结果
为了以物种依赖的方式研究构成性损伤IIS的影响，我们使用了三种不同的模型：秀丽线虫携带突变株的菌株daf-2（e1370）【胰岛素/IGF-1受体同源物】基因，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）缺乏胰岛素和IGF-1受体的蛋白质主要靶点，即胰岛素受体底物1（IRS-1）(Brüning等人，1997年) (图S1A)最后，MEF以杂合子的方式诱导缺乏胰岛素受体（IR）（以前未发表，有关详细信息，请参阅实验程序）(图S1B). 就以下七个参数对这三个模型进行了独立分析。
结构性受损的IIS可增强抗压能力
Daf-2型突变体和合适的野生型对照菌株秀丽线虫（N2）暴露于已建立的活性氧发生器百草枯中，浓度为10 mM，持续6天。这个daf-2型突变体蠕虫对百草枯胁迫的抗性增强，这反映在存活率增加()与之前发布的数据一致(Brys等人，2010年;本田和本田，1999年). 同样，缺乏IRS1（IRS1−/−）的MEF和胰岛素受体杂合失活的MEF对百草枯胁迫更具抵抗力在体外比对照组成纤维细胞(,图S1C).
组分受损胰岛素-/IGF1信号转导诱导线粒体代谢，降低ROS水平，并增加两者内源性抗氧化防御秀丽线虫和小鼠胚胎成纤维细胞（A–C）百草枯的存活率（D–F）ATP含量，（G–I）耗氧量，（J–L）线粒体活性氧水平，（否）过氧化氢生产，（P–R）超氧化物歧化酶活性，（南-南）过氧化氢酶活性，每种定量（A、D、G、J、M、P、S）
daf-2（e1370）线虫或（B、E、H、K、N、Q、T）IRS1−/−MEF或（C、F、I、L、O、R、U）IR+/−MEF（均以黑色条表示）与相应野生型控件（白色条）中的效果相关。所有数值均以平均值±标准差给出。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与相应的对照组相比。
结构性受损的IIS增加线粒体代谢
以前有人建议，在秀丽线虫由于DAF-2表达受损，导致秀丽线虫(Houthoofd等人，2005年). 事实上，在本研究中，我们发现daf-2型突变体增加了102%(). 同样，尽管胰岛素/IGF-1信号受损，但IRS1−/−和IR+/−MEF的ATP水平分别增加了69和40%()，表明能量效率和线粒体活性增加daf-2型、IRS1−/−和IR+/−。同样，我们观察到耗氧量增加了39%daf-2（e1370）突变体()以及IRS1−/−和IR+/−分别增加45%和28%(). 综上所述，这些发现表明IIS的慢性损伤一致导致线粒体活性的诱导daf-2型、IRS1−/−和IR+/−。
daf-2表达的组成性受损降低ROS水平并诱导内源性ROS防御酶
线粒体是活性氧（ROS）的主要来源。由于受损的IIS促进线粒体活性增加，如上所示()，我们预计daf-2型突变蠕虫和IRS1−/−和IR+/−MEF将显示线粒体ROS水平增加。为了验证这一假设，我们使用靶向氧化还原敏感染料量化了活性氧水平，该染料在存在活性氧的情况下在线粒体室中积累(Esposti等人，1999年). 令我们惊讶的是，这表明三种车型的ROS水平意外下降了14-28%()尽管线粒体活性增加(). 此外，当我们量化了蠕虫和MEF培养物上清液中过氧化氢的积累，以获得ROS水平的独立估计值时，我们观察到所有三种情况下都减少了9至50%(). 因此，使用两种独立的方法，慢性受损IIS的所有三个模型系统都显示出ROS水平降低。此外，我们分别量化了从N2和daf-2线虫中分离出的线粒体中的过氧化氢生成量。与活蠕虫的研究结果一致()我们发现分离自daf-2型突变体(图S1D).
为了解决线粒体活性增加与活性氧水平降低之间的关系，我们量化了秀丽线虫和MEF。与其他人的调查结果一致(Vanfleteren，1993年)，在这些线虫中未检测到谷胱甘肽过氧化物酶的显著活性（数据未显示）。然而，超氧化物歧化酶（SOD）的活性()和过氧化氢酶（CAT）()年分别增加了50%和36%daf-2型IRS1−/−和IR+/−的突变体和类似结果(). 这些发现表明，在慢性受损IIS的不同状态下，尽管线粒体活性增加，但活性氧水平降低，并且这种降低可能是主要活性氧防御酶活性增加的结果，这表明活性氧防御酶的增加反映了对线粒体代谢增加的适应性反应，并且可能由于呼吸增加而暂时增加活性氧水平。
急性受损的daf-2表达导致秀丽线虫
为了验证这个假设，我们分析了严重的而不是组成的daf-2型以时间分辨的方式受损。为此，我们对daf-2型，RNAi(daf-2型) (Dillin等人，2002年)给年轻人秀丽线虫并量化放射性标记的2-脱氧葡萄糖的摄取量，作为胰岛素作用的测量指标。利用该分析，我们观察到RNAi中2-脱氧葡萄糖摄取持续减少(daf-2型)-处理线虫25%()与哺乳动物IIS受损后葡萄糖摄取减少的长期证据一致。
急性损伤daf-2型信号瞬时诱导线粒体ROS水平以促进内源性抗氧化防御（A）2-脱氧葡萄糖摄取，（B）ATP含量，（C）耗氧量和（D）RNAi暴露后线粒体活性氧水平daf-2型（黑条）相对于不同时间点对对照RNAi处理线虫（白条）的影响。（E–G）MitoTracker Red CM-H的荧光显微照片（放大：10倍）2X处理线虫，（E）对照RNAi治疗24小时后，（F）24小时后daf-2型RNAi治疗，（G）百草枯处理1小时后（阳性对照）。（H）过氧化氢生产，（一）超氧化物歧化酶活性，（J）过氧化氢酶活性，每次暴露于RNAi后daf-2型（黑条）相对于不同时间点对对照RNAi处理线虫（白条）的影响。（K）耗氧量，（左）线粒体活性氧水平，（百万）过氧化氢生产，（N）超氧化物歧化酶活性，（O）过氧化氢酶活性，每次暴露于RNAi后daf-2型在抗氧化剂NAC（红条）和BHA（蓝条）的存在下，不同时间点抗氧化剂（白条）对对照RNAi处理线虫的影响。在所有面板中都描述了相对值；有关绝对值，请参见图S2所有数值均以平均值±SD.*表示#p<0.05，**和##与相应对照组相比，p<0.01，***p<0.001。
急性受损的daf-2表达激活线粒体代谢
