依达拉奉对手术和脂多糖致成年大鼠认知功能损害的保护作用

摘要

1.简介

术后认知功能障碍（POCD）是指患者术后不同程度的认知功能下降。它涵盖了广泛的认知功能，包括工作记忆、长期记忆、信息处理、注意力和认知灵活性[1,2]. POCD对生活质量、社会依赖性和死亡率产生不利影响[三]. 氧化应激、手术、全身麻醉/麻醉剂和神经炎症被认为会增加POCD的风险[4–6].

某些组织会因氧化应激而受损，尤其是在手术期间[7]. 自由基清除剂依达拉奉可以跨越血脑屏障，有效清除大脑中的自由基[8]. 证据表明氧化因子对认知功能有害[9–10]. 然而，依达拉奉可以改善胆碱能系统，保护神经元免受氧化毒性，缓解阿尔茨海默病的疾病类型和认知缺陷[11,12]. 其他研究表明，依达拉奉抑制了脑梗死和缺血的进展[13,14]. 最重要的是，依达拉奉对POCD发展的影响已在接受颈动脉内膜切除术的患者中得到证实[15]简而言之，以前的研究表明，依达拉奉可能通过清除自由基改善术后患者的认知功能障碍。

脂多糖（LPS）是一种主要的细菌TLR4配体，可激活感染的免疫反应[16]. 最近的报道表明，手术加脂多糖治疗会导致成年大鼠更严重的神经退行性变[17]; 氧自由基和炎症因子之间的相互作用会加剧术后认知功能障碍[18,19].它们都会破坏细胞膜功能，破坏体内平衡，导致氧化磷酸化混乱[20]. Akt/mTOR信号通路的正常激活是磷酸化[21]. 随后还观察到活化的小胶质细胞增多，Akt/mTOR信号通路的激活受到抑制，最终导致学习和记忆能力下降[22,23]. 此外，mTOR参与调节突触可塑性，从而影响记忆和认知功能[24,25]. 根据之前的报告，我们假设在与LPS给药相关的大鼠手术模型中，依达拉奉可能通过减轻氧化毒性、抑制小胶质细胞活化和维持Akt/mTOR信号通路激活的正常功能来改善POCD。本研究的结果可能为依达拉奉在POCD治疗中的潜在作用及其作用机制提供新的见解。

2.材料和方法

2.2手术程序

在连续5天接受Morris Water Maze（MWM）测试和恐惧调节训练后，S-P组和S-E组的动物接受了100μg/kg i.P.的LPS给药（Sigma，St.Louis，MO，USA）。LPS的剂量是根据以前的报告确定的[17]. 1小时后，LPS治疗组在戊巴比妥钠麻醉（1%和40 mg/kg）下进行左肾切除术(图1A). 在大鼠无法触及伤口的背部做一个纵向切口，以避免自闭性咬伤。我们认为该手术模型模拟了亚临床感染患者的标准化器官切除[8]. 手术期间，大鼠的体温保持在36.5°C至37.5°C。所有大鼠皮下注射50μl 0.2%罗哌卡因用于术后镇痛。让大鼠在37°C的培养箱中恢复，然后返回笼子。随后，C-P组和S-P组接受生理盐水（i.P.）治疗，而C-E组和S-E组分别在术后第3天和第7天每天接受依达拉奉治疗(图1B). 每只大鼠在手术后每天称重，所有大鼠在数天内体重增加。我们在手术后第1、2、3、5、7天对大鼠的伤口进行消毒。然后在术后第3天和第7天分别用致死剂量的戊巴比妥钠腹腔注射处死动物，立即取出每组5只大鼠的大脑，用4%多聚甲醛固定48小时，进行组织学分析。快速解剖、移除其他大鼠的海马和前额叶皮层，并将其储存在-80°C下，直至分析。

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图1

实验方案的示意图以及LPS和依达拉奉给药的时间表。

（A） 实验方案的示意图大纲。（B） LPS和依达拉奉给药时间表。MWM，莫里斯水迷宫；FCS，恐惧调节测试；C-P，假手术加安慰剂；C-E，假手术加依达拉奉；S-P，手术加安慰剂；S-E，手术加依达拉奉。

