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生物化学杂志。2016年4月15日；291(16): 8399–8413.
2016年2月16日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M115.700088号
预防性维修识别码：项目经理4861415
PMID：26884329

胚胎干细胞表达的RAS（ERAS）在维持静止肝星状细胞中的作用*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

Saeideh Nakhaei-Rad公司,‡ 侯赛因·纳哈伊萨德,‡ Silke Götze公司,§ 克劳斯·科尔德斯,§ Iris Sawitza公司,§ 米歇尔·霍夫曼, 曼纽尔·弗兰克,‡ 沃尔夫冈·舒尔茨, 尤根·谢勒（Jürgen Scheller）,‡ 罗兰·皮耶科兹,‡ 迪特尔·哈辛格,§和穆罕默德·艾哈迈迪安‡,1
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关联数据

补充资料

摘要

肝星状细胞（HSC）最近被鉴定为肝-间充质干细胞。肝干细胞在肝损伤后被激活，参与肝脏发育、免疫调节、再生以及纤维化等关键过程。迄今为止，一些研究报告了在生理和病理生理过程中调节HSC可塑性的候选途径。在这里，我们分析了RAS家族GTPases的表达变化和活性，从而研究了静止HSC的信号网络与激活HSC。我们首次报道胚胎干细胞表达的RAS（ERAS）在静止的HSC中特异性表达，并通过启动子DNA甲基化在HSC激活过程中下调。值得注意的是，在静止的HSC中，ERAS蛋白的高水平与AKT、STAT3、mTORC2和HIPPO信号通路的激活以及FOXO1和YAP的失活相关。我们的数据强烈表明，在静止的HSC中，ERAS通过PI3Kα/δ和mTORC2驱动的两条不同途径靶向AKT，而在活化的HSC，RAS信号转导到RAF-MEK-ERK。因此，与ERAS在与细胞增殖相关的肿瘤细胞中的作用相比，我们的研究结果表明，ERAS对维持HSC的平静非常重要。

关键词：胚胎干细胞、肝星状细胞（HSC）、Hippo通路、哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-激酶

介绍

肝星状细胞2; 也称为伊藤细胞（Ito cells）、脂肪细胞、脂肪储存细胞或窦周细胞）占肝细胞总数的5-8%，位于窦内皮细胞和肝细胞之间的Dissé空间(1,2). HSC在肝脏发育、免疫调节、再生和病理学中发挥着关键作用。它们在表型、基因表达谱和细胞功能方面表现出显著的可塑性(三). 在健康肝脏中，HSC保持静止状态，维生素a主要以视黄酸棕榈酸酯的形式储存在细胞质膜包被的小泡中。此外，造血干细胞通常表达神经和中胚层标志物(即胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和结蛋白）。它们具有干细胞的特性，如Wnt和NOTCH的表达，这是决定发育命运所必需的。活化的HSC表现出与间充质干细胞高度相似的表达特征。由于间充质干细胞的典型功能，如分化为脂肪细胞和骨细胞，以及造血干细胞的支持，HSC被鉴定为肝移植间充质细胞(4).

肝损伤后，HSC被激活并表现出肌纤维母细胞样细胞的特性。在激活过程中，HSC释放维生素A，上调各种基因，包括α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原，下调GFAP(2). 活化的HSC是多能干细胞，最近的研究揭示了HSC可塑性的一个新方面(即它们在肝再生过程中分化为肝祖细胞）(5,6). 生理上，HSC代表着众所周知的细胞外基质生成细胞。在某些病理生理条件下，HSC的持续激活会导致肝细胞外基质积聚，并引发肝脏疾病，如纤维化、肝硬化和肝细胞癌。因此，值得重新考虑不同信号通路对HSC命运决定的影响，以便能够对其进行调节，从而使活化的HSC有助于肝再生而非纤维化。迄今为止，已有多种生长因子（PDGF、TGFβ和胰岛素样生长因子）和信号通路被描述为通过效应途径控制HSC激活，包括Wnt、Hedgehog、NOTCH、RAS-MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT3和HIPPO-YAP(7,–13). 然而，有必要进一步确定协调HSC活动的关键参与者，并了解他们如何控制HSC作为阳性和阴性调节因子的激活，以应对肝损伤。在这些途径中，RAS信号是最早被确定在HSC激活中发挥作用的途径之一(14)作为细胞内信号转导网络的节点。因此，RAS依赖的信号通路是本研究的重点。

RAS家族的小GTPase参与多种细胞过程，从细胞内代谢到增殖、迁移和分化，以及胚胎发生和正常发育(15,–17). RAS蛋白对细胞外信号作出反应，并通过与效应蛋白的相互作用将其转化为细胞内反应。RAS蛋白的活性是通过两组具有相反功能的特异性调节器高度控制的，鸟嘌呤核苷酸交换因子和GTPase激活蛋白（GAP）分别作为RAS信号的激活剂和灭活剂(18). 在本研究中，我们分析了Ras公司HSC中的亚型和发现的表达RAS的胚胎干细胞(能源监管局)在静止HSC中特别表达。迄今为止，有报道称ERAS在未分化胚胎干细胞和结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌和神经母细胞瘤细胞系中表达(19,–22). 最近，我们证明ERAS代表了RAS家族中一个独特的成员，具有显著的特征。ERAS最深刻的特点包括对GAP的不敏感(即组成活性），其在所有RAS亚型中唯一的N末端，其独特的效应器选择特性，以及其C末端的翻译后修饰位点(23).

在这里，我们详细研究了ERAS在静止和培养激活HSC中的表达、定位和信号网络。期间体外培养诱导的HSC激活，ERAS的表达在mRNA和蛋白质水平显著下调，可能是由于启动子DNA甲基化增加所致。我们通过HSC中的各种RAS效应器检测了ERAS的可能相互作用和信号传导。我们发现PI3Kα/δ-AKT、mTORC2-AKT和RASSF5（RAS关联域家族）-HIPPO-YAP轴可以被视为静止HSC ERAS的下游靶点。相反，MRAS、RRAS和RAP2A以及RAS-RAF-MEK-ERK级联可能控制活化HSC的增殖和分化。

材料和方法

细胞分离和培养

雄性Wistar大鼠（500–600 g）来自德国杜塞尔多夫海因里希·海因大学的当地动物设施。如前所述，肝脏用于分离HSC(24). 简单地说，用胶原酶H（罗氏应用科学）和蛋白酶E（默克）酶消化大鼠肝脏，并进行密度梯度离心，以获得HSC的原代培养物。纯化的HSC在添加15%胎牛血清和50单位青霉素/链霉素（Gibco Life Technologies）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中培养。如前所述，分离和培养其他肝细胞，如实质细胞、库普弗细胞和肝窦内皮细胞(25). MDCKII和COS-7细胞在补充10%胎牛血清的DMEM中培养。根据制造商的协议，使用TurboFect转染试剂（Life Technologies）转染MDCKII和COS-7细胞。

DNA甲基转移酶和组蛋白脱乙酰酶抑制剂治疗

在第3天，用10μ米5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza）（地西他滨，西格玛目录号A3656），一种特异性DNA甲基转移酶抑制剂，连续4天。同时，用5μ米组蛋白脱乙酰酶抑制剂亚甲酰苯胺羟肟酸（Vorinostat，Cayman Chemicals目录号10009929）在相同条件下的浓度。对照细胞仅用二甲基亚砜处理。在第8天裂解细胞进行RNA分离和定量实时逆转录聚合酶链反应（qPCR）分析。