先前研究表明，葡萄糖可用性降低可激活这两种细胞的线粒体代谢酿酒酵母(Barros等人，2004年;Lin等人，2002年)和秀丽线虫(Schulz等人，2007年). 为了测试受损的DAF-2表达是否也会激活线粒体代谢秀丽线虫，我们进行了一个时间过程评估添加RNAi后的新陈代谢(daf-2型). 添加RNAi后12小时(daf-2型)我们观察到线虫的呼吸和ATP水平暂时下降()这表明最初的能量不足是由葡萄糖摄取受损引起的。在ATP一次减少后，我们观察到氧耗量二次增加，在添加RNAi后24至48小时达到最大值(daf-2型) ()与此同时，ATP含量也在增加(). 综上所述，这些数据表明，尽管葡萄糖摄取量永久性降低，但线虫通过增加呼吸，最终导致ATP水平的二次增加，从而弥补了葡萄糖可用性降低导致的能量不足。后一项发现强烈表明，葡萄糖以外的能源，即脂肪酸和/或氨基酸，可能会被代谢。
急性受损的daf-2表达促进ROS的短暂增加
众所周知，线粒体活性增加会促进线粒体活性氧的形成，这是呼吸和氧化磷酸化不可避免的副产品。与此相一致，我们观察到添加RNAi后24小时和48小时ROS水平增加(daf-2型) ()当线粒体活性和呼吸增加时。然而，RNAi 5天后(daf-2型)处理后，线粒体活性和呼吸均保持增加，而线粒体活性氧含量显著增加降低(). 使用基于AmplexRed的独立方法，对两个关键时间点（24小时和120小时）的ROS水平进行了确认(). 这些发现表明，只有在RNAi超过48小时的时间点(daf-2型)添加，增加线粒体活性，如ATP含量和呼吸速率所反映的，与减少ROS水平（如稳态所示，参见)，而ROS水平瞬时增加在较早的时间点。
急性受损daf-2表达继发诱导内源性ROS防御酶
为了更好地了解活性氧水平的变化，我们量化了整个线虫裂解液中抗氧化酶的活性。在RNAi后，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）均被诱导(daf-2型)治疗48小时和120小时，但有趣的是不是在更早的时间点(). 在相对较晚的SOD和CAT诱导之前，呼吸、ATP和ROS增加(). 这些发现表明，SOD和CAT活性的适应性诱导有效地抵消了最初增加的ROS水平，最终导致120小时ROS暴露减少。我们以前在热量限制和体育锻炼状态下观察到这种适应性反应(Ristow和Zarse，2010年;Schulz等人，2007年)，而在自适应响应增加之前，对ROS信号进行时间分辨分析的情况以前从未有过描述。
daf-2依赖的瞬态ROS信号是诱导内源性ROS防御酶所必需的
秀丽线虫携带构成性非活性等位基因daf-2型已经反复证明能够抵抗各种压力(Brys等人，2010年;本田和本田，1999年;Lithgow等人，1995年;Murphy等人，2003年;Vanfleteren，1993年;Vanfleteren和De Vreese，1995年). 我们发现蠕虫暴露于RNAi后，SOD和CAT活性的后期诱导，即继发诱导(daf-2型)表明ROS水平短暂升高可能是必修的导致ROS防御能力增加。为了验证这个假设，我们用RNAi处理线虫(daf-2型)暴露于两种机械独立的抗氧化剂，n-乙酰半胱氨酸（NAC，最终浓度1 mM）和丁基羟基茴香醚（BHA，最终浓度25μM）。在NAC或BHA存在的情况下，我们仍然观察到RNAi后的呼吸诱导(daf-2型)处理(). 然而，ROS水平的诱导()SOD和CAT活性二次升高()不存在，表明ROS水平增加必修的诱导内源性ROS防御酶和抗氧化防御能力。这些发现表明RNAi(daf-2型)当RNAi出现时，不能诱导SOD和CAT(daf-2型)-外源性抗氧化剂补充剂阻断了线粒体ROS介导的短暂增加，即使在呼吸增加的情况下也是如此。
外源性抗氧化剂抑制DAF-2和AGE-1缺乏症延长寿命的能力
基于后一研究结果，我们通过测定NAC或BHA处理的线虫在有无RNAi的情况下的寿命，询问ROS水平增加对SOD和CAT的诱导是否有助于受损IIS延长寿命的能力(daf-2型). 而在缺乏RNAi的情况下，抗氧化剂对预期寿命没有影响(daf-2型) ()排除对野生型N2线虫（NAC）的抗氧化毒性()和BHA()RNAi导致寿命延长缩短(daf-2型)治疗。如中所示，NAC损害了RNAi的寿命延长能力(daf-2型)增加35.7%（最大寿命）和36.7%（平均寿命），而BHA降低了RNAi的寿命延长能力(daf-2型)37.7%和59.9%（分别为最大和平均寿命）。此外，NAC()和BHA()对长寿蠕虫产生了类似的减少作用daf-2（e1370）突变（参见抗氧化剂对daf-2（e1370）突变）。我们最后测试了本构年龄-1（hx546）影响磷脂酰肌醇-3-OH激酶直系亲属年龄1的下游daf-2型，并且非常相似地发现NAC()和BHA()以减少构成性灭活剂的寿命延长倾向年龄1突变。
外源性抗氧化剂会削弱daf-2型损害（A）在抗氧化剂NAC存在（红色）或不存在（黑色）的情况下，暴露于对照RNAi（开放圆圈）的线虫的寿命分析；RNAi对抗线虫的寿命分析daf-2型（闭合三角形）有NAC（红色）或无NAC（黑色）。（B）使用抗氧化剂BHA（蓝色）替代NAC进行上述RNAi存在下的寿命分析。（C）寿命分析daf-2（e1370）存在（红色）或不存在（黑色）NAC时的线虫（闭合三角形）。（D）寿命分析daf-2（e1370）线虫用BHA取代NAC（蓝色）。（E）寿命分析年龄1（hx546）存在（红色）或不存在（黑色）NAC时的线虫（闭合三角形）。（F）寿命分析年龄1（hx546）线虫用BHA代替NAC（蓝色）。
表1
| 菌株，RNAi，溶剂 | 最大寿命（d）（+/-SEM） | 平均寿命（d）（+/-SEM） | P值（与对照，见脚注） | 实验次数（n） | 线虫数量（n） |
|---|
| N2（对照RNAi）H2O（运行） | 28.0 +/−0.6 | 19.40 +/−0.3 | | 三 | 323 |
| N2（控制RNAi）NAC/H2O（运行） | 27.3 +/−0.9 | 18.96 +/−0.2 | 不另说明。一 | 三 | 357 |
| 氮气（daf-2 RNAi）H2O（运行） | 70.3 +/−0.9 | 46.76 +/−1.0 | <0.0001一,b条 | 三 | 310 |
