内脏。作者手稿；2017年10月1日在PMC上提供。
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PMCID公司：PMC4848165型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院780229
肝星状细胞基因表达特征与丙型肝炎肝硬化和肝癌根治术后预后相关
,1 ,2,三 ,1,4 ,1 ,1 ,1 ,5 ,5 ,5 ,6 ,6 ,1,2 ,1,2,7,8 ,1,2和1,2
大卫·Y·张
1纽约州纽约西奈山伊坎医学院肝病科医学系
尼古拉斯·古森
2纽约西奈山蒂施癌症研究所伊坎医学院肝癌项目
三瑞士日内瓦日内瓦大学医院胃肠病学和肝病科
郭金生
1纽约州纽约西奈山伊坎医学院肝病科医学系
4中国上海中商医院和复旦大学消化科
Civan Altunkaynak公司
1纽约州纽约西奈山伊坎医学院肝病科医学系
安吉洛·桑吉奥瓦尼
5意大利米兰大学米利亚瓦卡肝病研究中心和胃肠病基金会第一分部，意大利米兰大学CáGranda Ospedale Maggiore Policlinico
马西莫·伊瓦隆
5意大利米兰大学米利亚瓦卡肝病研究中心和胃肠病基金会第一分部，意大利米兰大学CáGranda Ospedale Maggiore Policlinico
马索莫-科伦坡
5意大利米兰大学米利亚瓦卡肝病研究中心和胃肠病基金会第一分部，意大利米兰大学CáGranda Ospedale Maggiore Policlinico
奥古斯托·维拉努埃瓦
1纽约州纽约西奈山伊坎医学院肝病科医学系
2纽约西奈山蒂施癌症研究所伊坎医学院肝癌项目
Josep M.Llove特
1纽约州纽约西奈山伊坎医学院肝病科医学系
2纽约西奈山蒂施癌症研究所伊坎医学院肝癌项目
7肝癌转化研究实验室，巴塞罗那临床肝癌（BCLC）集团，巴塞罗那Clínic医院肝脏科，IDIBAS，西班牙巴塞罗那大学健康与消化研究中心（CIBERehd）
8西班牙巴塞罗那加泰罗尼亚研究所
宇津浩士达（Yujin Hoshida）
1纽约州西奈山伊坎医学院肝病科医学系
2纽约西奈山蒂施癌症研究所伊坎医学院肝癌项目
斯科特·弗里德曼
1纽约州纽约西奈山伊坎医学院肝病科医学系
2纽约西奈山蒂施癌症研究所伊坎医学院肝癌项目
1纽约州纽约西奈山伊坎医学院肝病科医学系
2纽约西奈山蒂施癌症研究所伊坎医学院肝癌项目
三瑞士日内瓦日内瓦大学医院胃肠病和肝病科
4中国上海中商医院和复旦大学消化科
5意大利米兰大学米利亚瓦卡肝病研究中心和胃肠病基金会第一分部，意大利米兰大学CáGranda Ospedale Maggiore Policlinico
6东京Toranomon医院
7巴塞罗那临床肝癌（BCLC）小组肝癌转化研究实验室，巴塞罗那Clinic Barcelona医院肝脏科，IDIBAPS，Centro de Investigaciones en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas（CIBERehd）西班牙巴塞罗那大学
8西班牙巴塞罗那Catalana de Recerca i Estudis Avançats研究所
通讯作者：Scott L.Friedman医学博士，伊坎西奈山医学院肝病科，1425 Madison Ave，Box 1123，New York，NY 10029，ude.msms@namdierf.ttocs，传真212-849-2574 - 补充资料
补充信息。
GUID:375D85B1-85B5-487D-9ED3-86CBD00D7804
摘要
目的
我们使用信息学方法鉴定和验证肝星状细胞特有表达的基因，并评估其在肝硬化中表达的预后能力。
设计
我们通过比较肝星状细胞、免疫细胞和肝转录组的特征来定义肝星状上皮细胞的基因特征。然后，我们结合肝星状细胞特征表达和临床变量，以总生存率作为主要临床结果，创建了一个预后指数。该特征来自于丙型肝炎相关早期肝硬化的回顾性队列（预后指数衍生集），并在切除后肝癌患者的独立回顾性队列中得到验证（n=82，预后指数验证集）。然后，我们检查了肝星状细胞特征表达与失代偿、肝细胞癌（HCC）发病率和Child-Pugh分级进展之间的相关性，作为预后指数衍生数据集中的附加结果，以及作为验证数据集中附加结果的HCC复发。我们在回顾性队列丙型肝炎肝硬化患者中测试了肝星状细胞特征性表达是否预测死亡、失代偿、Child-Pugh分级进展和HCC发病率。在预后指数衍生队列中（n=216），66人（31%）死亡，71人（34%）发生肝失代偿，66人发生Child-Pugh分级进展，65人（30%）发生肝细胞癌。在预后指数验证队列中（n=82），32人（39%）死亡，65人（79%）肿瘤复发。