逆转录酶聚合酶链反应

细胞被QIAzol裂解试剂（德国Qiagen）破坏，总RNA根据制造商的协议通过RNeasy Plus试剂盒（德国Qaagen）提取。分别在1%琼脂糖凝胶和纳米滴分光光度计上分析分离RNA样品的质量和数量。使用脱氧核糖核酸清除可能的基因组DNA污染TM（TM）DNA去除试剂盒（Ambion，Life Technologies）。使用ImProm-II将DNA酶处理的RNA转录成互补DNA（cDNA）TM（TM）反转录系统（德国普罗米加）。qPCR使用TaqMan探针或SYBR绿色试剂（生命科技）进行。用于Taqman系统中qPCR的探针/引物，包括Rn02098893_s1能源监管局HPRT1的Rn01527840_m1从Applied Biosystems（Life Technologies）购买。引物序列列于补充表S1.第2个−ΔΔ计算机断层扫描方法用于估计相对mRNA表达水平和2−ΔΔ计算机断层扫描mRNA水平。HPRT1用于归一化。

免疫染色

如前所述进行免疫染色(23). 简单地说，用含镁/钙的冰镇PBS清洗细胞两次，并在室温下用4%甲醛（默克）固定20分钟。为了使细胞膜渗透，细胞在0.25%Triton X-100/PBS中培养5分钟。在室温下，用3%牛血清白蛋白（BSA；Merck）和2%山羊血清稀释在含有0.25%Trito X-100的PBS中，封闭1小时。在4°C下用一级抗体孵育过夜，然后在室温下染色2 h。用PBS清洗细胞三次，每次10 min，并在室温下用二级抗体培养2 h。将载玻片清洗三次，并使用带有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（生命科技）的ProLong®Gold防伪贴装剂来安装盖玻片。初级抗体包括兔抗FLAG（目录号F7425，Sigma-Aldrich）、ERAS克隆6.5.2和GFAP（目录号Z0334，Dako）。二级抗体包括Alexa488-结合山羊抗兔IgG（目录号A11034）、Alexa546-结合山羊抗鼠IgG，目录号A11003和A11008，Alexa633-结合山羊抗家兔IgG和Alexa488结合山羊抗小鼠IgG。使用LSM 510元显微镜（Zeiss，Jena，Germany）获得共聚焦图像。

构件

老鼠能源监管局通过PCR从新分离的大鼠肝星状细胞的cDNA文库中扩增cDNA，随后分别通过BamHI/XhoI和EcoRI/BamHI限制性位点克隆到pcDNA.3.1和pEYFP-C1载体中。中G12V的突变人力资源管理系统(人力资源管理系统V12版本)和C220S/C222S英寸能源监管局(能源监管局不锈钢)如前所述，通过基于PCR的定点突变引入(26). 生成截断的N端子能源监管局变体(能源监管局ΔN个和能源监管局ΔN/S/S（不适用）),能源监管局重量和能源监管局不锈钢分别从氨基酸（aa）39至227和aa 1至227扩增cDNA。人类人力资源管理系统,KRAS公司,国家可再生能源管理局,TC21公司,MRAS公司、和电子逆向拍卖还有老鼠能源监管局在pGEX载体中克隆并用于蛋白质纯化大肠杆菌如前所述(27).

下拉分析

标记有FLAG的老鼠能源监管局和人类人力资源管理系统cDNA被克隆到pcDNA3.1载体中，并在COS-7细胞中过度表达。效应蛋白的RAS结合/关联域，包括CRAF-RBD（aa 51–131）、RALGDS-RA（aa 777–872）、PLCϵ-RA（aa 2130–2240）、p110α-RBD和RASSF5-RA（aa 200–358），在pGEX-4T中构建为GST融合子，并在大肠杆菌使用谷胱甘肽-脑葡萄糖珠从细菌总裂解物中分离出GST融合蛋白。从总细胞裂解物中提取GTP-结合的RAS蛋白，并在95°C的Laemmli缓冲液中加热10分钟。

免疫印迹法

用裂解缓冲液（50 m）制备细胞裂解物米三氯化氢，pH 7.5，100 m米氯化钠，2米米氯化镁2，1%Igepal CA-630，10%甘油，20米米β-甘油磷酸，1 m米 正交的-纳三VO（旁白）4，不含EDTA的蛋白酶抑制剂（罗氏应用科学）），蛋白质浓度通过Bradford试验（Bio-Rad）测定。对等量的细胞裂解物（ERAS，120μg；FOXO1/p-FOXO1，50μg；其余蛋白质，15μg）进行SDS-PAGE。电泳后，通过电印迹将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并在4°C下用一级抗体隔夜探测。Santa Cruz Biotechnology，Inc.的所有抗体在5%脱脂牛奶（Merck）/TBST（Tris缓冲盐水，0.05%吐温20）中稀释1:200，其余抗体稀释1:1000。以下抗体用于免疫印迹：来自Sigma-Aldrich的兔抗FLAG（目录号F7425）和小鼠γ-微管蛋白（目录号T5326）；兔子MEK1/2（目录号9126）、兔子ERK1/2（分类号9102）、兔子AKT（分类号9272）、兔子磷酸-MEK1/2（Ser-217/Ser-221，分类号9154）、兔子磷酸酯-ERK1/2（Thr-202/Tr-204，分类号9.106）、兔子磷酸盐-AKT（Ser-473，分类号4060；Thr-308，分类号2965）、兔子p110α（分类号4249），小鼠STAT3（目录号9139S）、兔磷酸化-STAT3（分类号9145S）、兔子FOXO1（分类号2880）和兔子磷酸化-FOXO1；以及圣克鲁斯生物技术公司的兔p110β（目录号sc-602）、p110γ（目录号sc-7177）和p110δ（目录号sc-7176）抗体。小鼠α-肌动蛋白抗体（目录号MAB1510）来自Millipore。用辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体（1:5000稀释）对膜进行染色。使用ECL（增强化学发光）试剂（GE Healthcare）对信号进行可视化。

GBD-纳米陷阱珠的表达、纯化及协同免疫沉淀

为了对COS-7细胞中过度表达的EYFP融合HRAS和ERAS进行免疫沉淀研究，我们将GFP-结合蛋白偶联到Sepharose珠。用于纳米陷阱实验的GFP结合蛋白的设计如前所述(28). 简言之，GFP结合VH（H）将H结构域克隆到pET23a-PelB载体中，加入C末端Myc和组氨酸（His6)标记并在中转换大肠杆菌BL21.过夜50毫升大肠杆菌使用抗生素氨苄西林进行预培养，将2000 ml培养基接种到A类6000.8。重组基因的表达用1m米异丙基β-d日-1-硫代吡喃半乳糖苷在30°C下过夜。通过离心（2 h，4°C，4000 rpm）收集细胞，上清液储存在−80°C。为了净化，上清液通过0.45-μm SFCA NALGENE®Rapid-Flow过滤TM（TM）瓶盖过滤器（Thermo Scientific，Waltham，MA），用于去除细胞碎片。通过流与聚丙烯缓冲液（500 m）以1:1的比例混合米氯化钠，50米米纳2高性能操作4/NaH（氢化钠）2人事军官4pH 7.4），并加载到预平衡的镍-硝基三乙酸柱（GE Healthcare）上并纯化。His标记蛋白用含有500 m的PP缓冲液洗脱米咪唑。浓缩蛋白质，并使用Amicon®Ultra-15 10K离心过滤装置（爱尔兰图拉格林默克米利波有限公司）去除咪唑。根据制造商的说明，为了通过GBD-纳米捕捉技术来下拉蛋白质，将1 mg纯化蛋白质共价偶联到2 ml NHS激活的Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare）。之后，将珠子在1m冰柜中清洗三次米将HCl（2分钟，5400 rpm，4°C）加入纯化的蛋白质中，并在室温下持续搅拌混合2小时。随后，通过添加阻断缓冲液（0.5米乙醇胺，0.5米NaCl，pH 8.3）2小时。最后，将珠子在0.1中清洗两次米三氯化氢（pH 8）。珠子储存在20%乙醇中。对于联合免疫沉淀，细胞在免疫沉淀缓冲液（20 m米三氯化氢，pH 7.4，150 m米氯化钠，5米米氯化镁2，0.5%Nonide P-40，10米米β-磷酸甘油，0.5 m米纳三VO（旁白）4，10%甘油，不含EDTA蛋白酶抑制剂）。用GFP融合纳米珠在4°C下对总细胞裂解物进行免疫沉淀2 h。用不含Nonide P-40的免疫沉淀缓冲液洗涤珠子五次，洗脱的蛋白质最终在95°C的SDS-Laemmli缓冲液中加热并通过免疫印迹分析。

