IRE1通路介导的病理性内质网应激对病毒诱导的1型糖尿病大鼠前胰岛素β细胞凋亡的影响

糖尿病诱导

连续三天（第3天、第2天和第1天），向21至24天龄的BBDR大鼠腹腔注射聚肌苷：多囊酰酸（pIC）（2μg/g体重）；pIC（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）溶于Dulbecco的PBS中。大鼠接受单次腹腔注射剂量为1×10⁷第0天Kilham鼠病毒（KRV）的PFU。对照组大鼠在同一天接受腹腔注射PBS。从KRV治疗后第10天或第11天开始，对大鼠进行糖尿病测试（Clinistix，Bayer，Elkhart，IN，USA）。连续两天血糖浓度>14 mmol/l证实糖尿病（美国印第安纳波利斯罗氏诊断公司Accu-Chek Aviva）。

岛屿隔离

在一些实验中，如前所述，通过胶原酶消化法从BBDR大鼠获取胰岛[14]. 新鲜分离的胰岛用液氮快速冷冻，并在-80°C下保存直至使用。

免疫印迹分析

用T-PER组织蛋白提取试剂（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）对大鼠胰岛进行裂解，并用双辛酸蛋白测定法（Sigma-Aldrich）测定蛋白质浓度。将蛋白质样品与4X SDS-PAGE加载缓冲液混合，并与梯形标记物（Gibco，Grand Island，NY，USA）一起加载到4-20%预制的Tris-甘氨酸梯度凝胶（Invitrogen，Grand Island，NY，USA）上，并在150V下运行1.5小时。用iBlot（Invitrogen）将凝胶转移到硝化纤维素膜上，用5%的非脂肪乳封闭1小时，并在4°C下放置在一级抗体中过夜。将膜在三缓冲盐水吐温（TBST）中清洗三次，并在室温下放置在二级抗体中1小时。膜在TBST中清洗三次，用ECL（Gibco）显影，并用柯达化学发光膜成像。用Photoshop进行密度分析，将所有蛋白质水平归一化为肌动蛋白水平，并表示为平均值±STDEV。

免疫荧光染色

用液氮将大鼠胰腺标本冷冻在Tissue-Tek O.C.T.（Sakura Finetek USA，Inc.，Torrance，CA，USA）中。用低温恒温器（美国伊利诺伊州布法罗格罗夫莱卡）切割5μm厚的切片，并在-80°C下保存。切片在用乙醇和0.1%三氯乙酸的混合物染色前固定15分钟，然后用PBS-AT封闭（500 ml PBS，10 g BSA J级，12.5 ml 20%Triton X-100）。切片在室温下与一级和二级抗体孵育1小时，用PBS中的三次洗涤液隔开。在PBS中进行三次洗涤后，向切片中添加安装介质（Vectashield with DAPI，Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA，USA）。使用尼康Eclipse TE2000-E显微镜上的旋转圆盘共焦显微镜捕获图像，并使用MetaMorph软件（美国宾夕法尼亚州唐宁顿市分子器件公司）进行分析。

抗体

免疫印迹抗体包括兔抗人磷特异性（Ser724）IRE-1α（Novus，Littleton，CO，USA）；兔抗人IRE-1α、兔抗鼠caspase-12和兔抗鼠磷酸化-PERK（p-PERK，Thr980，16F8）（Cell Signaling，Danvers，MA，USA）；兔抗人XBP-1、兔抗PKR、兔抗p-eIF2a（Ser51）和兔抗人PERK（Abcam，Cambridge，MA，USA）；小鼠抗人ATF6（Imgenex，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）；兔抗人半胱氨酸蛋白酶-3（H-277）、兔抗小鼠CHOP（F-168）和兔抗胰岛素（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，USA）。小鼠抗肌动蛋白（Chemicon International，Billerica，MA，USA）用作负荷控制。次级抗体、抗兔和抗鼠IgG HRP结合物来自圣克鲁斯生物技术公司。