| 氮气（daf-2 RNAi）NAC/H2O（运行） | 60.3 +/−0.9 | 39.64 +/−1.1 | <0.0001一,b条,c（c） | 三 | 318 |
| N2（控制RNAi）DMSO | 31.0 +/−0.6 | 19.89 +/−0.2 | | 三 | 335 |
| N2（控制RNAi）BHA/DMSO | 28.3 +/−0.9 | 19.32 +/−0.2 | 不另说明。d日 | 三 | 331 |
| N2（daf-2 RNAi）二甲基亚砜 | 71.7 +/−1.2 | 46.00 +/−1.0 | <0.0001d日,e（电子） | 三 | 342 |
| N2（daf-2 RNAi）BHA/DMSO | 60.0 +/−0.6 | 34.16 +/−0.7 | <0.0001d日,e（电子）,（f） | 三 | 331 |
| daf-2（e1370）高2O（运行） | 73.5 +/−1.5 | 51.09 +/−0.6 | | 2 | 218 |
| daf-2（e1370）NAC/H2O（运行） | 61.5 +/−1.5 | 44.87 +/−0.5 | <0.0001克 | 2 | 248 |
| daf-2（e1370）二甲基亚砜 | 73.5 +/−1.5 | 47.23 +/−1.1 | | 2 | 222 |
| daf-2（e1370）BHA/DMSO | 63.0 +/−2.0 | 31.81 +/−1.2 | <0.0001小时 | 2 | 253 |
| N2（对照RNAi） | 30.0 +/−0.5 | 21.0 +/− 0.1 | | 2 | 386 |
| N2（sod-3 RNAi） | 30.0 +/−1.0 | 20,6 +/− 0.2 | 不另说明。一 | 2 | 412 |
| N2（daf-2 RNAi） | 72.0 +/−0.5 | 42.1 +/− 1.2 | <0.0001一 | 2 | 352 |
| N2（sod-3 RNAi/daf-2 RNAi） | 55.0 +/−1.9 | 37.1 +/− 0.7 | <0.0001一,c（c） | 2 | 394 |
| N2（ctl-2 RNAi） | 30.0 +/−1.0 | 20.8 +/− 0.2 | 不另说明。一 | 2 | 452 |
| N2（ctl-2 RNAi/daf-2 RNAi） | 61.0 +/−2.4 | 40.1 +/− 0.8 | <0.05一,c（c） | 2 | 427 |
| 年龄1（hx546）小时2O（运行） | 50.5 +/−0.5 | 28.90 +/−0.2 | | 2 | 247 |
| 年龄1（hx546）NAC/H2O（运行） | 41.0 +/−1.0 | 23.46 +/−0.2 | <0.0001我 | 2 | 256 |
| 年龄1（hx546）二甲基亚砜 | 50.5 +/−1.0 | 27,87 +/−0.2 | | 2 | 259 |
| 年龄1（hx546）BHA/DMSO | 44.5 +/−0.5 | 22,63 +/−1.6 | <0.0001k个 | 2 | 242 |
| aak-2（ok524）（控制RNAi）H2O（运行） | 24.5 +/−0.5 | 16.78 +/−0.4 | | 2 | 213 |
| aak-2（ok524）（控制RNAi）NAC/H2O（运行） | 24.0 +/−1.0 | 16.65 +/−0.3 | 未另行规定。一 | 2 | 234 |
| aak-2（ok524）（daf-2 RNAi）H2O（运行） | 36.0 +/−1.0 | 21.02 +/−0.1 | <0.0001一,b条 | 2 | 229 |
| aak-2（ok524）（daf-2 RNAi）NAC/H2O（运行） | 38.0 +/−1.0 | 21.13 +/−0.3 | <0.0001一,b条，，不另说明。c（c） | 2 | 231 |
| aak-2（ok524）（控制RNAi）DMSO | 24.0 +/−1.0 | 16.64 +/−0.4 | | 2 | 217 |
| aak-2（ok524）（控制RNAi）BHA/DMSO | 24.0 +/−0.0 | 16.89 +/−0.7 | 未另行规定。d日 | 2 | 220 |
| aak-2（ok524）（daf-2 RNAi）二甲基亚砜 | 37.5 +/−1.5 | 22.53 +/−0.2 | <0.0001d日,e（电子） | 2 | 202 |
| aak-2（ok524）（daf-2 RNAi）BHA/DMSO | 37.5 +/−0.5 | 23.16 +/−0.3 | <0.0001d日,e（电子），，不另说明。（f） | 2 | 205 |
| pmk-1（km25）（控制RNAi）H2O（运行） | 28.0 +/−1.0 | 19.36 +/−0.2 | | 2 | 178 |
| pmk-1（km25）（控制RNAi）NAC/H2O（运行） | 29.5 +/−0.5 | 19.42 +/−0.2 | 不另说明。一 | 2 | 160 |
| pmk-1（km25）（daf-2 RNAi）高度2O（运行） | 38.0 +/−1.0 | 27.02 +/−1.1 | <0.0001一,b条 | 2 | 166 |
| pmk-1（km25）（daf-2 RNAi）NAC/H2O（运行） | 55.0 +/−2.0 | 34.13 +/−1.0 | <0.0001一,b条,c（c） | 2 | 170 |
| pmk-1（km25）（控制RNAi）DMSO | 26.5 +/−1.5 | 17.49 +/−0.7 | | 2 | 157 |
| pmk-1（km25）（对照RNAi）BHA/DMSO | 28.5 +/−1.5 | 17.40 +/−0.6 | 不另说明。d日 | 2 | 161 |
| pmk-1（km25）（daf-2 RNAi）二甲基亚砜 | 41.5 +/−1.5 | 28.16 +/−1.2 | <0.0001d日,e（电子） | 2 | 148 |
| pmk-1（km25）（daf-2 RNAi）BHA/DMSO | 54.0 +/−2.0 | 32.97 +/−1.2 | <0.0001d日,e（电子）, =0.00010（f） | 2 | 151 |