RAS蛋白和抗ERAS单克隆抗体

所有RAS样蛋白，包括ERAS，按照所述的相同方案进行纯化(29). 单克隆抗ERAS抗体是通过用纯化的大鼠ERAS N末端肽免疫小鼠而定制的（Biogenes，德国柏林），然后通过蛋白a柱从相应杂交瘤细胞系的上清液中纯化（GE Healthcare）。浓缩抗体溶液（～3 mg/ml）补充10%的甘油并储存在−20°C下。

差速离心法分离HSC亚细胞

根据Taha的差速离心协议等。(30)在本研究中用于分离HSC。

ERAS启动子的DNA甲基化分析

对静止和早期激活的HSC进行全基因组DNA甲基化分析，以分析HSC激活期间的DNA甲基化变化(31). 使用UCSC基因组浏览器（加州大学圣克鲁斯分校）可视化甲基化数据。通过亚硫酸氢盐直接测序验证DNA甲基化变化。使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）从新鲜分离和培养的HSC中分离出DNA，并使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒（qiangen）进行亚硫酸氢转化。亚硫酸氢底漆能源监管局是使用MethPrimer在线工具设计的(32)覆盖启动子区域的一部分(能源监管局328 bp正向，5′-GTT GGG GGT AGG GAG TAT TTT AAT-3′；能源监管局328 bp反向，5′-CTC AAA ATT AAA AAA AAA-AAA TAA CC-3′）。使用Maxima Hot Start PCR Master Mix（Thermo Scientific）、20 ng亚硫酸氢修饰DNA和0.6μmol/L引物进行亚硫酸氢盐PCR。在95°C下活化后，使用PCR协议，在95°C下变性，在55°C下退火，在72°C下伸长率，进行40个周期。PCR产物在海因里希-海因大学的DNA测序设施中进行纯化和测序。如前所述，用Mquant方法定量DNA甲基化(33). 从周围10个胸腺嘧啶峰的平均信号中减去CpG二核苷酸处的胸腺嘧啶峰的高度，以量化该位点的DNA甲基化。对于能源监管局甲基化分析，我们计算了能源监管局启动子区。

结果

ERAS在静止未激活HSC中的表达

为了研究RAS蛋白对HSC的影响，我们首先研究了Ras公司家庭处于静止状态与qPCR激活大鼠HSC。将刚分离出的原代HSC培养在塑料皿上长达8天，在塑料皿中它们被激活体外培养并经历肌成纤维细胞转化(4). 在第8天（d8）分析HSC，并将其与代表激活和静止状态的非种子HSC（d0）进行比较。有趣的是，在Ras公司家庭，能源监管局在静止的HSC中特异性表达，并在HSC激活期间强烈下调(图1). 此外，我们应用基于探针的TaqMan实时PCR来监测能源监管局在HSC培养的不同时间点（d0、d1、d2、d4和d8）表达，并获得可比较的结果(补充图S1). 相反，人力资源HSC的表达仅略有下降（d8）。相反MRas公司,注册退休人员,拉拉、和拉普2A在活化的HSC中上调，而其他基因，包括KRas公司和自然资源账户，但在第0天和第8天之间没有显著差异(图1). 总的来说，这些数据表示从能源监管局到MRas公司,注册退休人员,拉拉、和拉普2AHSC激活期间的表达。

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静止状态下RAS家族相关基因的差异转录对在原代培养中激活HSC。大鼠肝新鲜分离HSC中RAS相关基因的qPCR分析(d0级)以及之后体外培养8天(第8天) (n个= 3,t吨测试；*，对< 0.05; **,对< 0.001).误差线、瑞典。

大鼠ERAS特异性单克隆抗体的制备与验证

ERAS在其GTP-/GDP-binding（G）域的上游包含一个N端扩展，在RAS家族中是唯一的(23). 如所示图2A类，两者之间存在显著差异智人(小时)和褐家鼠(尼泊尔)关于N末端的ERAS蛋白质(图2A类). 因此，我们纯化了褐鼠ERAS并产生针对该独特ERAS区域的抗体。获得了四个单克隆抗体（mAbs）克隆，并对其抗ERAS特异性进行了检测。RAS蛋白的免疫印迹分析大肠杆菌表明克隆mAb 6.5.2可清楚地检测到大鼠ERAS，但RAS家族的其他成员均未检测到(图2B类). mAb 6.5.2对智人ERAS和褐鼠使用COS-7和MDCKII细胞裂解物过度表达来测试ERAS蛋白智人ERAS和褐鼠ERAS分别作为EYFP融合蛋白。如所示图2C类，mAb 6.5.2仅识别大鼠ERAS(图2A类). 接下来，我们通过在MDCKII细胞中过度表达EYFP和FLAG标记的ERAS变体，在共聚焦免疫荧光分析中测试了mAb 6.5.2。如所示图2天，mAb 6.5.2对全长大鼠ERAS具有明确的特异性，但两者均未识别智人ERAS或褐鼠ERAS缺少N端扩展(尼泊尔电子逆向拍卖ΔN). 综上所述，mAb 6.5.2是一种适用于免疫印迹和免疫荧光分析的鼠特异性抗ERAS抗体。

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大鼠ERAS N末端单克隆抗体的规范和验证。 A类是ERAS蛋白中一种独特的N末端延伸。ERAS和其他RAS蛋白之间的氨基酸序列比较表明，ERAS在其G结构域上游显示了一个额外的区域，这是不同生物体中ERAS所特有的(23).智人(小时)和褐鼠(尼泊尔)ERAS（分别为NP_853510.1和NP_001102845.1）在该区域内差异很大(红色字母在里面褐鼠ERAS）。B类，抗ERAS单克隆抗体，克隆6.5.2，只识别纯化的ERAS蛋白，而不识别其他RAS家族成员。免疫印迹法(IB公司)不同RAS蛋白的分析，纯化自大肠杆菌，显示克隆6.5.2对大鼠ERAS的高度特异性，并且对其他RAS物种没有交叉反应。另外两种抗体被用作对照，它们分别只识别NRAS、HRAS和KRAS，而不识别ERAS。HRAS和KRAS不包含高变区(HVR（暖通空调）)因此，与NRAS相比，它们更小。C类和天，抗ERAS抗体（克隆6.5.2）识别的重组褐鼠ERAS，但不是智人免疫印迹法显示COS-7细胞过度产生ERAS作为YFP融合蛋白(C类)通过共焦成像在MDCKII细胞中作为FLAG标记蛋白(天). 旗帜-尼泊尔电子逆向拍卖ΔN结构，缺乏褐鼠ERAS作为阴性对照。比例尺，10微米。哥伦比亚广播公司考马斯亮蓝。