结果
122-基因肝星状细胞特征由编码细胞外基质蛋白和发育因子的基因组成，并与人类、小鼠和大鼠数据集中的纤维化程度相关。肝星状细胞特征包含几个先前确定为星状细胞特异性的细胞表面基因，以及PCDH7，一种新的原钙粘蛋白星状细胞表面标记物。重要的是，通过添加肝星状细胞特征（c指数：0.70，95%CI:0.62-0.78），临床预后变量与总生存率的相关性得到了改善；我们使用这些结果来定义推导集中的预后指标。在验证集中，相同的预后指数与总生存率相关（c指数：0.62，95%置信区间：0.51–0.72）。对于其他检查的临床结果，预后指数与衍生数据集中失代偿（c指数：0.62，95%CI:0.55-0.69）、HCC（c指数0.63，95%CI=0.56-0.71）、Child-Pugh分级进展（c指数0.70，95%CI:0.63-0.78）以及验证数据集中HCC复发（c指数0.54，95%CI:0.46-0.62）相关。
结论
这项工作突出了星状细胞独特的转录生态位，并确定了潜在的星状细胞靶点，用于跟踪、靶向和分离。肝星状细胞特征性表达可鉴别HCV肝硬化或肝癌切除后预后不良的患者。
关键词：肝硬化，肝失代偿，基因集富集分析，肝细胞癌，转录组
简介
慢性肝损伤患者肝纤维化的特征是细胞外基质的进行性沉积。在肝纤维化患者中，有很大一部分患者会发展为肝硬化，最终会丧失肝功能，并增加肝癌的风险。[1,2]肝星状细胞是肝纤维化的主要细胞介质，通过其转分化或活化，从周细胞的维生素a储存细胞转变为收缩的基质生成肌成纤维细胞，以应对肝损伤和炎症[三,4]在许多实验模型中，这种反应的特异性消除已被证实是一种抗纤维化治疗。[5]鉴于其在纤维化和肝硬化中的核心作用，识别特异性肝星状细胞标记物作为非侵入性诊断标记物可大大促进肝病患者抗纤维化治疗的临床前和临床发展。
越来越多的基因表达数据集可以帮助识别跨多种组织和阵列格式的独特或差异表达基因，特别是在肝脏中。[6]在纤维化和肝病领域，正在使用越来越复杂的基因组方法；这些研究结合了多种数据来源来确定肝细胞癌生物标记物[7]探索胶原蛋白沉积的调节器[8]将肝细胞癌分为不同的亚类[9]并建立预后基因表达特征。[10,11]
一些基因组方法也被用于阐明星状细胞生物学。减法克隆[12]和微阵列[13]已确定肝星状细胞激活和失活后差异表达的转录物[14,15]例如。虽然这些研究为星形细胞表达变化对损伤和退化的反应提供了有价值的见解，但没有研究将星形细胞基因表达与肝脏中其他细胞类型的基因表达谱或不同器官中纤维化组织之间的基因表达图谱进行比较。
为了识别新的星状细胞表面或预后标记物，我们利用细胞和组织表达谱的快速扩展可用性来识别星状细胞中特异表达的转录物。我们已经在患者和动物模型中生成了一个与进展性肝病相关的肝星状细胞基因表达特征，并利用该特征识别了新的星状细胞的细胞表面标记物。重要的是，这种表达特征与慢性肝病患者的预后相关，进一步验证了肝星状细胞特征和肝星状上皮细胞在慢性肝病中的作用。我们还利用这个特征来确定肝、肾和肺纤维化之间哪些组织表达谱相似。我们预计星状细胞基因特征将为未来的星状细胞靶向和分离提供信息。此外，这种特征应该有助于生物标记物的开发，增强我们评估纤维化阶段和治疗反应的能力。
实验程序
肝星状细胞特征的鉴定
为了确定星状细胞基因表达特征，从先前发表的工作中获得了98个平台匹配的转录组数据集，涵盖17种肝细胞和组织类型[13]和国家生物技术信息中心基因表达总站（GEO）(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) (表S1，图S1). 使用稳健多阵列平均算法获得原始扫描数据并将其转换为标准化数据[16]和分位数标准化，在GenePattern基因组分析工具包中实现(www.broadinstitute.org/genepattern/)[17]ExpressionFileCreator模块。将对应于一个基因的多个探针折叠成中值，随后用NCBI Entrez基因数据库提供的官方基因符号进行标记。如果基因在静止或活化的星状细胞中的中位数表达至少是所有其他细胞和组织类型中最高表达的两倍，则这些基因包含在肝星状细胞特征中。基于NCBI同源基因数据库（第68版），将小鼠和大鼠基因定位到直向同源人类基因，并将没有已知人类同源关系的大鼠和小鼠基因排除在后续分析之外。使用GenePattern HierarchicalClustering模块对发现集执行无监督层次聚类（Pearson相关，平均链接方法）。验证数据集由一系列物种和平台的微阵列生成，也从GEO数据库中获得。每项研究的预归一化基因表达测量用于分析总结图S1.