| skn-1（zu67）（控制RNAi）H2O（运行） | 21.5 +/−0.5 | 16.77 +/−0.1 | | 2 | 140 |
| skn-1（zu67）（对照RNAi）NAC/H2O（运行） | 22.5 +/−0.5 | 16.57 +/−0.1 | 不另说明。一 | 2 | 160 |
| skn-1（zu67）（daf-2 RNAi）H2O（运行） | 34.0 +/−1.0 | 21.89 +/−0.1 | <0.0001一,b条 | 2 | 144 |
| skn-1（zu67）（daf-2 RNAi）NAC/H2O（运行） | 45.5 +/−0.5 | 26.71 +/−1.1 | <0.0001一,b条,c（c）, | 2 | 150 |
| skn-1（zu67）（控制RNAi）二甲基亚砜 | 23.0 +/−0.0 | 16.78 +/−0.2 | | 2 | 148 |
| skn-1（zu67）（控制RNAi）BHA/DMSO | 23.5 +/−0.5 | 16.66 +/−0.3 | 未另行规定。d日 | 2 | 147 |
| skn-1（zu67）（daf-2 RNAi）二甲基亚砜 | 33.5 +/−1.5 | 21.05 +/−0.3 | <0.0001d日,e（电子） | 2 | 158 |
| skn-1（zu67）（daf-2 RNAi）BHA/DMSO | 45.5 +/−0.5 | 26.00 +/−1.1 | <0.0001d日,e（电子）,（f） | 2 | 150 |
| daf-16（mu86）（控制RNAi）H2O（运行） | 24.0 +/−1.0 | 16.71 +/−0.1 | | 2 | 184 |
| daf-16（mu86）（控制RNAi）NAC/H2O（运行） | 22.5 +/−0.5 | 16.35 +/−0.1 | 不另说明。一 | 2 | 195 |
| daf-16（mu86）（daf-2 RNAi）H2O（运行） | 24.5 +/−0.5 | 16.55 +/−0.1 | 不另说明。一.b条 | 2 | 166 |
| daf-16（mu86）（daf-2 RNAi）NAC/H2O（运行） | 24.0 +/−0.0 | 16.20 +/−0.1 | 不另说明。一.b条.c（c） | 2 | 186 |
| daf-16（mu86）（对照RNAi）二甲基亚砜 | 24.5 +/−0.5 | 14.68 +/−0.1 | 不另说明。 | 2 | 162 |
| daf-16（mu86）（控制RNAi）BHA/DMSO | 23.5 +/−0.5 | 14.62 +/−0.1 | 不另说明。d日 | 2 | 176 |
| daf-16（mu86）（daf-2 RNAi）二甲基亚砜 | 24.5 +/−0.5 | 14.87 +/−0.1 | 不另说明。d日.e（电子） | 2 | 180 |
| daf-16（mu86）（daf-2 RNAi）BHA/DMSO | 24.0 +/−0.0 | 14.64 +/−0.1 | 不另说明。d日.e（电子）.（f） | 2 | 171 |
| N2（对照RNAi） | 33.0 +/−0.5 | 22.6 +/− 0.3 | | 三 | 350 |
| 氮气（B0513.5 RNAi） | 32.0 +/−1.0 | 22.6 +/− 0.1 | 不另说明。一 | 2 | 240 |
| N2（daf-2 RNAi） | 69.0 +/−1.0 | 36.4 +/− 1.9 | <0.0001一 | 三 | 423 |
| N2（B0513.5 RNAi/daf-2 RNAi） | 55.0 +/−1.0 | 31.1 +/− 1.1 | <0.0001一,c（c） | 三 | 345 |
| 氮气（H2O） | 29.5 +/−0.5 | 20.46 +/−0.3 | | 2 | 312 |
| L-脯氨酸（5μM） | 33.5 +/−0.5 | 21.65 +/−0.1 | <0.0001我 | 2 | 256 |
这些发现表明，抗氧化剂降低了胰岛素/IGF信号受损所产生的延长寿命的能力daf-2型和年龄1突变体，以及损伤后ROS水平的短暂诱导daf-2型和年龄1信号传递是诱导适应性反应累积的必要条件，以增加抗应激能力和延长寿命。然而，需要注意的是，两种RNAi(daf-2型)暴露和daf-2（e1370）以及年龄1（hx546）与抗氧化剂处理的野生型N2线虫相比，在抗氧化剂存在的情况下，突变仍能显著延长线虫的寿命。总之，这表明外源性抗氧化剂显著降低受损IIS寿命延长能力达59.9%，而其他一些抗氧化剂daf-2型和年龄1这些影响与活性氧水平的增加无关。
AMP激活的蛋白激酶AAK-2对瞬态ROS信号的诱导至关重要
AMPK同源物AAK-2是秀丽线虫(Apfeld等人，2004年;Greer等人，2007年;Schulz等人，2007年). 如所示，添加RNAi后，线虫ATP水平初步降低(daf-2型)这表明线虫AMP含量呈交互增加。AMP的直接评估秀丽线虫高效液相色谱（HPLC）分析结果表明，RNAi后野生型N2线虫的AMP与ATP比率增加(daf-2型)暴露12小时（AMP/ATP=14.1%+6.5%SD，p=0.038）。这强烈表明AMP激活的AAK-2是由RNAi诱导的(daf-2型)如之前饮食限制状态所示，最终导致线粒体呼吸增加(Schulz等人，2007年)，并且可能在这里用于增加ROS的产生。
因此，我们测试了RNAi(daf-2型)仍能诱导呼吸和/或ROS水平aak-2（ok524）突变体。然而，情况并非如此()，表明aak-2型在线虫IIS受损状态下需要产生ROS信号。然而，RNAi(daf-2型)能够在一定程度上延长寿命aak-2（ok524）线虫(). 然而，应该注意的是，RNAi的相对容量(daf-2型)延长寿命aak-2（ok524）与RNAi的相对影响相比严重降低(daf-2型)野生型N2（参见（用于量化），表明RNAi影响的很大一部分(daf-2型)寿命延长由AAK-2介导，ROS信号的产生如上图所示(与。).