在各种大鼠肝细胞类型中，ERAS蛋白仅在静止的HSC中表达

mAb 6.5.2用于分析典型肝细胞群中ERAS蛋白的存在。因此，使用新分离的HSC、实质细胞、Kupffer细胞和大鼠肝窦内皮细胞的总细胞裂解物进行免疫印迹分析。有趣的是，ERAS在HSC中被检测为25kDa带，但在其他肝细胞类型中没有检测到(图3A类). 与mRNA表达数据一致(图1)，ERAS蛋白的量在HSC激活过程中急剧减少，因此与GFAP的损失相关(图3B类)标志着静止的HSC。相反，肌成纤维细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白从第4天开始在培养的HSC中检测到。此外，HSC的共焦成像显示ERAS主要是细胞溶质，与GFAP相比，在培养的HSC中仍然可以检测到ERAS，尽管与第0天相比，ERAS的数量要低得多(图3C类). 值得注意的是，在HSC（d0）的亚细胞组分中，ERAS主要存在于轻膜组分（高尔基体、滑面内质网和各种细胞器）中，少量存在于重膜组份（质膜和粗面内质网上）和细胞核中(图3天). 总的来说，ERAS在静止的HSC中可检测到，其蛋白水平在HSC激活期间显著降低。

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HSC中的ERAS蛋白。 A类，分离的肝细胞裂解物的免疫印迹分析在HSC中检测到ERAS，但在其他肝细胞中没有检测到。个人计算机，薄壁细胞；KCs公司，枯否细胞；SECs公司，窦内皮细胞。B类新分离ERAS的免疫印迹分析(d0级)和活化的HSC保持单细胞培养长达8天(第8天). GFAP和结蛋白被用作静止HSC的标记物(d0级)α-平滑肌肌动蛋白被用作活化HSC的标记物(第8天). α-肌动蛋白和γ-微管蛋白作为负荷对照。C类，HSC单细胞培养中从d0到d8的ERAS和GFAP共焦成像。在细胞培养过程中，ERAS和GFAP水平显著降低，细胞核中含有微量ERAS。比例尺，10微米。天亚细胞分馏分析显示，ERAS在第0天的HSC中显示出不同的亚细胞分布模式。HSC被分为四个不同的部分，包括重膜（质膜和粗面内质网）、轻膜（多聚体、高尔基体和滑面内质网上）、细胞质（细胞质和溶酶体）和富集核。

蛋白质-蛋白质相互作用分析确定PI3Kα是大鼠ERAS的特异性效应器

RAS家族GTP-结合蛋白的成员作为分子开关，通过激活效应蛋白将细胞外信号传递给细胞内反应。为了深入了解大鼠ERAS下游的效应器结合特异性，HRAS和ERAS的FLAG标记结构在COS-7细胞中过度表达，并使用总细胞裂解物进行下拉实验。在下拉分析中，使用了五种主要的RAS效应蛋白(即CRAF-RBD、RALGDS-RA、PLCϵ-RA、PI3Kα-RBD和RASSF5-RA）(23)，都是在年生产的大肠杆菌作为GST融合蛋白。有趣的是，我们发现与HRAS相比，ERAS优先且最强烈地与PI3Kα结合，而RASSF5和CRAF仅观察到适度的相互作用(图4A类). 与HRAS不同，ERAS与RALGDS和PLC均未检测到关联(图4A类). 因此，ERAS和HRAS与一组特定的非重叠效应蛋白相互作用并可能激活它们。

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静止HSC中的高活性PI3K-AKT和mTORC2-AKT通路可能由ERAS控制。 A类，瞬时表达的FLAG标记大鼠ERAS重量和人类HRAS重量被推倒(PD公司)来自COS-7细胞裂解物和众所周知的RAS效应物，包括CRAF-RBD、RALGDS-RA、PLCϵ-RA、PI3Kα-RBD和RASSF5-RA，作为GST融合蛋白。免疫印迹(IB公司)用总细胞裂解物的%作为对照检测FLAG-RAS。B类，本研究中使用的FLAG标记的RAS构建体，包括ERAS重量、ERASΔN（N端截断，aa 39–227），ERAS不锈钢（棕榈酰化缺陷）和ERASΔN/S/S（N-末端截断和棕榈酰化缺陷）以及HRAS重量和HRASV12版本(G公司，G域）。C类，PI3Kα-RBD-衍生下拉(PD公司)通过FLAG-tag和AKT磷酸化的免疫印迹分析GTP-结合ERAS变体及其信号活性(p-AKT公司)位于位置Thr-308和Ser-473。天静止和活化HSC中PI3K亚型α、β、γ和δmRNA定量表达分析(d0–d8).E类静止和活化HSC中PI3K亚型的免疫印迹(d0–d8).F类PI3K亚型与ERAS的联合免疫沉淀分析重量、HRAS重量和HRASV12版本在COS-7细胞中过度表达为EYFP融合蛋白。TCL公司，总细胞裂解物。G公司静止和激活HSC中PI3K-AKT和mTORC2轴下游磷酸化信号蛋白的免疫印迹(d0–d8). 总AKT、FOXO1和STAT3作为对照。

与HRAS和NRAS类似，ERAS包含用于翻译后修饰的保守C末端基序，以及类似法尼基化和棕榈酰化的HRAS(23). ERAS具有具有各种基序的N末端延伸，并显示出关键的氨基酸偏差，即50位的丝氨酸而不是甘氨酸（HRAS中的Gly-12），这使得ERAS对GAP不敏感(23). 这些特性可能会影响ERAS与PI3K及其下游信号的物理交互。因此，我们生成并分析了不同的ERAS变体，缺少N末端（ERASΔN)或用于棕榈酰化的保守半胱氨酸（ERAS不锈钢)或两者（ERASΔN/S/S) (图4B类). 首先，我们研究了ERAS变体与PI3Kα催化亚基的结合。获得的数据表明，所有ERAS变体都能与PI3Kα-RBD相关(图4C类,顶部). 这表明ERAS的N末端及其通过棕榈酰化修饰的C末端对于PI3Kα-RBD与ERAS的G结构域的结合不是必需的。

为了通过PI3K和mTORC2途径检测ERAS变体对AKT的信号传递活性，我们接下来使用特异性抗磷酸化AKT（苏氨酸308和丝氨酸473）抗体监测AKT的磷酸化状态。值得注意的是，ERAS强烈激活AKT，并在两个不同的位点诱导其磷酸化(即PI3K-PDK1（p-AKT）在Thr-308处T308电话)和mTORC2在Ser-473处（p-AKT第473页;图4C类,底部)). 有趣的是，与ERAS野生型（WT）相比，ERAS变体，最显著的是截断的N末端（ERASΔN)，含有两个半胱氨酸220和222的棕榈酰化缺陷变体被丝氨酸取代（ERAS不锈钢)以及两种变体的组合（ERASΔN/S/S)诱导AKT磷酸化显著降低，尤其是p-AKT第473页，表示mTORC2活性。这些数据表明，ERAS N末端及其通过棕榈酰化的质膜锚定对通过PI3K和mTORC2轴激活AKT至关重要，尽管GTP结合态的形成和与PI3K的相互作用没有受到影响。

ERAS-PI3Kα/δ-AKT和mTORC2-AKT轴在静止HSC中高度激活

我们的研究结果表明，PI3K的催化亚基是ERAS下游的一个候选效应器。PI3K、p110α、p110β、p110γ和p110δ的p110催化亚基有四种亚型，这对HSC ERAS-PI3K相互作用中的p110亚型特异性提出了疑问。mRNA表达分析数据显示，PI3K的α亚型在静止和激活的HSC之间没有显著变化，而β和δ亚型的mRNA水平在HSC激活过程中增加(图4天). 然而，在蛋白质水平上，与β亚型相比，静止HSC中的α和γ亚型水平明显更高(图4E类). HSC激活后，β亚型和在一定程度上δ亚型的蛋白质水平增加，而α和γ亚型减少(图4E类). 接下来，我们利用ERAS在COS-7细胞中的过度表达，在联合免疫沉淀实验中研究了ERAS与四种PI3K亚型的相互作用。野生型和HRAS的组成活性变体（HRAS重量和HRASV12版本)用作对照。数据如所示图4F类表明不仅PI3Kα，而且δ亚型与ERAS共免疫沉淀V12版本(图4F类). 因此，基于细胞的研究证实了ERAS和PI3Kα之间的相互作用，这与我们在无细胞条件下获得的数据一致(图4A类).