为了进行免疫荧光染色，除上述抗体外，还用小鼠抗胰岛素（Sigma-Aldrich）、豚鼠抗胰岛素（Dako、Carpintia、CA、USA）和鸡抗胰岛素（Abcam）对冰冻切片进行染色。二级抗体、Alexa Fluor 488和592山羊抗鼠、抗兔、抗豚鼠和抗鸡均来自Invitrogen。同位素对照来自Pharmingen。

IRE1磷酸化和XBP-1下游激活始于早期胰岛素抵抗前阶段，并在糖尿病发展过程中持续

为了确定病毒诱导的1型糖尿病发展过程中β细胞内质网应激信号的发生，我们首先检测了IRE1通路。免疫印迹分析表明，从PBS治疗的对照大鼠分离的胰岛裂解物中未检测到活性（磷酸化）IRE1，而在KRV+pIC治疗后第4天，从大鼠分离出的胰岛中IRE1高度活性（磷酸），表明IRE1信号上调(图2a). KRV+pIC治疗大鼠胰岛中磷酸化IRE-1与总IRE-1的比率在第7天以及糖尿病发展的晚期胰岛炎阶段（第11-14天）保持不变(图2b).

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图2

IRE-1α磷酸化发生在糖尿病诱导的早期。（a） PBS（对照）或KRV+pIC治疗大鼠分离胰岛蛋白裂解物的免疫印迹，以检测IRE-1α磷酸化形式（p-IRE-1β，Ser724）和总IRE-1γ；肌动蛋白作为负荷控制。（b） p-IRE-1α/t-IRE-1α比值的密度分析（平均值±STDEV，n=3）**与PBS（对照）大鼠相比，p<0.01和***p<0.001。

IRE1途径中的一个重要下游成分是XBP-1。激活的IRE1具有内核糖核酸酶活性，可产生剪接的活性形式的XBP-1，并可转位到细胞核[15]. XBP-1活性（剪接）形式的表达在感染后第4天上调，并在糖尿病诱导期间持续，而对照大鼠的水平未检测到(图3a，b）。在对照组和糖尿病诱导的大鼠中，XBP-1的非活性（非片断）形式的水平相似。为了验证XBP-1在胰腺β细胞中的特异性激活，我们对对照组和KRV+pIC治疗组大鼠的胰腺切片进行了胰岛素和XBP-1染色。KRV+pIC治疗大鼠的胰腺切片在糖尿病诱导过程中胰岛素阳性β细胞中显示出明显的核XBP-1染色，与XBP-1激活一致，而PBS治疗大鼠中的染色可以忽略不计(图3c). 有趣的是，最近有报道称α细胞经历内质网应激[16]; 我们还在KRV+PIC处理的大鼠（ESM）的胰高血糖素阳性α细胞中观察到活化的（核）XBP-1染色图2).

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图3

XBP-1的激活发生在糖尿病诱导的早期。（a） PBS（对照）或KRV+pIC治疗大鼠分离胰岛蛋白裂解物的免疫印迹，用于XBP-1的拼接（s）和未拼接（u）形式；肌动蛋白作为负荷控制。（b） s-XBP-1/u-XBP-1比值的密度分析（平均值±STDEV，n=3）**与PBS（对照）大鼠相比，p<0.01和***p<0.001。（c） 冷冻胰腺组织的免疫荧光染色；上面板显示XBP-1（红色）和胰岛素（绿色）染色，下面板显示DAPI（蓝色）覆盖以可视化细胞核。箭头表示β细胞对XBP-1核移位呈阳性。有代表性的免疫荧光染色；n=每个时间点4只大鼠；每只大鼠至少检查3个区域。放大倍数=40倍，比例尺=20μm。

内质网应激特异性caspase 12激活发生在KRV+pIC治疗大鼠胰岛早期、胰岛素抵抗前阶段

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12是一种ER-localized pro-apoptotal protein，通过IRE1信号通路对病理性内质网应激进行特异性激活[17,18]. 我们通过测定促凋亡caspase 12激活（裂解）形式的表达，研究病毒诱导的BBDR大鼠胰岛中上调的IRE1信号是否已转变为病理性内质网应激。在KRV+pIC处理的大鼠的分离胰岛中，从第4天开始，即在胰岛炎发作之前，以及在糖尿病诱导的第7天和之后的胰岛炎阶段（第11-14天），发现活化的胱天蛋白酶12水平升高(图4a、b).