活性氧依赖性寿命延长的分子调控daf-2型损害（A）耗氧量，（B）线粒体活性氧水平aak2（ok524）RNAi暴露后的线虫daf-2型（黑条）相对于控制RNAi处理的影响aak2（ok524）不同时间点的线虫（白色条）。在两个面板中都描述了相对值；有关绝对值，请参见图S3.（C）寿命分析aak-2（ok524）在抗氧化剂NAC存在（红色）或不存在（黑色）的情况下，将线虫暴露于对照-RNAi（开圈）；寿命分析aak2（ok524）接触RNAi的线虫daf-2型（闭合三角形）有NAC（红色）或无NAC（黑色）。（D）在C中存在突变和RNAi的情况下进行寿命分析，用抗氧化剂BHA（蓝色）代替NAC。（E）寿命分析pmk-1（km25）在NAC存在（红色）或不存在（黑色）的情况下暴露于对照品-RNAi（开圈）的线虫；寿命分析pmk-1（km25）接触RNAi的线虫daf-2型NAC存在（红色）或不存在（黑色）时（闭合三角形）；（F）在E中存在突变和RNAi的情况下进行寿命分析，用BHA（蓝色）代替NAC。（G）寿命分析skn-1（zu67）在NAC存在（红色）或不存在（黑色）的情况下暴露于对照品-RNAi（开圈）的线虫；寿命分析skn-1（zu67）暴露于RNAi的线虫daf-2型（闭合三角形）有NAC（红色）或无NAC（黑色）。（H）在G中存在突变和RNAi的情况下进行寿命分析，用BHA（蓝色）代替NAC。超氧化物歧化酶活性（一）和过氧化氢酶（J）pmk-1和skn-1的野生型线虫和突变体中无（白色条）和有（黑色条）daf-2型RNAi治疗5天。面板I和J中描述了相对值；有关绝对值，请参见图S3.（K）暴露于对照RNAi（空圈）和daf-2型RNAi（黑三角形）与暴露对比钠-3RNAi（紫色圆圈）单独和与daf-2型RNAi（紫色三角形）。（左）暴露于对照RNAi（空圈）和daf-2型RNAi（黑三角形）与暴露对比ctl-2型RNAi（紫色圆圈）单独和与daf-2型RNAi（紫色三角形）。（百万）寿命分析daf-16（mu86）在NAC存在（红色）或不存在（黑色）的情况下暴露于对照品-RNAi（开圈）的线虫；寿命分析daf-16（mu86）暴露于RNAi的线虫daf-2型（闭合三角形）有NAC（红色）或无NAC（黑色）。（N）在M中存在突变和RNAi的情况下进行寿命分析，用BHA（蓝色）代替NAC。在面板A、B、I和J中，给出的值为平均值±标准偏差。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
此前研究表明，在糖酵解受损状态下，AAK-2是增加呼吸所必需的(Schulz等人，2007年). 我们这里显示，生成瞬态ROS信号也需要AAK-2(). 因此，我们假设抗氧化剂不会对RNAi产生影响(daf-2型)-介导寿命延长aak-2（ok524）突变体，如果AAK-2启动RNAi中唯一的ROS信号(daf-2型)处理过的蠕虫。的确，NAC和()和BHA()对RNAi没有影响(daf-2型)-介导寿命的有限延长，再次表明需要AAK-2在RNAi后产生ROS的短暂增加(daf-2型)处理（参见用于量化）。综上所述，这些发现表明，AAK-2（AMPK）是线虫体内受损的IIS和短暂升高的ROS水平之间不可或缺的机制联系。
p38 MAP激酶PMK-1和转录因子SKN-1（NRF-2）是检测瞬态ROS信号所必需的
接下来，我们质疑了哪些途径可能参与ROS传感，即需要充分发挥RNAi的寿命延长效应(daf-2型)由于ROS水平增加。与之前公布的调查结果一致(Inoue等人，2005年;Schmeisser等人，2011年)我们发现了pmk-1型应激诱导哺乳动物的直系同源p38 MAP激酶该基因参与感受RNAi产生的ROS信号(daf-2型). 因此，虽然RNAi(daf-2型)导致有限的寿命延长pmk-1（km25）缺乏抗氧化剂的线虫()，均为NAC()和BHA()能够进一步促进RNAi的寿命延长能力(daf-2型) (). 对于skn-1（zu67）突变体，缺乏哺乳动物转录因子NRF-2的功能同源性，之前已证明其在PMK-1下游对氧化应激作出反应(Inoue等人，2005年;Tullet等人，2008年)：RNAi期间(daf-2型)导致了同样有限的寿命延长skn-1号机组-变异的秀丽线虫在缺乏抗氧化剂的情况下()，均为NAC()和BHA()能够进一步诱导RNAi延长寿命的能力(daf-2型) (). 一直以来daf-2型-介导诱导SOD和过氧化氢酶活性()在PMK-1或SKN-1构成缺陷的线虫中发现减少()分别是。此外，我们量化了N2野生型线虫中差异表达的基因，与daf-2（e1370）通过应用RNA测序技术获得突变体。
在参与抗氧化防御的基因中，我们发现一些mRNA在daf-2型突变体，包括草皮-3（22.6倍，p=5.9*10−88),草皮-5（62.2倍，p=5.7*10−75),ctl-2型（2.12倍，p=1.5*10−13)、和ctl-3型（1.74倍，p=0.00012）。测试是否诱导抗氧化酶，尤其是钠-3或ctl-2型为了延长寿命，我们用RNAi处理N2线虫以对抗超氧化物歧化酶亚型草皮-3()和过氧化氢酶亚型ctl-2型()，并与daf-2型RNAi。我们观察到daf-2型两者中的RNAi草皮-3以及ctl-2型RNAi处理的蠕虫()这表明，抗氧化防御酶的诱导至少在一定程度上是由于寿命延长所必需的daf-2型发送信号。
最后，我们质疑daf-16型是哺乳动物叉头转录因子（FoxO）的同源物，可能参与短暂增加ROS形成的寿命延长作用。与之前公布的研究结果一致，RNAi(daf-2型)在daf-16（mu86）线虫(). 因此，NAC()也不是BHA()对该表型有明显影响。
综上所述，这些发现表明PMK-1和SKN-1在RNAi后作为初始ROS信号的传感器(daf-2型)延长寿命的治疗，并且这种影响是由由于daf-2型灭活。
受损IIS模型的跨谱转录组分析
研究结果描述于表明IIS受损会导致细胞内葡萄糖可用性降低，进而诱导线粒体对替代能量底物（即脂肪酸和/或氨基酸）的代谢，最终导致ROS水平短暂升高，如到为了确定IIS相关寿命延长的ROS依赖部分的潜在共同代谢分母，我们对来自daf-2型线虫和MEF（IRS1−/−和IR+/-）使用深度测序进行转录组分析(). 在分析所有三种模型中持续上调或下调的基因时，我们确定了三个基因功能群(和表S1). 值得注意的是，其中一个上调组是MAP激酶信号通路()与MAP激酶的破坏pmk-1型严重削弱IIS受损的影响，以及ROS水平短暂升高，如.