在下一步中，我们监测了AKT磷酸化状态，发现与激活的HSC相比，静止的HSC在第0天和在一定程度上在第1天表现出更高的p-AKT第473页和p-AKTT308电话水平，分别代表mTORC2和PI3K-PDK1活性(图4G公司). 此外，我们还分析了FOXO1和STAT3的磷酸化状态，这两个其他信号分子被认为是ERAS下游(34). 有趣的是，在ERAS表达的静止HSC中，我们观察到Tyr-705的STAT3磷酸化和Ser-256的FOXO1磷酸化水平较高(图4G公司). 因此，很明显，ERAS向PI3K-PDK1和mTORC2通路发出的信号激活AKT，也可能激活STAT3，但使FOXO1失活，以维持HSC处于静止状态。

ERAS不会积极影响MAPK途径

在下一步中，我们研究了静止期ERAS与CRAF-RBD和MAPK通路的相互作用与激活的HSC。野生型ERAS及其棕榈酰化缺陷变体（ERAS）不锈钢)与CRAF-RBD强结合，尽管与组成型活性HRAS相比具有相当低的亲和力V12版本变体(图5A类). 然而，对于ERAS来说，这种约束较弱ΔN和ERASΔN/S/S，都缺少N端扩展。值得注意的是，后一种变体是有效表达的，并且也以GTP绑定形式存在(图4C类). HRAS也是如此重量表达水平与HRAS相似V12版本(图4C类). 然而，由于其能够正常水解GTP，其GTP结合水平低得多，因此导致HRAS含量低重量CRAF-RBD下拉实验中(图5A类). 最值得注意的是，ERAS的表达重量在COS-7细胞中，p-MEK1/2和p-ERK1/2水平明显降低，远低于载体控制和HRAS变异体获得的水平(图5A类). 值得注意的是，所有分析的ERAS变体（ERASΔN、ERAS不锈钢和ERASΔN/S/S).

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激活HSC中的RAF-MEK-ERK信号。 A类，CRAF-RBD衍生下拉(PD公司)通过免疫印迹分析GTP-结合的HRAS和ERAS变体及其对MAPK通路的信号活性(IB公司)FLAG标签和MEK1/2磷酸化(p-MEK1/2型)和ERK1/2(p-ERK1/2型)使用来自转染COS-7细胞的总细胞裂解物。以γ-管蛋白为负荷对照。B类，联合免疫沉淀分析(IP（IP）)RAF亚型与ERAS重量、HRAS重量和HRASV12版本在COS-7细胞中过度表达为EYFP融合蛋白。TCL公司，总细胞裂解物。C类，定量mRNA表达分析拉夫,甲乙酮、和ERK公司静止和活化HSC中的同种型(d0–d8).天MAPK通路成分的免疫印迹分析，包括静止和激活HSC中的RAF亚型、p-MEK1/2和p-ERK1/2(d0–d8). 使用pan-RAS抗体检测总RAS。MEK1/2和ERK1/2以及γ-微管蛋白的总量作为负荷控制。

此外，我们通过过度表达和免疫沉淀COS-7总细胞裂解物中EYFP标记的ERAS，分析了大鼠ERAS与细胞RAF亚型（ARAF、BRAF和CRAF）的结合特性。作为对照，我们使用HRAS重量和HRASV12版本.图5B类表明ERAS与HRAS相比V12版本，仅与ARAF和CRAF弱绑定，这与CRAF-RBD在下拉实验中获得的数据一致(图5A类). 因此，我们得出结论，ERAS可以被排除为RAF蛋白和MAPK通路的激活剂。

活化HSC中的MAPK通路高度动态

我们的数据表明，ERAS在静止的HSC中内源性表达，在COS-7细胞过度表达的情况下，ERAS似乎不是MAPK通路的激活剂。因此，我们分析了HSC活化后MAPK通路的活性。首先，我们分析了拉夫,甲乙酮、和ERK公司静止状态下的亚型与通过qPCR激活HSC。如图例所示图5C类，除了低表达BRaf公司在静止和激活的HSC中(图5C类). 为了进一步研究MAPK通路在HSC激活中的作用，我们观察了磷酸化的蛋白水平(即激活）与总计MEK1/2和ERK1/2。如所示图5天与相对恒定量的ERK1/2相比，MEK1/2的表达在HSC激活过程中强烈增加。ERK1（44kDa）水平远高于ERK2（42kDa。相反，RAF亚型和总RAS的数量在静止的HSC中最高（第0天），在HSC激活期间减少(图5天). 最值得注意的是，我们观察到p-MEK1/2和p-ERK1/2的增加，尤其是p-ERK2，这表明活化的HSC中MAPK通路的激活增加(图5天). 相反，RAF亚型和RAS总量在静止HSC（第0天）中最高，随后在HSC激活期间下降(图5天). 总之，HSC似乎相互利用ERAS下游的不同途径来维持其命运(即在静止的HSC中，ERAS可以激活PI3K-PDK1和mTORC2通路，而激活的HSC则可以激活MAPK通路）。

ERAS有助于抑制YAP活性，因此可能对抗静止HSC的激活

体外蛋白质相互作用研究表明，ERAS与HRAS一样，直接与RASSF5相互作用(图4A类和​和66A类). 据报道，RASSF5通过充当MST2/STK3的正调节因子，使HIPPO通路（通过MST2/STK3）能够响应和整合多种细胞信号(35). 最近的一项研究揭示了YAP在HSC激活过程中的作用，YAP是HIPPO通路的中央效应器(13); 因此，我们分析了ERAS是否激活HIPPO途径，这可能导致YAP的磷酸化和蛋白水解降解(补充图S2和S3A类). 我们进一步研究了YAP及其靶基因是否在活化的大鼠HSC中表达。为了解决第一个问题，我们使用了COS-7细胞，该细胞通常含有大量的YAP及其磷酸化形式（p-YAP第127节;图6B类; 参见矢量控制）。有趣的是，p-YAP第127节当大鼠ERAS过度表达时，YAP水平显著降低(图6B类和补充图S2)强烈表明ERAS激活了COS-7细胞中的HIPPO通路。HRAS变体也获得了类似的结果(图6B类). 重要的是，我们接下来探讨了YAP和p-YAP第127节在HSC裂解物中，并在激活的HSC（第8天）中检测到它们，但在静止的HSC中未检测到(图6C类). mRNA分析进一步揭示了女士1/2（哺乳动物的直系祖先河马)亚型在两种状态下都有表达，但表达水平更高消息1与相比女士2.Yap及其靶基因，细胞生长因子（结缔组织生长因子）和缺口2HSC激活后，其表达水平显著增加(图6天). 此外，ERAS的效应器结合域（开关区）与HRAS的关键残基有很大不同，这可能决定ERAS与其效应器结合的特异性(23) (补充图S3B类). 有趣的是，我们发现ERAS（ERAS）效应器结合区中两个表面暴露残基（H70Y/Q75E）的突变SW1型)与野生型ERAS相比，取消了RASSF5的结合亲和力(补充图S3C类). 这些发现表明，ERAS需要HRAS中不保守的特定残基与RASSF5相互作用。为了监测突变ERAS下游ERAS-RASSF5-MST1/2-LATS1/2-YAP级联的活性，我们接下来分析了总细胞裂解液中YAP蛋白的水平。一致地，当RASSF5结合缺陷ERAS突变（ERAS）时，我们检测到大量的YAPSWI公司)过度表达(补充图S3，天和E类). 这些数据进一步支持了ERAS是HIPPO-YAP途径上游的观点。总的来说，HIPPO途径的激活似乎使HSC保持静止状态，而YAP显然可能在HSC的激活和最终的进一步发展中发挥作用。在静止的HSC中，YAP明显受到抑制，这种抑制可能通过ERAS-RASSF5信号传导介导。

