色质复合物3次，然后用TE缓冲液洗涤2次。然后用1%SDS和0.1 M NaHCO3提取免疫沉淀染色质，并在65°C下加热8 h以逆转多聚甲醛交联。使用QIAquick DNA纯化试剂盒（美国Qiagen）纯化DNA片段，并使用SYBR Green实时PCR试剂盒（Takara Bio Inc.，美国）进行分析。如特定实验所示，使用抗AhR（BML-SA210，Enzo Life Sciences，USA）、抗STAT1（Cat.#9172，Cell Signaling Technology，USA）、抗STAT2（Cat.#4597，Cell Signaling Technology，USA）和NF-κB p65（D14E12）XP兔mAb（Cat.#8242，Cell Signaling Technology，USA）。使用了以下引物对：ccl2:p65正向，5′-CAGCTAAATATCTCTCCCCGAAGG-3′，反向，5′-CATAGATGCCACATCAT-3′；csf2:p65正向，5′-GACCAGATGTGGGAGTGAGCC-3′，反向，5′-AGCCACACCTTCTGGTCC-3′；nos2:p65（1）正向，5′-CACAGACTAGGAGTCCATCA-3′，反向，5′-GCAGCAGCATCAGGTATTT-3′；编号2：p65（2）正向，5′-ACCATGCGAAGATGATGTGGA-3′，反向，5′-AGCCAGACTACAGAA-3′。pAhR：状态1（1）正向，5′-TGCGATGGAGCATTC-3′，反向，5′-TCCTGAAGTCTGAGGAG-3′；pAhR：状态2（2）正向，5′-TTGGTCTCATTCTGCAGAC-3′，反向，5′-CTTGCAGTCGATTTCA-3′；pAhR-ISRE正向，5′-TGGCATGAATCACCAAAGA-3′，反向，5′-CAGTTCTTTTGCAGTACCACA-3′。pSOCS:AhR（1）正向，5′-CACAGCTCCTACCTGTTGA-3′，反向，5′-GGAATGGAGCGGAGA-3′；pSOCS2:AhR（2）正向，5′-ATGAGTCACACAGTCCCCAGA-3′和反向，5′-CTGCACCTCCGTTTTGGG-3′，pSOCS2：AhR。

用于迁移和神经毒性检测的星形胶质细胞条件培养基的制备

体外用LPS（100 ng/ml）或溶媒处理WT或AhR-GFAP缺陷幼崽的星形胶质细胞培养物24小时，并广泛清洗，补充新鲜培养基。48小时后，将上清液旋下，并在−80°C下保存以进行迁移和神经毒性试验。

单核细胞迁移试验

来自WT或IL-27R的脾单核细胞^−/−用CD11b珠（Miltenyi）对小鼠进行预富集，并对其进行F4/80分类⁺安全控制系统^低的赖氨酸-6C^你好将这些单核细胞接种在含有星形胶质细胞预处理培养基（见上文）的孔径为5μm（Corning）的24孔细胞培养插入物的上腔中。在一些实验中，预处理培养基中添加了IL-27 p28/IL-30（Cat.AF1834）、CCL2（克隆123616）、M-CSF（克隆131621）、GM-CSF（克隆MP122E9，所有研发系统）抗体或后者的组合。3小时后，在下腔中对迁移的单核细胞进行定量。

神经毒性试验

N2A神经元细胞（ATCC CCL-131、ATCC、Manassas）在96个Well-plates中生长，并用mIFN-γ（100 ng/ml，R&D Systems）预激活24小时。此后，用PBS和星形胶质细胞调节培养基进行广泛清洗后，替换培养基。根据制造商的方案，24小时后使用LDH释放（Cytox 96®非放射性细胞毒性测定，Promega）测量细胞毒性。

尿I3S的测定

使用indican分析试剂盒（MAK128，Sigma-Aldrich）测量未稀释尿液样本中的尿液indican（I3S）。

中枢神经系统血清素水平的测量

将50 mg绞碎的CNS组织重新悬浮在200μl PBS中，并通过超声均质。旋转提取物以清除细胞碎片后，使用serotonin Research Elisa Kit（Cat BA E-5900，LDN Immunoassys，德国）测量上清液中的血清素水平。

量化罗伊氏乳杆菌小鼠粪便中的DNA

使用QIAamp DNA大便迷你试剂盒（Qiagen）纯化200 mg EAE小鼠粪便样本中的细菌DNA，并使用之前发布的罗伊氏乳杆菌特异性引物进行SYBR Green qPCR⁴⁴.罗伊氏乳杆菌引物的使用如下：正向：5′-ACCGAACACCGGTTATT-3′，反向：5′-CATAACATACAAAGATTGT-3′。相对丰度归一化为对照组（TDD+Trp）。

人类原代星形胶质细胞

如前所述分离人类胎儿星形胶质细胞^11,63根据加拿大卫生研究院批准的指南，从人类胎儿组织库（阿尔伯特·爱因斯坦医学院）获得的妊娠17-23周胎儿的人类中枢神经系统组织。用hIFN-β（500 IU，Rebif，Merck Serono）或载体、poly（I:C）（10 mg/ml）（含或不含3-吲哚硫酸酯（50μM，Sigma））或未经处理（对照）处理原代人星形胶质细胞。24小时后，分离、转录总RNA并进行qPCR。