跨谱转录组分析表明，在胰岛素/胰岛素样生长因子1受损状态下，L-脯氨酸分解代谢增加是对葡萄糖代谢降低的一种延长寿命的反应通过深度测序分析量化的差异表达基因（A）
daf-2型线虫，（B）IRS1−/−MEF和（C）IR+/−MEF，均与各自的控制相比较；黑色圆点表示没有差异调节，红色和绿色圆点表示仅根据一种统计方法进行调节。蓝色圆点表示根据这两种统计方法（用于进一步分析）的规定。（D）下调和上调基因的功能组（三组中至少有两组的临界值：p=0.05）。有关详细信息，请参见表S1.（E）来源于daf-2型线虫、IRS1−/−MEF和IR+/−MEFs（所有三组的截止值：p=0.05）。有关详细信息，请参见.（F）暴露于对照RNAi（空圈）和daf-2型RNAi（填充三角形）与暴露对比B0513.5型RNAi（闭合圈）单独和与daf-2型RNAi（分别为空三角形）。（G）暴露于L-脯氨酸（填充三角形）或溶剂（空圈）的N2线虫寿命分析。（H）的表达式B0513.5/产品mRNA的缺失（白色条）和存在（黑色条）daf-2型在野生型（N2）和aak-2型突变线虫。（一）用对照RNAi（白条）或daf-2型RNAi（黑条），以及针对B0513.5/产品（灰色/条纹条），全部处理48小时后。（J）线虫经RNAis处理后的ROS水平（一）48小时；mev-1（kn1）突变体和百草枯处理1h作为阳性对照。面板I和J中描述了相对值；有关绝对值，请参见图S4在面板中，H J值以平均值±SD的形式给出。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与相应的对照组相比。（K）胰岛素/胰岛素样生长因子1受损促进L-脯氨酸分解代谢，利用活性氧作为线粒体第二信使，最终延长寿命：IIS受损导致秀丽线虫，导致间歇性能量不足，通过增加L-脯氨酸分解代谢激活线粒体呼吸aak-2型依赖方式。线粒体呼吸的这种诱导产生了一个短暂的ROS信号，PMK-1和SKN-1感应到该信号，继而引起适应性反应，以增加超氧化物歧化酶和过氧化氢酶各自的活性，从而最终终止最初的ROS信号，同时导致应激抵抗力增强，延长了应激反应的持续时间秀丽线虫寿命。
线粒体L-脯氨酸分解代谢延长了IIS状态下的寿命并降低了葡萄糖可用性
通过使用RNAseq，我们还发现短链有机酸的代谢在IIS受损状态下上调。尤其是，技术-6（编码烯醇辅酶A水合酶6）/技术1（编码烯醇辅酶A水合酶，短链，1，线粒体）反映了脂肪酸和氨基酸分解代谢的检查点，发现在所有三种模型中均上调(和). 为了以跨谱方式更好地定义导致受损IIS影响的基因，我们对所有三个模型进行了Venn分析(和). 在小鼠和蠕虫中与受损IIS影响有关的基因中(和S1（第一阶段）)揭示了编码L-脯氨酸脱氢酶的同源基因对(小M.muscusus：触头,秀丽线虫：B0513.5). 这种酶对一种单一氨基酸L-脯氨酸的分解代谢至关重要，使其可用于线粒体氧化和基于氧化磷酸化的非葡萄糖基能量生成。
表2
从三种胰岛素受损/IGF1信号传导模型中获得的差异表达RNA（所有三组的截止值p=0.05）
| 差异表达基因，上调 |
|---|
| 秀丽线虫基因 | daf-2型log2折叠 | daf-2型p值 | M.肌肉基因 | 基因名称 | IRS1系统−/−log2折叠 | IRS1系统−/−p值 | 红外+/−log2折叠 | 红外+/−p值 |
|---|
| F25B4.8页 | 1.629 | 2012年3月12日-06日 | Cenpv公司 | 着丝粒蛋白V | 2.277 | 8.758电子16 | 3.681 | 6.070E-15日 |
| Y71G12B.11型 | 1.396 | 2.906E-11号 | Tln2号机组 | 塔利班2 | 0.438 | 6.274E-06号机组 | 1.738 | 1.656E-18型 |
| bicd-1型 | 0.710 | 0.0007230 | 比克1 | 双耳D同源物1（果蝇） | 1.883 | 3.091年第23页 | 0.972 | 3.731E-05号 |
| 序列-1 | 1.216 | 0.0001637 | Htr2c型 | 5-羟色胺（血清素）受体2C | 1.326 | 0.0008178 | 3.517 | 3.375E-19页 |
| lec-3型 | 2.469 | 3.536E-26型 | 拉加尔9 | 凝集素，半乳糖结合，可溶性9 | 1.593 | 2.012E-43型 | 0.698 | 0.0009901 |
| lec-5型 | 2.622 | 1.051至28 | | | | | | |
| lec-4型 | 1.466 | 1.166E-11号机组 | | | | | | |
| lec-1型 | 0.776 | 5.248E-05号 | | | | | | |
| B0513.5号 | 0.731 | 0.0020163 | 普罗德 | 脯氨酸脱氢酶 | 3.228 | 5.120E-32页 | 1.758 | 1.245E-06 |
| 技术-6 | 0.650 | 0.0006435 | Echs1号机组 | 烯酰辅酶A水合酶，短链，1，线粒体 | 0.563 | 1.288E-07号 | 0.606 | 0.0044002 |
| 实验-2 | 2.264 | 2.368E-12型 | 千立方英尺1英寸 | 钾电压门控通道，F亚家族，成员1 | 1.280 | 6.495E-13号机组 | 0.966 | 0.0050530 |
| Y55F3C.3型 | 0.995 | 0.0006997 | | | | | | |
| C32C4.1型 | 1.121 | 0.0016399 | | | | | | |
| F44A2.2型 | 1.492 | 0.0002509 | | | | | | |
| Y48A6B.6型 | 1.078 | 0.0052666 | | | | | | |
| 千伏-1 | 0.931 | 0.0065899 | | | | | | |