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ERAS-RASSF5相互作用可能抑制激活的HSC中高度活跃的YAP。 A类，RASSF5-RA下拉(PD公司)HRAS的重量,智人ERAS，以及褐鼠ERAS在COS-7细胞中过度表达。检测FLAG标记的RAS蛋白和α-微管蛋白总量作为负荷对照。IB公司，免疫印迹。B类COS-7细胞裂解物Ser-127上YAP和p-YAP的免疫印迹过度表达野生型ERAS和HRAS以及HRAS的组成活性变体（HRAS）V12版本). α-管蛋白被用作负荷控制。C类静止状态下血清-127的YAP和p-YAP免疫印迹(d0级)和激活的HSC(第8天). γ-管蛋白作为对照。天MST1和-2以及YAP及其靶基因的qPCR分析细胞生长因子和缺口2处于静止状态(d0级)与激活的HSC(第8天).

ERAS位点DNA甲基化增加与激活HSC中ERAS基因沉默相关

描述可能负责下调能源监管局活化HSC的表达，大鼠启动子区的表观遗传学分析能源监管局基因检测。对先前进行的全基因组DNA甲基化分析的评估表明，CpG甲基化在能源监管局早期HSC激活期间约18%的启动子(图7A类). 期间进行更详细的亚硫酸盐排序分析在体外HSC激活显示启动子DNA甲基化显著增加，这与能源监管局HSC激活期间的表达(图1和​和77B类和补充图S1). 值得注意的是，在HSC培养的第7天，启动子DNA甲基化的总体程度从65.5%增加到~80%。调查ERas公司启动子甲基化，我们检测DNA甲基转移酶抑制剂5-AZA是否可以恢复激活的HSC中ERAS的表达。因此，我们将原代大鼠HSC培养3天，以使ERas公司mRNA表达下调(补充图S1). 在HSC激活的第8天（以及5-AZA治疗的第4天），我们分析了ERAS的表达。如所示图7C类，5-AZA治疗恢复能源监管局活化HSC中约4倍表达。测试是否能源监管局表达也通过组蛋白修饰进行调节，例如组蛋白乙酰化，我们用5μ米亚甲酰苯胺羟肟酸（组蛋白脱乙酰酶抑制剂）。如所示图7C类，单用亚甲酰苯胺羟肟酸治疗不足以挽救生命能源监管局表达式。综合起来，我们的数据表明能源监管局表达，但不是自然资源账户以及其他Ras公司-相关基因，如注册退休人员和拉普2A（数据未显示），HSC激活可能是由表观遗传基因沉默引起的。

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DNA甲基化分析能源监管局在静止和激活的主HSC中。 A类，静止HSC全基因组DNA甲基化分析结果(d0级)和早期激活的HSC(第3天)在能源监管局启动子区。单个CpG二核苷酸的DNA甲基化以百分比表示（甲基化CpG/CpG总数），并用颜色代码从红色（0%）至浅绿色（100%DNA甲基化）。B类,能源监管局亚硫酸氢盐直接测序分析的启动子甲基化显示HSC激活过程中DNA甲基化显著增加(n个= 3–5,t吨测试；*，对< 0.05).C类，HSC（第3天）用10μ米5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5扎)和/或5μ米亚甲酰苯胺羟肟酸(SAHA公司)持续4天，表达能源监管局在第8天进行qPCR分析。误差线、瑞典。

讨论

在这项研究中，我们发现电子逆向拍卖在一种类型的肝旁细胞HSC中特异表达。以下人员的在场能源监管局在静止的HSC中检测到mRNA，但在激活的HSC内未检测到。相反，其他RAS相关基因，如注册退休人员,MRas公司,拉拉、和拉普2A在HSC激活期间上调。ERAS蛋白在静止的HSC中检测到，但在其他类型的肝细胞中未检测到，并且ERAS在HSC激活期间显著下调（d4和d8）。为了阐明ERAS在静止HSC中的功能，我们寻找ERAS特异性效应器和相应的下游通路。与一组RAS效应器的相互作用分析表明，ERAS优先与PI3Kα相互作用，并激活PI3K-PDK1-AKT轴。mTORC2在静止HSC中显著的AKT磷酸化表明，mTORC2-AKT作为一种候选途径介导ERAS下游的信号传导。有趣的是，在静止HSCs中，ERAS对MAPK级联没有任何活性，而在活化HSCs则相反。如果被RAS和RASSFs激活，MST1/2-LATS1/2-YAP（HIPPO途径）会导致YAP失活和蛋白体降解。事实上，在静止HSC和表达ERAS的COS-7细胞中几乎检测不到YAP，以及ERAS和RASSF5之间的相互作用，这表明ERAS可能是静止HSC中HIPPO途径的激活剂。我们一直在活化的HSC中检测到YAP蛋白及其上调的靶基因。

PI3K-AKT-mTORC1活性在静止HSC中的作用

COS-7细胞中ERAS的瞬时表达和静止HSC中内源性ERAS的表达分别与Thr-308和Ser-473通过PDK1和mTORC2磷酸化的高水平AKT密切相关。蛋白质相互作用和免疫沉淀分析进一步揭示了ERAS与PI3Kα和PI3Kδ的物理相互作用(图4,C类和F类). 因此，在静止HSC中，我们建议ERAS作为PI3K-PDK1-AKT-mTORC1轴的调节器。该轴参与各种过程，包括细胞周期进展、自噬、凋亡、脂质合成和翻译(36,–40). 后者由mTOR介导的S6激酶激活控制，S6激酶反过来磷酸化不同底物，如核糖体蛋白S6、Ser-2448处的mTOR本身以及mTORC2上游成分Thr-86处的mSIN1(图8) (41,–43). 以前的研究表明，静止的HSC产生并分泌大量HGF(44,45)已知可调节肝细胞存活(46). HGF的产生和分泌受mTORC1-S6激酶途径的调节(47). 除了从肝细胞向HSC转运维甲酸外，mTORC1活性可能影响从头开始HSC中的脂质合成。mTORC1可能通过甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）和过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）促进HSC的脂质合成(48). 在这方面，已经证明姜黄素通过调节PPARγ和特异性蛋白-1（SP1）的活性抑制培养的HSC中SREBP的表达，从而抑制LDLR的表达，LDLR阻止了LDL诱导的HSC活化(49). 因此，AKT-mTORC1-SREBP/PPARγ途径似乎在脂质代谢中发挥着关键作用，这显然是与其他途径一起调节HSC命运所必需的。

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静止状态下ERAS/RAS相互依赖信号通路的拟议模型示意图与激活的HSC（有关详细信息，请参阅“讨论”）。 发动机控制模块细胞外基质；IGF公司胰岛素样生长因子；LIF1级白血病抑制因子；TSC公司结节性硬化。

最近，Kwon等。(50)研究表明，在小鼠胚胎干细胞中，ERAS的过度表达通过JNK途径诱导SP1激活。然而，JNK-SP1信号是否也是HSC内源性ERAS的下游靶点还有待解决。

静止HSC中mTORC2-AKT-FOXO1轴的活性

与mTORC1相比，对mTORC2的调节了解较少(51). 例如，TSC1-TSC2复合物可以在物理上与mTORC2结合，但不能与mTORC结合，这被认为可以促进mTORC1活性(52). 我们的研究结果表明，ERAS可能是mTORC2通路的激活剂。研究表明，外源ERAS可促进小鼠胚胎成纤维细胞产生的诱导多能干细胞中AKT（Ser-473）和FOXO1（Ser-256）的磷酸化(34). 因此，ERAS-AKT-FOXO1信号可能对体细胞重编程很重要。我们检测到高水平的p-AKT第473页和p-FOXO1256美元在静止的HSC内生表达ERAS(图4G公司). 磷酸化FOXO1被隔离在细胞质中，不能转移到细胞核，在那里它与基因启动子结合并诱导凋亡(53). 有趣的是，ERAS和mTORC2之间的可能联系可能是mSIN1，它似乎是mTORC1活性的上游成分和调节剂(54). 据报道，mSIN1含有一个与CRAF同源的RAS结合域(55). 总之，ERAS-mTORC2-AKT-FOXO1轴可以通过干扰程序性细胞死亡来确保HSC在Dissé空间的存活(图8).