研究人群
在两组早期肝硬化和轻度肝共病患者中，研究了肝星状细胞特征表达与总生存率（主要临床结果）的关系：一组HCV相关的早期（Child-Pugh a级）肝硬化患者的回顾性队列[10]（预后指数衍生集[11]（预测指标验证集）。对于预后指数衍生数据集，如果患者被诊断为组织学确诊的肝硬化，则将其纳入研究范围，但如果患者有肝失代偿史、肝癌史或死亡史，则将他们排除在外。对于预后指数验证集，如果患者在1990年至2001年间接受原发性肝细胞癌手术治疗，则将其纳入研究范围，但如果没有结果数据，或者没有福尔马林固定、石蜡包埋肿瘤和邻近组织可用，则将患者排除在外。有关患者登记、诊断、随访和治疗方案的更多详细信息，请参阅各自的出版物。
在发现集中评估了星状细胞特征与肝失代偿发展（静脉曲张出血、腹水、肝性脑病、肝肾综合征和感染）、Child-Pugh分级进展和HCC发展的相关性，并在验证集中评估了与HCC复发的相关性。在验证集中，复发性HCC肿瘤被证实与切除的原发性肝癌肿瘤具有克隆独立性：该队列中预后不良的原因是潜在的肝硬化，而不是切除原发性肿瘤的播散或转移。
生存分析
对于每名患者，通过基于Kolmogorov-Smirnov（KS）统计的基因集富集分数来测量肝星状细胞特征的相对过表达，并根据75分将每个队列中的患者分为肝星状上皮细胞特征阳性和阴性组第个百分位截止值。通过Kaplan-Meier曲线、log-rank检验、单变量Cox回归模型和多变量Cox模型评估各组与临床结果的相关性。评估是否将星状标志添加到基线临床数据中（胆红素大于1mg/dL，血小板计数小于100000/mm三)改进了Cox回归模型的判别和总体拟合，我们计算了每个模型的Harrell c统计量（模型预测能力的度量范围为0.5到1），并用似然比检验对两个嵌套模型进行了比较（通过添加额外变量来评估模型的整体拟合度是否显著提高）。对每位患者的MELD和FIB4评分进行近似，并使用多变量Cox回归模型测试其与结果的相关性。对于FIB4评分计算，AST水平不可用，因此用ALT代替AST。此外，对于MELD评分计算，INR不可用，假设所有患者的INR为1。所有数据分析均使用R统计语言进行(网址：www.r-project.org)和基因模式。
预后指数
基于我们先前生成的HCV队列（发现队列）总体生存率的多元Cox回归模型，我们通过将多变量Cox回归模式中的回归系数加权的变量线性组合到预后指数衍生集中，从而制定了一个预后指数。衍生数据集中指数的三分位值用作截断值，将患者分为高、中、低风险组。该预测模型在发现队列中进行了测试，并在HCC队列（验证队列）中用相同的定义和截止值进行了验证。为了评估肝星状细胞特征是否改善了临床预后的预测，我们将仅使用胆红素和血小板计数的预测模型的c统计改善和95%置信区间与使用胆红素酶、血小板计数和肝星形细胞特征表达的预测模型进行了比较。c统计量大于0.7将被视为临床实用性的下限。
细胞培养
Hep3B、Huh7、LX2、Hep1-6、TSEC和JS1细胞在37°C和5%CO下培养2在Dulbecco改良的Eagle培养基（高糖，无丙酮酸钠）（Invitrogen）中添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素。
定量逆转录聚合酶链反应
使用RNEasy迷你试剂盒（Qiagen）从粘附细胞系中提取RNA。等摩尔浓度的RNA被转换为cDNA（Clontech Cat.639549）。在Roche Lightcycle 480平台上，通过SYBR green qPCR评估拷贝数。使用5′-TTGGGGAGCAGGACAAC-3′正向和5′-CTCTGGATGACCCTGATG-3′反向引物检测人PCDH7的表达，得到154个碱基对扩增产物。用5′-TCCACTCCCAGAGGACAACACT-3′正向和5′-GGCTGTCTCTCTCTTCCTCTCTC-3′反向引物检测小鼠PCDH7的表达，得到198个碱基对扩增产物。
免疫荧光染色
用10%CCl处理6周的小鼠制备冷冻肝组织切片4（每周腹腔注射三次）。切片用冰镇丙酮固定5分钟，用0.2%Triton X-100在PBS中渗透15分钟，用PBS冲洗三次，用1:20稀释的正常山羊血清或5%BSA/PBS封闭30分钟。在4°C的温度下，用PCDH7的原代小鼠单克隆抗体或Desmin的兔单克隆抗体（abcam®，Cambridge，MA）进行过夜染色。使用Alexa Fluor®488结合的山羊抗兔IgG、e或Alexa Fluor®647结合的山羊抗体进行一级抗体检测。使用带有DAPI（Invitrogen）的ProLong®Gold防褪色试剂安装载玻片，并使用蔡司Axiopot显微镜（蔡司公司）进行检查。
结果
肝星状细胞特征的研究进展
为了确定星状细胞中高度特异表达的基因，从肝星状细胞谱中减去代表所有肝细胞亚群的表达谱。这些数据集来源于一系列基于小鼠的转录组分析研究，这是由于分离肝细胞类型数据集的广泛可用性。包括整个肝脏、肝细胞和胎儿肝脏的特征，以及典型的上皮细胞、内皮细胞、髓细胞和红细胞谱系(和表S1). 在全球转录组空间中，样本根据细胞类型聚集在一起，而不是研究或数据集，支持针对每种肝细胞类型的强大转录程序的存在(). 共有122个基因被鉴定为在星状细胞中高度和唯一表达(). 正如预期的那样，一些典型的肝星状细胞标记物在星状细胞样本中高度表达，但由于在其他细胞或组织类型中同时表达，因此被排除在肝星形细胞特征之外(图S2). 122-基因肝星状细胞特征高度丰富，具有细胞外基质重塑和相关分子通路(图S3和表S2).