| prk-2型 | 1.956 | 1.115E-10号机组 | 像素1 | 前病毒整合位点1 | 0.535 | 0.0035235 | 0.818 | 0.0015448 |
| ras-1型 | 1.498 | 2.272E-06号 | 拉萨2 | 相关RAS病毒（r-RAS）癌基因同源物2 | 0.398 | 4.561E-05 | 0.575 | 0.0052454 |
| 钙-2 | 1.365 | 6.083电子-05 | 汽车10 | 碳酸酐酶10 | 1.886 | 6.360电子17 | 1.159 | 0.0058154 |
| 钙-1 | 0.947 | 0.0041779 | | | | | | |
| Y73B6BL.19号机组 | 2.105 | 8.671E-10年 | Kcnd2公司 | 钾电压门控通道，Shal相关家族，成员2 | 1.659 | 5.739E-08号机组 | 1.186 | 0.0218384 |
| C27F2.1型 | 1.572 | 1.122E-05号 | 第60周 | WD重复域60 | 1.057 | 2.887E-22号机组 | 0.527 | 0.0249645 |
| egl-3 | 1.162 | 1.113E-08 | 2个 | 前蛋白转化酶枯草杆菌素/可欣2型 | 1.478 | 3.103至05 | 1.194 | 0.0296169 |
| epac-1型 | 2.081 | 6.325E-08号 | 猛禽4 | Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）4 | 0.648 | 0.0040905 | 0.877 | 0.0298008 |
| 不包括5 | 1.032 | 9.899E-06年 | 预测值3 | FYVE、RhoGEF和PH域包含3 | 1.764 | 1.718E-56页 | 0.443 | 0.0400597 |
| T03G6.3型 | 2.356 | 2.263E-21号机组 | 英语6 | 外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶6 | 1.473 | 0.0001826 | 1.316 | 0.0482077 |
| F47F2.1层 | 0.727 | 0.0091527 | Prkx公司 | 蛋白激酶，X连锁 | 0.372 | 0.0038382 | 0.454 | 0.0373704 |
| ceh-31 | 2.777 | 1.650E-09型 | 棒材2 | BarH-like 2（果蝇） | Inf公司 | 0.0201619 | Inf公司 | 0.0469553 |
| ceh-30型 | 1.530 | 8月221E-05日 | | | | | | |
| 浴缸-2 | 0.428 | 0.0269801 | Tulp4型 | 类似于mKIAA1397蛋白；管状蛋白4 | 0.2171 | 0.0137626 | 0.410 | 0.0445156 |
| 差异表达基因，下调 |
| 秀丽线虫基因 | daf-2型log2折叠 | daf-2型p值 | M.肌肉基因 | 基因名称 | IRS1系统−/−log2折叠 | IRS1系统−/−p值 | 红外+/−log2折叠 | 红外+/−p值 |
| 核素-1 | −1.880 | 2.085E-11号机组 | 德纳赛亚 | Dnase2a脱氧核糖核酸酶IIα | −0.581 | 0.0006621 | −0.643 | 0.0181585 |
| F35G2.1层 | −0.758 | 0.0243548 | Qsox1号机组 | 静止蛋白Q6巯基氧化酶1 | −0.323 | 0.0091651 | −0.851 | 0.0002569 |
| M01F1.9型 | −0.911 | 0.0050494 | Rgp1型 | RGP1逆行高尔基体转运同源物（酿酒酵母） | −0.366 | 0.0035610 | −0.567 | 0.0262451 |
| C01B10.9号机组 | −0.696 | 0.0435967 | 英语4 | 外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶4 | −1.539 | 8.893E-17号机组 | −2.300 | 8.870电子-20 |
| T13C2.4标准 | −1.075 | 0.0006532 | 苏72 | Ssu72 RNA聚合酶II CTD磷酸酶同源物（酵母） | −0.515 | 0.0000335 | −0.521 | 0.0430715 |
| F53F10.3层 | −0.716 | 0.0367228 | Brp44型 | 脑蛋白44 | −0.633 | 0.0000076 | −0.604 | 0.0313828 |
为了测试L-脯氨酸的分解可能以系统的方式导致受损IIS的影响，我们对野生型和daf-2型带有RNAi的线虫B0513.5号，的秀丽线虫的直系词脯氨酸脱氢酶基因而该基因的敲除对N2野生型蠕虫的寿命没有影响()RNAi的寿命延长能力(daf-2型)添加RNAi后分别减少了14.6%和20.3%（平均寿命和最大寿命(B0513.5号) ().
此外，我们用生长介质中的氨基酸L-脯氨酸处理野生型N2线虫，以测试增加的L-脯氨酸可用性是否能够延长寿命。如所示，其寿命确实增加了5.8%和13.6%（平均寿命和最大寿命）。因此，虽然B0513.5号野生型蠕虫的寿命离不开表达()，补充L-脯氨酸可以在有限但显著的程度上延长寿命().
额外测试AAK-2()负责在IIS状态下诱导L-脯氨酸代谢，我们量化了B0513.5/产品在没有和存在daf-2 RNAi的情况下，N2和aak-2突变体的mRNA表达。诱导B0513.5号表达在年被废除aak-2型突变体()表明AAK-2激活位于PRODH上游。此外daf-2型RNA干扰()通过与RNAi联合治疗B0513.5号(). 同样，RNAi对抗B0513.5号消除了ROS信号()最初被证明是由daf-2型RNA干扰().