HGF-JAK-STAT3轴在静态HSC中的作用

ERAS的异位表达可能刺激白血病抑制因子（LIF）下游STAT3的磷酸化(34). ERAS可以弥补LIF的缺乏，以支持诱导的多能干细胞生成(34). 此外，LIF-STAT3轴对于保持小鼠干细胞在培养中未分化以及调节胚胎干细胞的自我更新和多能性至关重要(56). 磷酸化STAT3（p-STAT3）已被证明与FOXO1/3转录因子直接相互作用并调节其向细胞核的转运(57). 我们一直在静止的HSC中检测到高水平的p-STAT3和p-FOXO1(图4G公司)，其可以控制静止HSC的存活、自我更新和多能性。此外，刺激HSC中表达的HGF受体（c-MET）导致JAK激活和STAT3磷酸化(1,58). 有趣的是，HGF是IL6-STAT3信号传导的靶基因(59,60). 因此，自分泌HGF-JAK-STAT3信号也可能解释静止HSC中STAT3磷酸化(图8). 然而，确定HSC中LIF-STAT3轴的存在和活性需要进一步研究。

静止型造血干细胞显示锁定的RAS-MAPK信号通路

在静止的HSC中，虽然RAS-RAF-MEK-ERK轴的所有成分都表达，但只能观察到活化（磷酸化）MEK和ERK的基本水平(图1和​和55(C类和天)). 对于静止HSC中RAS-MAPK信号的活性显著降低，有几种解释(图8). （i） 健康肝脏中缺乏PDGFA和TGFβ1等外部刺激。这些生长因子是活化HSC中MAPK通路的强激活剂(7,8). （ii）一种细胞内抑制剂，如特殊的富含AT-结合蛋白1（SATB1），在静止的HSC中特异表达，并在HSC激活期间下调(61)存在。有趣的是，SATB1已被证明是RAS-MAPK通路的一种强抑制剂，可能会阻断静止HSC中的这种信号传导(61). （iii）MicroRNAs（miRNAs），尤其是miRNA-21，可能在静止状态下RAS-MAPK通路的相互调节中发挥作用与激活HSC。激活的HSC中上调miRNA-21导致MAPK激活，这是基于miRNA-2的靶基因SPRY1（芽同源物1）的缺失(62)和RAS-MAPK通路的负调控因子(63).

不同p110异构体的PI3K-AKT通路的生物学功能

据报道，催化PI3K亚型p110α和-β广泛表达，而p110γ和-δ的存在主要局限于造血细胞类型(64,–67). 我们通过与p110α相互作用和适度与p110δ相互作用，确定ERAS是AKT的激活剂(图4F类). 我们的RNA和蛋白质分析表明第110页静止HSC中的α/γ和升高的第110页活化HSC中的β/δ(图4,天和E类). 韦茨克及其同事(68)据报道，维甲酸治疗可以刺激U937细胞（一种骨髓单核细胞系）中p110γ的表达，但不能刺激p110β/δ的表达。静止的HSC在其脂滴中以视黄醇酯的形式储存高水平的维甲酸，这可能通过上调p110γ在HSC中引发相同的功能。卡德姆等。(69)已经表明HSC也表达p110δ亚型，并且HSC中p110δ缺陷阻止了它们的激活及其在T细胞中的支持作用规则内脏利什曼病感染小鼠的扩张。因此，活化HSC中高水平的p110δ亚型可能与其免疫调节功能有关。

HSC中ERAS表达的表观遗传调控

与其他RAS蛋白不同，ERAS对GAP不敏感，并且不易被RASGAP蛋白灭活(21,23). 这就提出了关于ERAS监管的潜在模式的问题。因为ERAS并不是无处不在的表达，并且似乎仅限于少数细胞类型，我们提出ERAS主要是在转录水平上调节的，正如前面所描述的胃癌(70). 我们的表观遗传学研究ERas公司启动子显示其DNA甲基化在HSC激活期间增加（高达18%(图7,A类和B类). 此外，用DNA甲基转移酶抑制剂处理诱导了能源监管局培养中激活的HSC(图7C类). 一贯地，ERas公司DNA甲基转移酶抑制剂也能在某些胃细胞系中诱导表达(70). 总之，我们的发现清楚地表明，DNA甲基化是抑制能源监管局激活HSC期间。可以想象，能源监管局-特定的microRNA也可以控制mRNA的降解和翻译能源监管局诱导HSC激活时。

激活HSC的细胞信号特征

体外培养肝星状细胞会改变其基因表达谱和细胞特性，从而刺激HSC的激活(1,31,71,72). HSC通常会失去脂滴和GFAP的表达，并诱导胶原蛋白、基质金属蛋白酶（MMP2、-9和-13）和α-平滑肌肌动蛋白的合成，作为重要的分化标记物(2,11). 总的来说，在这一过程中，HSC改变其静止特征，并发展为肌纤维母细胞样细胞，这是公认的增殖、多能干和迁移细胞(6,73,74). 对各种RAS家族成员的mRNA综合分析表明注册退休人员,MRas公司,拉拉、和拉普2A在HSC激活期间上调(图1). 这些基因也可能在细胞过程的协调中发挥作用，这些过程是HSC激活和分化所必需的，例如极性、运动性、粘附和迁移。有趣的是，RRAS与整合素依赖性细胞粘附有关(75). 值得注意的是，在内皮细胞中，RRAS-RIN2-RAB5轴刺激β1整合素以RAC1依赖的方式(76). 另一方面，肌肉RAS癌基因同源物(MRas公司)是一种RRAS相关蛋白，在HSC激活期间上调。在RAS家族的不同成员中，只有MRAS可以与蛋白磷酸酶1的三元复合物中的SHOC2相互作用，该复合物将自身抑制的CRAF去磷酸化，从而激活CRAF-MEK-ERK级联(77). 本研究中获得的这些发现和数据表明，MRAS可能是RAF激酶激活导致活化HSC中高水平p-MEK和p-ERK的原因。RAP蛋白，包括RAP2A，参与不同的细胞过程，在细胞运动和细胞粘附中发挥关键作用(78,79). 最近，有研究表明RAP2A代表了一个新的p53靶基因和癌细胞迁移的调节器(80). 此外，癌细胞中RAP2A的表达导致两种基质金属蛋白酶（MMP2和-9）的分泌和Ser-473的AKT磷酸化，从而促进肿瘤侵袭(80). 值得注意的是，p53在活化的HSC中上调(81). 因此，我们推测p53与RAP2A启动子的结合可能导致活化的HSC中RAP2A的转录，并可能刺激MMPs的分泌，MMPs重塑细胞外基质并促进HSC在Dissé空间中的迁移。