星状细胞中独特富集基因的鉴定（A） 研究设计总结。（B） 检查的所有基因在所有组织和细胞类型中的表达。在层次聚类中，样本按相似性排序，热图上方的树状图说明了相似程度。每种细胞和组织类型都存在高表达基因，但不同细胞和组织类型之间存在相当大的表达重叠。（C） 肝星状细胞特征中的基因表达。只有在星状细胞中唯一且高度表达的基因才包含在签名中。在一个丙型肝炎队列中证实星状标志的富集[32]比较正常和肝硬化患者（D），NAFLD队列[33]比较纤维化和非纤维化患者（E），以及相同的NAFLD队列，比较炎症和非炎症患者（F）。在每个队列中，星状标记的表达与疾病表型密切相关。在（D–F）中，对每个患者样本的肝星状细胞特征表达进行评估，并使用平均Kolmogorov-Smirnov统计值分配一个数值。显示了每个患者组的平均星状细胞富集分数，并绘制了平均值的+/-标准误差。Welch的t检验用于计算报告的p值。在（G-I）中，我们展示了对每个患者数据集中的星状特征进行的基因集富集分析。阵列基因从健康肝脏（左侧）的最高排序到患病肝脏（右侧）的最高。垂直的黑色条表示每个基因在星状标记中的位置。包括归一化富集分数（NES）和统计显著性
人和动物肝纤维化模型中肝星状细胞特征的上调
为了验证星状细胞基因表达特征与肝硬化相关表型的相关性，我们在10个不同的数据集中测试了肝星状细胞特征的富集，这些数据集代表了人类、小鼠和大鼠的各种肝病病因(表S3). 与健康正常肝脏相比，两种人肝硬化肝脏均显著诱导肝星状细胞特征性表达(); 与非纤维化NAFLD肝脏相比(). 肝星状细胞特征也与NAFLD患者的肝脏炎症显著相关(). 在所检查的每个人类数据集中，与正常人群相比，患病人群的肝星状细胞特征富集明显更高(). 我们检查了每个基因集富集分析前沿中的基因本体富集，并列出了10个最具统计意义的网络(图S3). 同样的前沿基因也接受了Ingenuity途径分析，其中排名最高的相互作用网络显示为图S4–S6这些网络表明许多典型的星状细胞因子，包括TGF-β、PDGFRA、PDGFRB、IL-1、FAK、胶原蛋白和MMPs，在肝星状细胞特征基因的调节中起着中心作用。我们特别感兴趣的是通过NOTCH、FAK、TGF-β和PDGF信号调节TAGLN，这可能是促纤维化信号的一种新的最终共同途径。此外，TNXB和ADAMTS2对胶原表达的调节突出表明它们可能是抗纤维化治疗的靶点。
PCDH7是一种新的肝星状细胞表面标志物
我们探索了肝星状细胞特征中的基因是否编码新的星状细胞细胞表面标记物，这将使其作为候选治疗靶点特别有吸引力。为了确定星状细胞表达特征中的细胞表面转录物子集，我们将肝星状细胞特征与已知存在于细胞表面、质膜、细胞连接处或细胞外基质中的LOCATE和基因本体组相交(,表S4). 这种方法产生了几个以前被鉴定为星状细胞或肌成纤维细胞标记物的基因，包括DDR2[23]EDNRA、[24]EDNRB、[25]EREG公司[26]和IL1R1[27]此外，这种方法强调了PCDH7，一种原粘附素家族的成员[28]作为候选星状细胞表面标记。在肝星状细胞特征发现数据中，PCDH7在活化和静止的星状细胞中均高表达。它在活化的星状细胞中略有下降，但仍明显高于其他检查的细胞和组织类型(). 我们通过qRT-PCR比较了永生化星状细胞系（LX2，JS1）、窦状内皮细胞（TSEC）和肝细胞（HepG2，Hep3B，Huh7，Hep1-6）中PCDH7的绝对表达。与永生化肝细胞和窦内皮细胞相比，永生化星状细胞中PCDH7表达丰富(). 然后，我们通过免疫荧光对纤维化小鼠肝脏中PCDH7进行蛋白质表征，观察正弦染色，并用结蛋白定位().
PCDH7是一种候选的肝星状细胞表面标记物（A） 星状标记基因、细胞表面基因本体论和定位膜蛋白预测之间的重叠突出了潜在的细胞表面星状细胞标记。（B–C）在6个假定的细胞表面标记中，我们确认了PCDH7在我们的原始阵列数据（B）中的表达，并通过qRT-PCR在人类和小鼠细胞系（C）中表达。对于阵列数据，三个或更多样本的PCDH7表达式显示为+/-SEM。对于qRT-PCR结果，显示了绝对表达，黑色条表示三个重复之间的+/-SEM。P值来自平均值差异的未配对双尾t检验。（C–D）四氯化碳处理小鼠6周后，PCDH7（一种推测的星状细胞表面标记物）染色。结蛋白重叠良好，尤其是在纤维化间隔。
肝纤维化模型中的肝星状细胞基因特征
接下来，我们评估了小鼠和大鼠纤维化模型中星状细胞富集的程度。对于大多数验证集，患病组和对照组之间的平均浓缩分数差异很大，但由于样本数量较少，没有达到统计显著性(图S7). 然而，GSEA在小鼠胆管结扎、小鼠单侧输尿管梗阻、大鼠胆管结扎和大鼠二乙基亚硝胺模型中显示出高度显著的肝星状细胞特征富集(). 有趣的是，在肝星状细胞特征和肾单侧输尿管梗阻数据集之间观察到了强烈的相关性，而在肝星形细胞特征和肺博莱霉素数据集之间没有相关性；这表明肝纤维化在基因组上与肾纤维化的关系比与肺纤维化的关系更密切。
表1
肝星状细胞特征表达与临床或实验表型之间的关系（基因集富集分析）
| 有机体 | 数据集 | 比较的组 | NES公司* | 财务总监** | p值*** |
|---|
| 人类 | 非酒精性脂肪肝 | 有无炎症 | 1.49 | 0.071 | 0.009 |
| 重度与中度纤维化 | 1.97 | 0.002 | <0.001 |
| 肝硬化 | 肝硬化与正常 | 2.08 | <0.001 | <0.001 |
|
| 鼠标 | 四氯化碳（CCl4)注入 | CCl公司4与车辆相比 | 1.39 | 0.141 | 0.067 |
| 胆管结扎术 | BDL后28天与假手术 | 2.01 | <0.001 | <0.001 |
| 原发性硬化性胆管炎 | 胆酸与熊去氧胆酸饮食，Abcb4小鼠 | **** | **** | **** |
| 单侧尿道梗阻（UUO，肾脏） | 9天UUO与假手术 | 2.24 | <0.001 | <0.001 |
| 博莱霉素（肺） | 5周博莱霉素vs.载体 | **** | **** | **** |
|
| 老鼠 | 四氯化碳注射液 | 3天CCl4与车辆相比 | 0.33 | 0.305 | 0.135 |
| 胆管结扎术 | BDL后2周与假手术 | 2.39 | <0.001 | <0.001 |
| 二乙基亚硝胺（DEN） | 18周DEN与车辆 | 1.84 | <0.001 | <0.001 |
在两组肝硬化患者中，肝星状细胞特征性表达与患者预后相关
为了进一步验证肝星状细胞特征，我们探讨了肝癌切除患者肝硬化队列中肝星状上皮细胞特征表达与长期临床结局之间的关系[11]丙型肝炎感染肝硬化患者。[10]计算切除的肝细胞癌的肝星状细胞特征表达()和丙型肝炎()患者队列。患者按肝星状细胞特征表达排序()在结果分析中，前四分之一被视为一个单独的组。在切除的肝细胞癌队列中，肝星状细胞高表达的患者生存率显著降低，肿瘤复发率增加(). 在丙型肝炎肝硬化队列中，肝星状细胞高表达患者的肝脏相关预后明显较差，如Child-Pugh分级进展和肝失代偿，生存率也降低(). 在丙型肝炎队列中，进展为HCC没有显著差异().