MS组织和免疫荧光

如前所述，从患有临床诊断的多发性硬化症和神经病理性证实的多发性硬化症的未经治疗的个体以及健康对照中获得脑组织^11,64所有MS患者和对照组，或其近亲，均已同意尸检并将其脑组织用于研究目的。尸检前进行了道德审批（CHUM道德审批：SL05.022、SL05.023和BH07.001）。如前所述，对MS样品进行处理和免疫染色²简单地说，用10%的驴血清解冻、固定、清洗和封闭切片。然后将切片与抗AhR（兔抗AhR-酶生命科学）和CCL2（鼠抗MCP-1，BD生物科学）或iNOS（鼠抗iNOS–Abcam）抗体在4℃孵育过夜。清洗后，将样品与二级抗体（驴抗兔RRX和驴抗鼠Alexa 488，Jackson ImmunoResearch）在室温下孵育40分钟。然后用与Alexa 647（BD Biosciences）直接偶联的抗GFAP抗体孵育切片1小时。在其他染色组中，将切片与抗AhR抗体（兔抗-AhR，Enzo Life Sciences）和Mx1抗体（小鼠抗-Mx1，Santa Cruz Biotechnology）或pSTAT1抗体（鼠抗-pSTAT1–BD Biosciences）在4°C下培养过夜。然后用二级抗体和抗GFAP-Alexa 647培养切片，如上所示。最后，将所有部分清洗并安装在含有TOPRO-3（Invitrogen）的凝胶剂中。使用徕卡SP5共焦显微镜和徕卡LAS AF软件进行成像。使用Adobe Photoshop CS2处理图像。对于成像分析，所有数据都是使用相同的设置获取的，这些设置最初是在NAWM切片上标准化的。使用Leica LAS软件测定AhR与CCL2、iNOS、Mx1、pSTAT1和GFAP的共定位程度，以及GFAP与CCL1、iNO S、Mx1和pSTAT1。重叠系数以百分比表示，其中100%表示最大共定位程度，0%表示没有共定位。

血清代谢物分析

在塞维利亚大学从健康对照组（11名）和MS患者（49名）采集血清样本。该研究得到了布里格姆女子医院机构审查委员会的批准，所有受试者都提供了书面知情同意书。如前所述，使用两种基于LC-MS的靶向代谢组学方法分析色氨酸和色氨酸代谢物⁶⁵简而言之，在正离子模式下，使用4000 QTRAP三重四极杆质谱仪（AB SCIEX，Framingham MA）与1200系列二进制HPLC泵（安捷伦，圣克拉拉，CA）和HTS PAL自动取样器（Leap Technologies，Carrboro，NC）耦合，测量色氨酸、犬尿氨酸、狗尿氨酸和邻氨基苯甲酸。使用九体积74.9:24.9:0.2（v/v/v）乙腈/甲醇/甲酸提取血清样品（10μL），其中含有稳定同位素标记的内标物（0.2 ng/μL缬氨酸-d8，Isocec；0.2 ng/微升苯丙氨酸-d8（Cambridge Isocope Laboratories，Inc.，Tewksbury MA））。将样品离心（10分钟，9000×g，4°C），并将上清液（10μL）注射到150×2.1mm亚特兰蒂斯HILIC柱（Waters）上。以250μL/min的流速用5%流动相a（10 mM甲酸铵和0.1%甲酸水溶液）等速洗脱柱1分钟，然后在10分钟内线性梯度至40%流动相B（乙腈和0.1%乙酸）。离子喷涂电压为4.5 kV，源温度为450°C。使用ACQUITY UPLC（Waters Corp，Milford MA）和5500 QTRAP三重四极质谱仪（AB SCIEX，Framingham MA）在负离子模式下测量犬尿氨酸。使用120μL 80%甲醇提取血清样品（30μL），其中含有0.05 ng/μL肌苷-15N4、0.05 ng/微升胸腺嘧啶-d4和0.1 ng/微L甘胆酸-d4，作为内部标准（剑桥同位素实验室，Inc.，Tewksbury MA）。样品离心（10 min，9000×g，4°C），上清液（10μL）直接注入150×2.0 mm Luna NH2柱（Phenomenex，Torrance CA）。以400μL/min的流速洗脱色谱柱，初始条件为10%流动相a（20 mM醋酸铵和20 mM氢氧化铵（Sigma-Aldrich）溶于水（VWR））和90%流动相B（10 mM氢氧化铵溶于75:25 v/v乙腈/甲醇（VVR）），然后进行10 min线性梯度至100%流动相a。离子喷涂电压为−4.5 kV，源温度为500°C。原始数据使用MultiQuant 1.2软件（AB SCIEX，Framingham MA）进行处理，以实现自动峰值积分。手动审查代谢物峰的整合质量，并与标准参考标准进行比较，以确认身份。

统计分析

使用Prism软件（GraphPad），使用单个图形图例中所示的统计测试进行统计分析。没有进行样本量估计，但样本量是根据先前的实验选择的。没有排除任何样本。在个别实验中，研究人员对小鼠的治疗方法一无所知。P（P）<0.05的值被认为是显著的。所有误差条表示s.e.m.或SD，如个别图形图例所示。除非另有说明，否则所有测定均使用≥3个独立实验，显示的数字具有代表性。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助的AI075285和AI093903，美国多发性硬化学会（National Multiple Sclerosis Society）资助的RG4111A1，以及国际进步型多发性贫血联盟（International Progressive MS Alliance）向FJQ资助的PA0069和PA-1501-02847。V.R.获得了Mallinkrodt Pharmaceuticals（A219074，V.R.）的教育资助，并获得了德国研究基金会（DFG RO4866 1/1，V.R）的奖学金，I.D.M.获得了国家多发性硬化学会的博士后奖学金（FG 2036-A1/1，I.D.M）的支持，L.B.由国际生命科学院的奖学金资助，L.M.由国家多发性硬化学会的博士后奖学金（FG1941A1/2，L.M.）资助，C-C.C.由台湾科技部的海外博士后研究项目（104-2917-I-564-024，C-C.C.C.）资助，麻省理工学院得到了巴西国家高级体育协会（CAPES）的一个奖学金（BEX 0571/15-6）的支持。