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图4

糖尿病诱导的BBDR大鼠胰岛中ER应激特异性caspase 12的激活发生在胰岛炎发病之前。（a） PBS（对照）或KRV+pIC治疗大鼠分离胰岛蛋白裂解物的Caspase 12免疫印迹；肌动蛋白作为负荷控制。（b） 裂解/未裂解半胱天冬酶12比率的密度分析（平均值±STDEV，n=3）**与PBS（对照）大鼠相比，p＜0.01和***p＜0.001。（c） 冷冻胰腺组织的免疫荧光染色；上面板显示caspase 12（红色）和胰岛素（绿色）染色，下面板显示DAPI（蓝色）覆盖以可视化细胞核。箭头表示caspase 12染色阳性的β细胞。有代表性的免疫荧光染色；n=每个时间点4只大鼠；每只大鼠至少检查3个区域。放大倍数=40倍，比例尺=20μm。

为了确定caspase 12在β细胞中的特异性表达，我们对对照组和KRV+pIC治疗组大鼠的胰腺切片进行了胰岛素和caspase 12-共染色。PBS治疗对照大鼠的胰岛显示出强劲的胰岛素表达，caspase 12染色很低或检测不到(图4c). 相反，在病毒感染的第14天，我们观察到许多胰岛由β细胞组成，caspase 12染色显著增加，同时胰岛素水平显著降低。

KRV+pIC治疗大鼠胰岛中效应器caspase 3的激活发生在胰岛炎之前

我们还检测了从对照组和KRV+pIC治疗组大鼠分离的胰岛中caspase 3的激活，caspase是凋亡细胞死亡的主要效应因子。在KRV+pIC治疗的第7天，我们观察到caspase 3的活性（裂解）形式显著增加，表明在这种病毒诱导的糖尿病模型中，胰岛在发生胰岛炎之前发生凋亡(图5). Caspase 3的激活在晚期也很高。相反，在PBS治疗大鼠的胰岛中只观察到非活性（未分离）形式的caspase 3。为了用不同的方法证实细胞凋亡，我们对对照组和TUNEL治疗组大鼠的胰腺切片进行染色。我们发现KRV+pIC治疗大鼠胰岛炎（ESM）之前和期间胰腺切片中TUNEL阳性β细胞增加图3). 结合上述caspase 12的结果，这些数据表明促凋亡内质网应激和胰腺β细胞死亡首先发生之前胰岛素事件，提示病理性内质网应激在病毒诱导糖尿病的早期阶段起作用。

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图5

糖尿病诱导的BBDR大鼠胰岛中caspase 3的激活发生在胰岛炎发病之前。（a） PBS（对照）或KRV+pIC治疗大鼠分离胰岛蛋白裂解物的Caspase 3免疫印迹；肌动蛋白作为负荷控制。（b） 裂解/未裂解半胱天冬酶3比率的密度分析（平均值±STDEV，n=3）***与PBS（对照）大鼠相比，p<0.001。

PERK磷酸化和促凋亡内质网应激标记物CHOP仅在糖尿病诱导的晚期胰岛细胞中高度增加

接下来，我们研究了PERK通路，发现在对照组和治疗组大鼠的胰岛裂解物中都存在PERK，且水平相似。PERK的活性（磷酸化）形式在第7天适度增加，但在第11-14天出现淋巴细胞浸润时激活水平最高(图6). 此外，我们还分析了胰岛蛋白裂解物中的ATF4，一种PERK通路中的下游转录因子[19]但我们观察到对照组或KRV+pIC治疗组大鼠胰岛中ATF4表达几乎没有差异(图7).