星状细胞特征表达与临床结果的相关性（A–B）丙型肝炎（A）和切除的HCC（B）肝硬化队列中患者星状标志物表达的热图，按浓缩分数排序（数据集来自[10]和[11]分别）。每列为一名患者，每行为一个星状细胞特征基因。垂直虚线将在随后的面板中分析的两组患者分开。（C–D）每位患者的恒星特征富集分数。25%的肝星状细胞特征富集程度最高的患者用虚线分隔，并作为一个单独的组分析（E–J）中的不良结果。红色生存曲线表示25%的患者具有最高的星状细胞特征富集，蓝色生存曲线表示75%的患者具有较低的星状淋巴细胞特征富集。对于丙型肝炎队列，显示了存活率（E）、Child-Pugh分级进展（F）、失代偿（G）和HCC发病率（H）。对于切除的HCC队列，显示了生存率（I）和HCC复发率（J）。肝星状细胞高表达的患者生存率显著降低，Child-Pugh分级进展增加，失代偿增加。
对于丙型肝炎肝硬化队列，高胆红素（>1.0mg/dl）和低血小板计数（<100000/mm）之间的相关性三)，患者结局已在前面描述过。[10]为了排除肝星状细胞特征性表达替代这些临床特征的可能性，我们进行了多变量Cox回归以评估每个因素的独立贡献。对于Child-Pugh分级的总体生存和进展，高肝星状细胞特征表达与预后独立相关(). 我们还研究了预后与白蛋白、FIB4评分和MELD评分之间的关系。尽管MELD和白蛋白水平的单变量分析与指数衍生队列中的生存率相关，但在多变量Cox回归中，只有胆红素、血小板计数和肝星状细胞特征表达与生存率显著相关(表S5). 这很可能是因为我们的预后指数衍生数据集中的所有患者都患有早期疾病，临床变量变化有限——大多数临床变量都在正常参考范围内。将肝星状细胞特征和临床数据结合使用，可改善预后指数衍生集中的预后模型拟合和判别（死亡p=0.0015，Child-Pugh分级进展p=0.0043，参见表S6). 尽管在单变量分析中显著相关，但临床变量和肝星状细胞标志物并不能独立预测失代偿(). 在预后指数验证数据集中，多变量分析中，星形细胞特征与死亡率显著相关，尽管肝星状细胞特征与肝细胞癌的发展无关，与单变量结果一致(). 由于基因表达与患者预后之间的关系之前已在这些相同的数据集中公布，我们检查了我们的肝星状细胞特征与之前公布的预后特征之间的重叠。在先前公布的186基因预后特征和122基因肝星状细胞特征之间只有三个基因重叠，这表明正在检测的基因组有很大不同(图S8).