3.结果

3.1依达拉奉减轻单侧肾切除术加LPS给药引起的学习记忆障碍

先前的研究表明，肾切除加注射LPS可能导致POCD[17]. 因此，在此模型中检验了依达拉奉对POCD的保护作用。如所示图2A在MWM测试中，与第一次训练相比，所有组在最后一次训练期间的逃避潜伏期都显著缩短(第页<0.001），但各组之间没有观察到差异，这表明所有动物都能够学习平台的位置。术后第3天，与其他组相比，S-P组第一次MWM探头试验中靶象限的井时间显著缩短(第页<0.05），交叉次数也呈下降趋势，尽管没有达到显著性(图2B和2C). 在工作记忆测试中，到达新平台所需的逃避潜伏期明显增加(第页<0.05），与C-P和S-E组相比(图2D). 在探针测试期间，两组之间的游泳速度没有显著差异，这表明S-P组表现较差并不是运动能力降低的结果(图2E). 术后第7天，尽管S-P组大鼠在目标象限的停留时间呈下降趋势，逃避潜伏期呈增加趋势，但S-P组与其他组在目标象限体的停留时间、穿越次数或逃避潜伏期方面没有统计学差异。

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图2

依达拉奉降低大鼠单侧肾切除加LPS治疗后的行为表现（A） MWM中的空间学习。迷宫中五次训练的平均逃避潜伏期如下所示。（B） 术后第3天第一次MWM探头试验中目标象限的停留时间。（C） 术后第3天的交叉次数。（D） 术后第3天MWM逆转试验期间的平均逃避潜伏期。（E） 第一次MWM探针试验中的平均游泳速度（m/s）**P（P）与训练后第一天相比<0.01*P（P）与C-P组相比<0.05#P（P）与S-P组相比<0.05。C-P，假手术加安慰剂；C-E，假手术加依达拉奉；S-P，手术加安慰剂；S-E，手术加依达拉奉。

在恐惧条件反射测试中，在一个新的环境中评估了海马依赖性记忆，并且在术后第3天与C-P组相比，S-P组表现出高度显著的损伤(第页<0.01）和7(第页<0.05) (图3A和3B). 与C-P组相比，S-P组的冷冻时间显著缩短(第页< 0.01). 这种下降在S-E组中明显逆转(第页<0.05/0.01），表明依达拉奉对POCD的发展具有保护作用。在术后第3天进行张力相关恐惧条件反射测试（海马独立记忆）期间，如图3C与C-P组相比，S-P组的冷冻时间百分比显著降低(第页< 0.05); 依达拉奉显著阻止了这种下降(第页< 0.05). 术后第7天，各组对紧张的冷冻反应没有显著差异(图3D).

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图3

手术后恐惧条件测试中的认知障碍（A） 术后第3天进行海马依赖性记忆测试。（B） 术后第7天进行海马依赖性记忆测试。（C） 术后第3天进行海马非依赖性记忆测试。（D） 术后第7天进行海马独立记忆测试*P（P）< 0.05, **P（P）与C-P组相比<0.01#P（P）<0.05, ##P（P）与S-P组相比<0.01。C-P，假手术加安慰剂；C-E，假手术加依达拉奉；S-P，手术加安慰剂；S-E，手术加依达拉奉。

3.2依达拉奉在手术加LPS给药后增加了大鼠海马和前额叶皮层的SOD活性，降低了MDA水平

如所示图4A和4B与C-P组相比，术后第3天海马和前额叶皮层的SOD活性显著降低(第页<0.01/0.001），但S-P组术后第7天无变化；依达拉奉在很大程度上阻止了SOD活性的异常下降(第页<0.05). 同样，术后3天，依达拉奉显著降低S-P组海马中异常升高的MDA水平(第页< 0.01) (图4C). 术后第3天，各组前额叶皮质MDA水平无差异(图4D)或第7天，尽管S-P组的MDA水平也呈上升趋势，但没有统计学差异。