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图6

胰岛PERK通路激活主要发生在糖尿病诱导的晚期。（a） PBS（对照）或KRV+pIC治疗大鼠分离胰岛蛋白裂解物的免疫印迹，以检测磷酸化（p）活性形式的PERK（p-PERK，Thr980）和总（t）PERK；肌动蛋白作为负荷控制。（b） p-PERK/t-PERK比值的密度分析（平均值±STDEV，n=3）*与PBS（对照）大鼠相比，p<0.05。

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图7

在糖尿病的诱导过程中，ATF4的表达没有受到显著影响。（a） PBS（对照）或KRV+pIC治疗大鼠分离胰岛蛋白裂解物的ATF4免疫印迹；肌动蛋白作为负荷控制。（b） ATF4的密度分析（平均值±STDEV，n=3）。（c） 冷冻胰腺组织的免疫荧光染色；上面板显示ATF4（红色）和胰岛素（绿色）染色，下面板显示DAPI（蓝色）覆盖以可视化细胞核。有代表性的免疫荧光染色；n=4只大鼠，每个时间点至少检查3个区域。放大倍数=40倍，比例尺=30μm。

激活的PERK通过直接磷酸化真核翻译起始因子eIF2α抑制细胞mRNA翻译[4]; eIF2α也可以被PKR磷酸化，PKR被双链RNA（dsRNA）激活，如合成的pIC[20,21]. 与磷酸化PERK类似，我们发现KRV+pIC治疗后第7天大鼠胰岛中PKR的表达增加(图8). 接下来，我们分析了胰岛蛋白裂解物的eIF2α磷酸化。然而，对照组和KRV+pIC处理的大鼠胰岛的免疫印迹分析显示，eIF2α磷酸化水平相对相似(图9). 结合我们的ATF4结果，这些数据表明胰岛通常表现出高的生理UPR活性。

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图8

KRV+pIC治疗大鼠PKR表达增加。a） PBS对照组（C）或KRV+pIC治疗组（TX）大鼠分离胰岛蛋白裂解物的PKR免疫印迹；肌动蛋白作为负荷控制。（b） PKR处理/对照比（归一化为肌动蛋白）的密度分析（平均值±STDEV，n=3）。

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图9

磷酸化eIF2α在对照组和KRV+pIC治疗组大鼠中的表达相似。a） PBS对照组（C）或KRV+pIC治疗组（TX）大鼠分离胰岛蛋白裂解物的磷酸化eIF2α（p-eIF2a）免疫印迹；肌动蛋白作为负荷控制。（b） p-eIF2a处理/对照比（归一化为肌动蛋白）的密度分析（平均值±STDEV，n=3）。

最后，我们测量了CHOP（CCAAT/-增强子结合蛋白同源蛋白）的表达，CHOP受PERK通路调节，并在长时间内质网应激中诱导细胞凋亡[三,19,22,23]. 对分离胰岛的免疫印迹分析表明，CHOP的表达仅在自身反应性T淋巴细胞浸润的晚期高表达(图10a、b). 伴随CHOP高水平表达，我们发现细胞内胰岛素水平显著降低(图10a)与此阶段的严重β细胞功能障碍或死亡相一致。

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图10

胰岛中CHOP前凋亡表达主要发生在糖尿病诱导的晚期。用KRV+pIC或PBS（对照）治疗的BBDR大鼠的胰腺组织在指定的时间点恢复。（a） PBS（对照）或KRV+pIC治疗大鼠分离胰岛蛋白裂解物的CHOP和胰岛素免疫印迹；肌动蛋白作为负荷控制。（b） CHOP的密度分析（平均值±STDEV，n=3）*与PBS（对照）大鼠相比，p<0.05。

我们感谢美国波士顿Joslin糖尿病中心的Aldo A.Rossini博士的有益讨论和见解。我们还感谢Elaine Norowski和Linda Leehy（分子医学项目）的杰出技术援助，以及美国伍斯特马萨诸塞大学医学院的Paul Furcinitti博士（数字光显微镜核心设施）在旋转盘共焦显微镜方面的援助。

基金：这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款AI046629、β细胞生物学联合会DK72473以及青少年糖尿病基金会、国际、赫尔姆斯利基金会和布雷姆基金会的资助。使用了NIH糖尿病内分泌研究中心拨款（DK32520）支持的核心资源。

本出版物的内容仅由作者负责，不一定代表NIH的官方观点。