表2
预后指数衍生数据集中肝星状细胞特征与临床结果的相关性（n=216，多变量Cox回归）
| 结果
|
|---|
| 儿童进步* | 取消补偿** | 死亡 | 肝癌 |
|---|
胆红素
（>1.0 mg/dL） | | | | |
| 危险比 | 2.54 | 1.62 | 2.24 | 2.03 |
| HR，95%置信区间 | [1.46 – 4.44] | [0.99 – 2.67] | [1.3 – 3.87] | [1.18 – 3.48] |
| p值 | 0.001 | 0.06 | 0.004 | 0.01 |
|
血小板计数
（<100000/mm三) | | | | |
| 危险比 | 2.26 | 1.47 | 2.69 | 1.56 |
| HR，95%置信区间 | [1.32 – 3.89] | [0.90 – 2.4] | [1.52 – 4.75] | [0.91 – 2.69] |
| p值 | 0.003 | 0.12 | 0.0006 | 0.11 |
|
星形签名
（>75个百分点） | | | | |
| 危险比 | 2.16 | 1.60 | 2.34 | 1.10 |
| HR，95%置信区间 | [1.30 – 3.60] | [0.97 – 2.64] | [1.41 – 3.88] | [0.62 – 1.94] |
| p值 | 0.003 | 0.07 | <0.001 | 0.75 |
预后指数
考虑到星状细胞特征与预后的相关性，我们制定了一个结合胆红素、血小板计数和肝星状细胞标记表达的预后指数。在预后指数衍生集（n=216）中，88名受试者（n=41%）被归类为低风险，103名（48%）被分类为中等风险，25名（12%）被归类于高风险。高危组总生存期较短（HR 8.00，p<0.0001），失代偿频率较高（HR 2.9，p=0.0027），Child-Pugh分级进展较快（HR 6.5，p<00001）。在该队列中，与HCC发展的相关性不显著（HR=2.2，p=0.068）(,). 添加肝星状细胞特征后，总体存活率的模型c统计值（和95%置信区间）从0.66（0.59–0.74）提高到0.70（0.62–0.78），失代偿期的模型c统计量从0.61（0.54–0.68）提高到0.62（0.55–0.69），Child-Pugh分级的模型c统计学值从0.68（0.61–0.75）提高到了0.70。
由肝星状细胞特征表达、胆红素和血小板计数组成的预后指数与预后指数推导和验证集中的总生存率相关采用多变量Cox回归将相对重量分配给血清胆红素（0.8082）、血小板计数（0.9896）和肝星状细胞特征表达（0.8516）。患者的预后指数较高，表现为血清胆红素升高、血小板计数降低或肝星状细胞特征表达增加。根据患者的预后指数，将患者分为三个风险组之一，并设置风险组截止值，使每个风险组中有三分之一的衍生队列。（A–C）预后指数衍生集的临床结果（n=216）。生存率、肝失代偿和Child-Pugh分级进展的风险组之间有明确的区分。（D） 预后指数验证集的生存率（n=82），与中、低风险组相比，高风险组的生存率有显著差异。给出了高风险组和低风险组之间差异的风险比、95%置信区间和p值。我们在中提供了额外的详细统计数据.
表3
| 队列 | 结果 | 风险组 | HR（95%置信区间） | p值 |
|---|
衍生队列：
丙型肝炎肝硬化（n=216） | 总体生存率
（n=66，31%） | 中级
高 | 3.40 (1.80–6.40)
8.00 (3.70–17.00) | <0.001
<0.001 |
儿童进步*
（n=66，31%） | 中级
高 | 2.40 (1.30–4.40)
6.5 (3.2–13) | 0.004
<0.001 |
取消补偿**
（n=71，34%） | 中级
高 | 1.6 (0.94–2.70)
2.9 (1.4–5.7) | 0.09
0.003 |
HCC的发展
（n=65，30%） | 中级
高 | 1.7 (0.98–3.0)
2.2 (0.94–4.9) | 0.06
0.07 |
|
验证队列：
手术治疗的肝癌（n=82） | 总体生存率
（n=32，39%） | 中级
高 | 1.2 (0.55–2.6)
3.9 (1.4–11) | 0.64
0.008 |
肝癌复发
（n=65，79%） | 中级
高 | 1.2 (0.72–2.1)
1.7 (0.76–3.7) | 0.45
0.20 |
在预后指标验证队列（n=82）中，42名受试者（51%）被归类为低风险，30名受试者（37%）被归类为中风险，10名受试者（12%）被归类为高风险，使用推导集中预定义的截止值。高危组总生存期较短（HR=3.9，p=0.0077），但与肝癌复发无关（HR=1.7，p=0.20）(,). 肝星状细胞特征表达的增加使模型c统计量（和95%置信区间）从死亡的0.58（0.48-0.68）提高到0.62（0.51-0.72），HCC复发的模型c统计量（和95%置信区间）从0.51（0.44-0.59）提高到0.54（0.46-0.62）。
讨论
我们使用生物信息学方法鉴定了一组由肝星状细胞特异表达的基因。此外，我们发现这些基因与星状细胞丰度和患者预后相关，并且包含编码星状细胞新的细胞表面标记的转录物。
发现集中肝星状细胞特征基因的选择策略产生了几种不同类型的基因。尽管肝星状细胞特征中的所有基因在星状细胞中高度富集，但有些基因在静止的星状细胞中远高于静止的星形细胞，其他基因在活化的星状上皮细胞中远高于静止和活化的星形上皮细胞。我们最初探索使用肝星状细胞特征的不同亚群来捕捉这种差异。我们期望激活的星状细胞基因组的基因表达与纤维化表型之间具有更高的相关性。相反，我们发现没有亚组与表型有实质性更强的相关性(表S7). 此外，签名中的几乎每个基因都富含几种疾病表型(表S8). 这些结果表明，我们在疾病表型中观察到的肝星状细胞特征富集是星状细胞数量增加的结果，而不是星状细胞活化的变化。这一点很重要，因为这意味着星状细胞增殖是肝纤维化的主要驱动因素。在确定细胞类型时，描述了星状细胞激活期间的肝星状细胞增殖[29,30,31]但星状细胞的活化和增殖很少被机械解耦联。相反，星状细胞数量通常是标准化的，以测量RNA和蛋白质表达的变化。除了限制星状细胞活化的治疗方法外，我们的数据表明，限制肝星状细胞增殖的策略值得大力考虑，作为潜在的抗纤维化治疗方法。
由于星状细胞占肝脏细胞体积的少数，因此在整个肝脏表达谱中很难检测到星状细胞基因表达的变化。通过检测星状细胞中唯一表达的基因（肝星状细胞特征中的基因），可以追踪整个肝脏样本中的星状细胞基因。这使我们能够快速评估任何小鼠、大鼠或人类肝脏样本中的星状细胞丰度，前提是已经执行了微阵列或RNA-seq程序。这种方法对于描述新的肝损伤遗传或病因学模型特别有用。