活化HSC的增殖、生长和分化

与静止的HSC相比，活化的HSC是增殖细胞，可以通过细胞检查点(82). 候选途径之一是RAF-MEK-ERK级联，可通过不同的生长因子刺激。与之前的研究一致，我们在培养激活的HSC中检测到高水平的p-MEK和p-ERK(7,83). 有三种情况可以解释活化HSC中RAF-MEK-ERK活性升高的原因。（i） 如上所述，带有SHOC2和蛋白磷酸酶1的MRAS能够激活CRAF-MEK-ERK途径(80). 磷酸化ERK转位到细胞核并磷酸化不同的转录因子，包括Ets1和c-Myc，从而引发细胞周期进展和增殖。细胞质p-ERK交替磷酸化Mnk1和p90RSK，从而促进蛋白质合成和细胞生长(84,85). （ii）PDGF和胰岛素样生长因子1是活化HSC最有效的有丝分裂原，并诱导MAPK通路的激活(7,86). （iii）在HSC激活期间，RAS-RAF-MEK-ERK途径的细胞抑制剂SATB1的表达显著下降(61).

ERAS-RASSF5-MST1/2-LATS1/2-YAP轴在HSC中的假定作用

我们观察到ERAS和RASSF5A的RA之间存在适度的相互作用(图6A类). 以前，我们发现ERAS的开关I区域对ERAS-RASSF5相互作用很重要，该区域的突变破坏了ERAS与RASSF5的结合(23). RASSF蛋白被认为是具有肿瘤抑制功能的特异RAS效应器(87,88). 在HSC中表达的MST1/2通过其SARAH（SAV/RASSF/HPO）结构域与RASSF1/5A和WW45相互作用并形成异二聚体(89). 这种复合物磷酸化并激活LATS1/2，进而促进细胞质中YAP的磷酸化、隔离和蛋白酶体降解(补充图S3A类) (90,91). YAP是一种转录共激活物，可促进细胞生长因子和缺口2参与细胞发育和分化(92,–95). 研究表明，HIPPO-YAP途径分别在分化的实质细胞和未分化的肝祖细胞中起着不同的作用。最近，van Grunsven及其同事(13)据报道，YAP转录共激活物控制在体外和体内激活HSC。与本研究一致，与激活的HSC相比，我们在静止的HSC中几乎没有观察到任何YAP蛋白(图6C类). 因此，我们的数据表明，通过RASSF5-MST1/2-LATS1/2降解YAP可能是由RASSF5通过ERAS-GTP与质膜结合和募集而触发的(图6B类和​和88).

细胞存活和抗凋亡途径

活化HSC最重要的特征之一是其在肝损伤和再生过程中的存活和抗凋亡反应(96). 在这里，我们证明了p-AKT水平不仅在静止状态下升高，而且在活化的HSC中也升高，后者导致生存前反应，例如FOXO1磷酸化(图4G公司). 此外，我们检测到中等水平的p-STAT3，这意味着JAK1-STAT3-SOCS3轴可能控制活化HSC中的抗凋亡途径。

最后，活化的HSC中YAP转录活性较高，这可能是由于AKT和mTOR对MST1/2的抑制作用所致(97)可能有助于增加细胞存活、增殖和活化HSC的发育(13)通过对促凋亡RAS-RASSF5-MST1/2-LATS1/2途径产生拮抗作用(图8).

人和大鼠ERAS的功能相似性

我们观察到人类和大鼠ERAS之间的序列偏差，尤其是在其延伸的N末端(图2A类). 因此，我们比较了不同人类和大鼠ERAS变体的信号活性。然而，到目前为止，我们没有观察到显著的功能差异(图4和补充图S4). ERAS在人类疾病中的作用尚不清楚。它的表达范围从胚胎干细胞到肿瘤(20,21). 山中弥及其同事(21)已经引入ERAS作为维持胚胎干细胞生长的关键因素。凯崎语等。(20)据报道，ERAS在45%的胃癌组织中表达，并观察到ERAS阴性患者与较差预后之间的相关性。此外，ERAS可能促进神经母细胞瘤患者的转化活性和化疗耐药性(19).

总之，表达分析揭示了静止状态下RAS和RAS信号成分的不同模式与激活HSC。在不同的RAS家族成员中，我们发现能源监管局,第110页α、 和第110页γ主要表达于静止的HSC和MRas公司,注册退休人员,拉普2A,拉拉,第110页β,第110页δ,雅普,细胞生长因子、和缺口2以激活的HSC表示。我们的数据表明静止HSC中通过PI3K-AKT-mTORC1和HIPPO信号增加活性。因此，本研究将ERAS信号添加到静止HSC的显著特征中，这些信号通路的细胞结果将通过抑制增殖（HIPPO通路，G0停搏）和凋亡（PI3K-PDK1和mTORC2）（参见图8). 另一方面，活化的HSC表现出YAP-CTGF/NOTCH2和RAS-RAF-MEK-ERK活性，两者都参与HSC的增殖和发展(图8). 最后，我们想指出，我们的研究基于体外激活HSC，这是一个已知的模型体内活化过程(13,72). 然而，在体外模型和体内情况。因此，未来的研究还应解决ERAS在体内肝损伤模型。

作者贡献

M.R.A.构思并协调了这项研究。M.R.A.和S.N.R.设计了研究并撰写了论文。S.N.R.、H.N.、S.G.、I.S.、C.K.、M.J.H.和M.F.设计、执行和分析了实验。所有作者都审查了结果，并批准了手稿的最终版本。

补充材料

补充数据：

致谢

我们感谢Ehsan Amin、Doreen M.Floss、Alexander Lang、Ilse Meyer、Jens M.Moll、Boris Görg、Kazem Nouri、Claudia Rupprecht、Madhurendra Singh和Si-Cai Zhang提供的有益建议和启发性讨论。

*这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft通过974合作研究中心（SFB 974）“肝损伤和再生过程中的沟通和系统相关性”的支持。作者声明，他们与本文内容没有利益冲突。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文包含补充表S1和图S1–S4.

2使用的缩写如下：

HSC公司
肝星状细胞
aa公司
氨基酸
CTGF公司
结缔组织生长因子
RAS系统
大鼠肉瘤
电子逆向拍卖
胚胎干细胞表达的RAS
EYFP公司
增强型YFP
FOXO1系列
叉头状转录因子
间隙
GTPase激活蛋白
GFAP公司
胶质纤维酸性蛋白
人力资源管理系统
哈维鼠肉瘤
KRAS公司
Kirsten大鼠肉瘤
基质金属蛋白酶
基质金属蛋白酶
MRAS公司
肌肉RAS
mSIN1型
哺乳动物应激激活的MAPK相互作用蛋白1
mTORC公司
雷帕霉素的哺乳动物靶点
国家可再生能源管理局
神经母细胞瘤
PDK1系列
3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶
可编程逻辑控制器
磷脂酶C
PPARγ
过氧化物酶体增殖激活受体-γ
RBD公司
RAS-绑定域
无线电高度表
RAS关联域
RAL公司
类似RAS
RALGDS公司
鸟嘌呤核苷酸离解刺激物
RAP2型
RAS相关蛋白2
RASSF5系统
RAS关联域家族
RRAS公司
相关RAS病毒
萨特B1
特异性富AT-结合蛋白1
SREBP公司
固醇调节元件结合蛋白
TSC公司
结节性硬化
YAP公司
Yes相关蛋白
定量PCR
定量PCR
5-AZA公司
5-氮杂-2′-脱氧胞苷
LIF公司
白血病抑制因子
微小RNA
微小RNA
d日
白天
第页-
磷酸化。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会