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图4

术后依达拉奉增加SOD活性，降低海马和前额叶皮质MDA水平（A） 术后第3天海马SOD活性。（B） 术后第3天前额叶皮层的SOD活性。（C） 术后第3天海马MDA水平。（D） 术后第3天前额叶皮质MDA水平*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）与C-P组相比<0.001#P（P）与S-P组相比<0.05。C-P，假手术加安慰剂；C-E，假手术加依达拉奉；S-P，手术加安慰剂；S-E，手术加依达拉奉。

3.3依达拉奉预防术后小胶质细胞活化和LPS给药

用免疫荧光法研究依达拉奉对电离钙结合适配器分子1（Iba1）的影响。如所示图5A-5X，海马上Iba1阳性细胞的总数(图5Y;第页<0.001）和前额叶皮层(图5Z;第页术后第3天，S-P组的切片数明显高于C-P组和S-E组，但在术后第7天，治疗组之间没有显著差异。

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图5

依达拉奉减毒手术加脂多糖诱导的小胶质细胞（绿色）激活（A-X）海马和前额叶皮层中Iba1标记激活的小胶质细胞的代表性图像。（A-D）术后第3天，在200倍放大荧光显微镜下激活海马中的小胶质细胞和细胞核。（E-H）术后第3天，在400倍放大荧光显微镜下激活海马中的小胶质细胞和细胞核。术后第3天，在400倍放大荧光显微镜下激活海马小胶质细胞。（M-P）术后第3天，在200倍放大荧光显微镜下激活前额叶皮层的小胶质细胞和细胞核。（Q-T）在400倍放大荧光显微镜下，术后第3天前额叶皮层中激活的小胶质细胞和细胞核。术后第3天，在400倍放大荧光显微镜下，（U-X）激活前额叶皮层的小胶质细胞。（Y） 术后第3天海马Iba1阳性细胞的数量。（Z） 术后第3天前额叶皮质Iba1阳性细胞的数量。比例尺：A-D和M-P，100μM；E-L和Q-X，50μm*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）与C-P组相比<0.001#P（P）<0.05, ##P（P）与S-P组相比<0.01。C-P，假手术加安慰剂；C-E，假手术加依达拉奉；S-P，手术加安慰剂；S-E，手术加依达拉奉。

3.4依达拉奉减毒手术加脂多糖诱导的神经炎症

为了进一步研究依达拉奉预防小胶质细胞活化的机制，采用western blot检测Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达。如所示图6A-6F术后第3天，与C-p组相比，S-p组大鼠海马和前额叶皮质中p-Akt和p-mTOR的蛋白水平显著降低(第页< 0.05/0.01); 这种异常减少明显减弱(第页<0.05）。术后第7天，各组之间的蛋白表达无差异。

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图6

依达拉奉对脂多糖诱导海马和前额叶皮质损伤大鼠蛋白质表达的影响（A） 术后第3天海马相关蛋白的表达。（B） 术后第3天海马中p-Akt/Akt的比值。（C） 术后第3天海马中p-mTOR/actin的比率。（D） 术后第3天前额叶皮质相关蛋白的表达。（E） 术后第3天前额叶皮层中p-Akt/Akt的比率。（F） 术后第3天前额叶皮层p-mTOR/肌动蛋白的比值*P（P）< 0.05, **P（P）与C-P组相比<0.01#P（P）与S-P组相比<0.05。C-P，假手术加安慰剂；C-E，假手术加依达拉奉；S-P，手术加安慰剂；S-E，手术加依达拉奉。

3.5依达拉奉改良手术加LPS治疗诱导的突触功能抑制

为了进一步评估依达拉奉对手术加LPS给药诱导的认知功能损伤的保护作用，检测了突触蛋白SYN。术后第3天，S-P组海马SYN强度显著降低(第页< 0.001) (图7A-7L)，这种减少被部分逆转(第页<0.01）依达拉奉(图7Y). 术后第7天，海马SYN强度无差异。与海马不同，术后第3天各组前额叶皮质中SYN的表达没有差异(图7M–7X和7Z)或第7天。