尽管肝星状细胞特征可以独立预测患者的预后，但将其转化为临床测试还需要进一步发展。总生存率（主要结果）的预后指数c统计值为0.70，这是通常被认为具有临床意义的阈值。对肝活检的依赖性和122个基因表达的测量成本是采用的障碍，但并不妨碍其未来临床应用。尽管如此，我们主要将此分析视为对肝星状细胞特征的验证。此外，我们希望对签名中单个基因的研究将有助于我们揭示慢性肝病的基本病因。
为了便于临床实施，我们探讨了肝星状细胞特征的子集是否同样可以预测预后。我们发现较小的基因亚群（31到55个基因，而不是122个）与总生存率相似(表S9). 减少的55个基因特征是一个有希望的候选临床生物标志物，用于未来的研究评估。
在我们的分析中发现的新的细胞表面标记有几个潜在的应用。从实验的角度来看，分离纯星状细胞群一直是该领域的一个挑战。将这些标记物用于MACS或流式细胞术将产生更纯的分离星状细胞群体。此外，肝星状细胞特征中每个基因的启动子可能有助于驱动动物模型中的星状靶向基因缺失。从临床角度来看，新型星状细胞表面标记物可用于将药物靶向星状细胞。此外，肝星状细胞特征的分泌成员可能代表纤维化的替代血清标记物。
我们用于识别星状细胞表面标记的方法被证明是非常可靠的。在计算鉴定的六种细胞表面标记物中，有五种是先前描述的，我们鉴定了另一种新的标记物PCDH7，我们已经将其验证为星状细胞的特异性细胞表面标记物。PCDH7是一种跨膜原粘附素，其细胞外结构域上有七个钙粘蛋白重复序列。[28]尽管之前发表的关于PCDH7的研究很少，但原钙粘蛋白通常在信号转导和细胞间识别中发挥作用。这些特征使PCDH7成为一种有趣的分子，不仅因为其可靶向的细胞表面位置，而且可能是肝星状细胞纤维化的调节因子。
我们研究的另一个主要目的是寻求肝星状细胞特征与其他组织纤维化反应之间的相关性。具体来说，我们比较了小鼠肾纤维化组织（单侧尿道梗阻）和小鼠肺纤维化组织（博莱霉素）的特征。肾纤维化模型与肝星状细胞特征密切相关，而肺纤维化模型则不相关(). 这种相关性表明肝纤维化和肾纤维化之间的相似性比肺纤维化更大。这与我们对三个器官间纤维化发病机制的理解一致，因为肝和肾的纤维化生物学通过肾和肝周细胞（即星状细胞）的存在而更加相似，而肺中纤维化细胞的细胞来源则不太确定。这也与肺纤维化疾病的不同临床过程相一致，肺纤维化疾病通常比肝纤维化和肾纤维化更具侵袭性。
总之，我们的工作为公正地发现新的星状细胞基因建立了一个新的和临床相关的平台。这些基因与人类肝病的临床结果相关，并可能导致体内纤维化。这为系统地揭示新的纤维化生物学、确定候选药物靶点以及定义与疾病结局相关的新候选生物标记物创造了一个独特的机会。
总结
新发现是什么
我们系统地定义了高度和独特表达的星状细胞基因，并表明这些基因在人类和动物肝病模型中丰富。
肝星状细胞特征与肾纤维化表达变化有很强的相似性，但肝星形细胞特征与肺纤维化表达变化不同。
我们的方法已将PCDH7鉴定为星状细胞的一种新的细胞外标志物。PCDH7是星状细胞追踪、靶向和分离的候选标记物。
患者肝星状细胞特征基因的表达增加可以预测临床结果，包括失代偿、Child-Pugh分级进展和总生存率。与单独使用临床因素相比，将这些预测与临床因素相结合可以获得更准确的预测。
在可预见的未来，它会对临床实践产生什么影响？
肝星状细胞特征，单独或与常规临床测量相结合，可为改善肝硬化进展预测提供工具，指导抗肝硬化监测或干预。此外，肝星状细胞特征可作为临床试验中抗纤维化药物长期疗效的替代标记物。
致谢
基金
发送至SLF:NIH-DK056621、NIH-AA020709；致YH:NIH-DK099558、Irma T Hirschl Trust、Harold博士和Golden Lamport研究奖、伊坎医学院医学科学家培训项目：NIH-GM007280
参考文献列表
三。Hinz B、Phan SH、Thannickal VJ、Galli A、Bochaton-Piallat ML、Gabbiani G。肌成纤维细胞：一种功能，多种来源。《美国病理学杂志》。2007;170:1807–16. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Puche JE、Lee YA、Jiao J、Aloman C、Fiel MI、Munoz U等。耗竭肝星状细胞的新型小鼠模型揭示了其在小鼠肝脏损伤放大中的作用。肝病学。2013;57:339–50. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Tseng GC，Ghosh D，Feingold E.微阵列荟萃分析的综合文献综述和统计考虑。核酸研究。2012;40:3785–99. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Kim H，Kim K，Yu SJ，Jang ES，Yu J，Cho G，等。利用全球数据挖掘和多重反应监测筛选肝细胞癌的生物标记物的开发。公共科学图书馆一号。2013;8 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Blaauboer ME、Emson CL、Verschuren L、van Erk M、Turner SM、Everts V等。胶原蛋白动力学分析和转录谱分析的新组合揭示了纤维化相关基因和途径。基质生物学。2013;32:424–31.[公共医学][谷歌学者] 9Hoshida Y、Nijman SM、Kobayashi M、Chan JA、Brunet JP、Chiang DY等。整合转录组分析揭示了人类肝细胞癌的常见分子亚类。癌症研究。2009;69:7385–92. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Hoshida Y、Villanueva A、Sangiovanni A、Sole M、Hur C、Andersson KL等。丙型肝炎相关早期肝硬化患者的预后基因表达特征。胃肠病学。2013;144:1024–30. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Hoshida Y、Villanueva A、Kobayashi M、Peix J、Chiang DY、Camargo A等。肝细胞癌固定组织中的基因表达和预后。N英格兰医学杂志。2008;359:1995–2004. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Lalazar A，Wong L，Yamasaki G，Friedman SL。创伤愈合期间肝星状细胞中诱导的早期基因。基因。1997;195:235–43.[公共医学][谷歌学者] 13De Minicis S、Seki E、Uchinami H、Kluwe J、Zhang Y、Brenner DA等。肝星状细胞在培养和体内激活过程中的基因表达谱。胃肠病学。2007;132:1937–46.[公共医学][谷歌学者] 14Troeger JS、Mederacke I、Gwak GY、Dapito DH、Mu X、Hsu CC等。小鼠肝纤维化消退过程中肝星状细胞的失活。胃肠病学。2012;143：1073–83，e22。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Kisseleva T，Brenner DA。肝纤维化消退过程中肌成纤维细胞的失活。细胞周期。2013;12:381–2. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Irizarry RA、Hobbs B、Collin F、Beazer-Barclay YD、Antonellis KJ、Scherf U等。高密度寡核苷酸阵列探针水平数据的探索、归一化和总结。生物统计学。2003;4:249–64.[公共医学][谷歌学者] 17.Reich M、Liefeld T、Gould J、Lerner J、Tamayo P、Mesirov JP。基因模式2.0。自然遗传学。2006;38:500–1.[公共医学][谷歌学者] 18Sprenger J、Lynn Fink J、Karunaatne S、Hanson K、Hamilton NA、Teasdale RD LOCATE：哺乳动物蛋白质亚细胞定位数据库。核酸研究。2008;36：D230–3。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19.Huang DW、Sherman BT、Lempicki RA。利用DAVID生物信息学资源对大基因列表进行系统和综合分析。自然协议。2009;4:44–57.[公共医学][谷歌学者] 20Huang DW、Sherman BT、Lempicki RA。生物信息学富集工具：大型基因列表综合功能分析的途径。核酸研究。2009;37:1–13. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Subramanian A、Tamayo P、Mootha VK、Mukherjee S、Ebert BL、Gillette MA等。基因集富集分析：解释全基因组表达谱的基于知识的方法。美国国家科学院。2005;102:15545–50. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Mootha VK、Lindgren CM、Eriksson KF、Subramanian A、Sihag S、Lehar J等。参与氧化磷酸化的PGC-1α反应基因在人类糖尿病中协同下调。自然遗传学。2003;34:267–73.[公共医学][谷歌学者] 23Ankoma-Sey V、Matli M、Chang KB、Lalazar A、Donner DB、Wong L等。大鼠肝创伤愈合过程中间充质细胞类型中VEGF受体的协同诱导。癌基因。1998;17:115–21.[公共医学][谷歌学者] 24Yokomori H、Oda M、Ogi M、Kamegaya Y、Tsukada N、Nakamura M等。肝硬化大鼠肝脏内皮素受体亚型表达增强。肝脏。2001;21:114–22.[公共医学][谷歌学者] 25Yokomori H、Oda M、Yasogawa Y、Nishi Y、Ogi M、Takahashi M等。人肝硬化中内皮素B受体在蛋白质和基因水平上的表达增强。《美国病理学杂志》。2001;159:1353–62. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Inatomi O、Andoh A、Yagi Y、Bamba S、Tsujikawa T、Fujiyama Y。人类结肠上皮下肌成纤维细胞中角调节蛋白和表调节蛋白表达的调节。国际分子医学杂志。2006;18:497–503.[公共医学][谷歌学者] 27Gieling RG、Wallace K、Han YP。白细胞介素-1参与从肝损伤到纤维化的进展。美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2009;296：G1324–31。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Yoshida K、Yoshitomo-Nakagawa K、Seki N、Sasaki M、Sugano S。钙粘蛋白超家族新成员BH-protocadherin（PCDH7）的克隆、表达分析和染色体定位。基因组学。1998;49:458–61.[公共医学][谷歌学者] 29Friedman SL，Arthur MJ。库普弗细胞条件培养基激活培养的大鼠肝脂肪细胞。通过诱导血小板衍生生长因子受体直接增强基质合成和刺激细胞增殖。临床投资杂志。1989;84:1780–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30.Gressner AM。与脂肪储存细胞激活有关的细胞因子和细胞串扰。肝素杂志。1995;22:28–36.[公共医学][谷歌学者] 31Kinnman N、Goria O、Wendum D、Gendron MC、Rey C、Poupon R等。肝星状细胞增殖是大鼠胆汁淤积性肝损伤中血小板衍生生长因子介导的早期细胞事件。实验室投资。2001;81:1709–16.[公共医学][谷歌学者] 32Wurmbach E，Chen YB，Khitrov G，Zhang W，Roayaie S，Schwartz M，等。丙型肝炎病毒诱导的异型增生和肝细胞癌的全基因组分子谱。肝病学。2007;45:938–47.[公共医学][谷歌学者] 33Mellentin JD、Murre C、Donlon TA、McCaw PS、Smith SD、Carroll AJ等。增强子结合蛋白E12/E47的基因位于急性白血病的t（1；19）断点。科学。1989;246:379–82.[公共医学][谷歌学者] 