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图7

术后加用LPS后，依达拉奉保护海马和前额叶皮质突触（红色）的完整性（A-L）海马SYN标记突触的代表性图像。（A-D）术后第3天在200倍放大荧光显微镜下观察海马突触蛋白和细胞核。术后第3天，在400倍放大荧光显微镜下观察海马突触蛋白和细胞核。（I-L）术后第3天在400倍放大荧光显微镜下海马突触蛋白。（M-P）术后第3天，在200倍放大荧光显微镜下观察前额叶皮层突触蛋白和细胞核。（Q-T）术后第3天，在400倍放大荧光显微镜下观察前额叶皮层突触蛋白和细胞核。术后第3天400倍放大荧光显微镜下前额叶皮层（U-X）突触蛋白（Y）术后第三天海马突触蛋白密度。（Z） 术后第3天前额叶皮质突触蛋白密度。比例尺：A-D，100μm；E-L，50μm***P（P）与C-P组相比<0.001##P（P）与S-P组相比<0.01。C-P，假手术加安慰剂；C-E，假手术加依达拉奉；S-P，手术加安慰剂；S-E，手术加依达拉奉。

4.讨论

本文表明，手术加LPS注射可诱导大鼠POCD，依达拉奉可在很大程度上预防由此引起的认知障碍。此外，依达拉奉对大鼠POCD发育的保护作用可能与其抗氧化作用、抑制小胶质细胞活化和维持Akt/mTOR信号通路的正常激活有关。

最近的研究表明，手术会引发全身和海马炎症，从而导致认知能力下降[5,30,31]. 系统感染会增加大脑中促炎细胞因子的水平，从而导致大鼠记忆巩固的损伤[32]. 已知脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，可引发强大的免疫反应[16]. 用亚临床剂量的LPS刺激免疫系统可以放大手术引起的促炎反应[33]. 在临床实践中，患者在手术前后发生亚临床感染非常常见[17]. 因此，基于报告的研究，我们选择LPS的剂量（100μg/kg）来模拟亚临床感染。所选剂量已经过测试，能够提高免疫系统的敏感性，并加重单侧肾切除导致的认知功能障碍的严重程度[17].

MWM测试被选为一种稳健可靠的测试，与海马依赖性记忆密切相关[34–35]. 它由两部分组成：空间参考记忆测试和反转测试。在空间参考记忆测试中，S-P组观察到明显的固有记忆损伤，依达拉奉显著减轻了这种固有记忆损伤。在MWM逆转任务中，使用了一种独立于海马功能的方法来评估认知灵活性[36]. S-P组的学习能力和短期记忆明显下降，术后这种认知障碍也被依达拉奉预防。在新的恐惧条件反射情境测试中，术后第7天海马依赖性认知功能障碍持续存在，而海马非依赖性认知功能下降发生在术后第3天，但不会持续到术后第七天。在恐惧条件反射测试中，依达拉奉政府还防止了认知下降并加速了认知恢复。

在情境恐惧条件反射测试中，认知功能障碍在术后第7天持续存在，而MWM测试中的空间参考记忆在术后7天在手术加LPS组没有改变。这可能与大鼠海马不同区域形成不同的记忆有关，手术加脂多糖对海马区域的损伤程度不同。虽然空间记忆和情境恐惧记忆依赖于海马，但记忆的形成依赖于不同的脑区[37].空间记忆依赖于海马、纹状体、基底前脑、小脑等区域的参与，上述组织的任何损伤都会导致记忆障碍[38]. 对于空间记忆衰退，背侧海马的损伤比腹侧海马的损害更严重[39].恐惧条件反射测试形成皮层记忆，主要依赖海马CA1区[40]. 特别是，RA1的活性与恐惧皮层记忆有关[41].

先前的研究表明，单侧肾切除治疗的老年啮齿动物在水迷宫和恐惧条件反射测试中存在明显的认知障碍[42,43]. 同时，全身炎症被认为会增加大脑中促炎细胞因子的水平并加重POCD[17,32]. 依达拉奉是一种已知的抗氧化剂，已被证明能对抗患者的POCD[15]. 然而，据我们所知，很少有研究检测依达拉奉对手术加LPS注射诱导的POCD的保护作用。我们的研究首次证明了依达拉奉在治疗手术加LPS注射所致认知功能障碍中的潜在作用。

先前的研究表明，手术通过激活免疫系统，促进炎症反应和氧化应激[44,45]全身感染会导致脑部出现更多炎性细胞因子[32]. 炎症和氧自由基都被认为参与了POCD的发病和维持[46,47]. 此外，炎症还促进氧自由基进入中枢神经系统[29]然后加剧了氧化应激对认知功能的有害影响[18]. 基于这些原因，我们在接受手术和注射LPS的大鼠中进一步研究了依达拉奉的抗氧化和抗神经炎症作用。

脑组织中SOD活性和MDA水平的异常变化被认为与细胞膜、线粒体和溶酶体结构的功能障碍和损伤以及与POCD相关的细胞自溶有关[46]. 此外，炎性细胞因子的过度表达通常伴随着活化的小胶质细胞数量的增加[48,49]其特征是Iba1急剧增加。本文显示，S-P组动物海马和前额叶皮质在手术后不同时间点（SOD和MDA第3天和第7天，Iba1第3天）SOD活性降低，MDA水平升高，Ibal显著增加。依达拉奉部分逆转了上述异常变化，进一步表明依达拉奉对POCD的保护作用可能与其抗氧化和抗神经炎症作用有关。

除了减轻氧化应激和神经炎症外，通过抑制炎症来维持Akt/mTOR信号通路的激活以预防手术诱导的POCD被认为是一种可靠的方法[50]. 原因是Akt/mTOR信号通路在关键抗炎和免疫调节细胞因子的诱导中起着关键作用[50,51]. 此外，氧化应激可抑制Akt/mTOR信号通路的激活[52,53]. 最重要的是，已知的对POCD具有更大保护作用的药物，如乙酰胆碱酯酶，被发现具有激活Akt/mTOR通路的能力[54]. 为了研究依达拉奉对POCD的保护作用与Akt/mTOR通路激活之间的关系，还测试了p-Akt和p-mTOR的蛋白表达以及SYN强度。

一般来说，p-Akt参与调节细胞凋亡、刺激细胞增殖和许多其他生理过程[27]. 炎症因子如TNF-a、IL-6和氧化因子可以通过下调p-Akt蛋白的表达来抑制Akt/mTOR信号通路的激活[55,56]. mTOR是Akt/mTOR信号通路中的主要下游信号因子，已被证明与阿尔茨海默病等认知功能障碍密切相关[57]. 此外，它还被证明部分影响突触可塑性和记忆[24,25]通过调节与突触重塑相关的某些蛋白质的合成[58,59]. 突触可塑性被证明是在正常条件下维持学习和记忆的生物学基础[60]SYN-1强度被认为参与调节突触小泡的数量并有助于突触功能。在S-P组中，在大鼠中观察到P-Akt和P-mTOR蛋白表达下调，同时海马和前额叶皮质的SYN强度降低；依达拉奉在很大程度上逆转了这些作用，表明依达拉奉还可以通过阻止p-Akt和p-mTOR蛋白的下调来维持Akt/mTOR信号通路的正常激活。因此，手术引起的神经炎症得到了很大程度的抑制，突触可塑性得以保持，最终导致手术加LPS注射导致的POCD显著减弱。

5.结论

总之，单侧肾切除加LPS给药的大鼠表现出明显的认知障碍。已知抗氧化剂依达拉奉能有效减轻认知障碍；其保护机制可能与抗氧化和抗炎作用以及维持Akt/mTOR信号通路激活的能力有关。虽然依达拉奉如何改善认知功能的细节尚不清楚，但本文可能提供一种新的策略来对抗手术引起的POCD。

支持信息

资金筹措表

本研究得到了总后勤部（13BJZ38）卫生保健专题拨款和“十二五”军事医学科技项目（AWS15J007，BWS12J042）的支持。

数据可用性

所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

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