总之，这些发现表明，受损的IIS降低了葡萄糖代谢并以代偿方式诱导L-脯氨酸分解代谢，最终导致短暂的ROS信号和延长寿命，总结如下.
实验程序
秀丽线虫菌株、维持和寿命分析
秀丽线虫本研究中使用的菌株由Caenorhabditis遗传学中心（明尼苏达大学）提供。维护和同步(Lithgow等人，1995年)以及RNAi治疗和寿命分析(Dillin等人，2002年;Schulz等人，2007年)如前所述，在缺乏5′-氟尿苷的情况下进行。这个B0513.5号RNAi克隆来自Ahringer文库（来源：英国诺丁汉生物科学），草皮-3和ctl-2型RNAis来自ORF-RNAi库（OpenBiosystems Inc.，Lafayette，CO，USA）和daf-2型RNAi克隆是Cynthia Kenyon的一份礼物(Dillin等人，2002年). NAC和BHA（均为Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）分别溶解在水中（NAC，500倍储备溶液，500 mM）和DMSO（BHA，1000倍储备溶液（25 mM））。在实验开始之前，线虫（野生型布里斯托尔N2和相应的突变体）在含有抗氧化剂或相应溶剂的琼脂平板上繁殖四代。对于L-脯氨酸（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）补充实验，将氨基酸作为5 mM水溶液添加到50°C的高压灭菌琼脂中，以获得5μM的最终浓度。
IRS1−/−MEF的培养条件
如前所述，IRS1−/−MEF和对照成纤维细胞来源于来自同一母亲的两个不同、基因不同的胎儿(Brüning等人，1997年)并保存在含有10 mM D-葡萄糖和10%（v/v）胎牛血清（德国柏林Biochrom AG）的Dulbeccos改良Eagle培养基（DMEM）（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）中。
IR+/-MEF的产生和培养条件
IRloxP突变的小鼠纯合子(Brüning等人，1998年)用杂合子小鼠进行繁殖，以获得三苯氧胺诱导的Cre重组酶（CreERT2，Taconic Farms Inc.，Hudson，NY，USA）(Seibler等人，2003年))，并且MEFs是从IRloxP和CreERT2均为杂合子的单个胎儿中获得的。然后细胞继续传代并经历危机，所有这些都遵循先前描述的方案(Brüning等人，1997年). 然后将细胞校准并冷冻，进一步用作对照成纤维细胞。将这些成纤维细胞的一等分之一暴露于浓度为1μM的三苯氧胺（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）中7天，以获得胰岛素受体的杂合性破坏。所有细胞在含有10 mM D-葡萄糖和10%（v/v）胎牛血清（德国柏林Biochrom AG）的Dulbeccos改良Eagle培养基（DMEM）（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）中保存和分析。MEF在37°C、5%CO的增湿环境中培养2.
百草枯抗逆性试验（秀丽线虫）
如前所述，对百草枯引起的致命氧化应激的耐受性进行了测定，并进行了轻微修改(Schulz等人，2007年). 六天（L4之后）的N2和daf-2（e1370）将线虫手动转移到含有10 mM百草枯（Acros Organics，Geel，Belgium）的新鲜NGM平板上，用热灭活的OP50草坪（65°C水浴中30分钟）点缀，然后每天测定存活率，直到所有线虫死亡。如生命周期分析所述，蠕虫在内部孵化、爬行和破裂的情况下被视为已被审查。
百草枯抗应激试验（成纤维细胞）
将100000个细胞接种到12孔板的每个孔中（瑞士特拉萨丁根TPP AG）。24小时后，将培养基改为DMEM（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA），其含有10mM D-葡萄糖和补充有1mM百草枯（Acros Organics，Geel，Belgium）的10%（v/v）胎牛血清（Biochrom AG，Berlin，Germany）。48 h后，通过碘化丙啶（PI）（10μg/ml）和Hoechst 33258（10μg/ml）（均为Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）双重荧光染色测定细胞死亡。细胞在荧光显微镜下进行检查（Axiovert 100，Zeiss，Oberkochen，Germany），并用数码相机拍照（Fuji FinePix S602，Tokyo，Japan）。
2-脱氧葡萄糖摄取分析
线虫在含有500μM未标记2-脱氧葡萄糖（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）和2.5μCi/ml均匀的S-培养基中培养14C-标记的2-脱氧葡萄糖（GE Healthcare Little Chalfont，UK），洗涤五次，然后超声处理并离心。使用Beckman LS6000液体闪烁计数器（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）对上清液中的放射性进行定量。将等分样品用于蛋白质测定以进行归一化。
ATP和AMP的测定是为秀丽线虫-如前所述，通过HPLC进行衍生样品(Schulz等人，2007年)稍作修改。为了量化成纤维细胞中的ATP含量，根据制造商的说明使用CellTiter Glo试剂盒（Promega，Fitchburg，WI，USA），并将ATP值标准化为蛋白质含量。
呼吸分析使用Clark型电极进行秀丽线虫(Schulz等人，2007年)和哺乳动物细胞(Ristow等人，2000年).
线粒体活性氧水平
ROS测量前MitoTracker Red CM-H2X ROS（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）培养板的制备如下。对于每个治疗，将500μl热灭活OP50（65°C，30分钟）与100 ul MitoTracker Red CM-H混合2X储备溶液（100μM），并在大的NGM琼脂平板上斑点，使其干燥约1小时。将线虫与适当的RNAis一起孵育一段时间，如图所示，然后用S-Basal冲洗平板，并通过重力沉降以去除后代。用S-Basal再清洗蠕虫两次，然后离心（300g，30秒）。将蠕虫颗粒转移到新制备的MitoTracker Red CM-H2X中，并在20°C下培养2 h。为了去除肠道中过量的染料，将蠕虫转移到含有适当RNAis的NGM琼脂平板上，或作为阳性对照，转移到含有10 mM百草枯的平板上，在20°C下再放置1小时。将等分的100μl蠕虫悬浮液分配到96周的FLOOTRAC中TM（TM）平板（德国弗里肯豪森Greiner Bio-One）。使用良好扫描模式（例如：570 nm，em:610 nm），在微孔板阅读器（德国奥芬堡BMG Labtech的FLUOstar Optima）中测量荧光强度。为了使荧光信号正常化，剩余的蠕虫悬浮液用于蛋白质测定。为了测量成纤维细胞的线粒体活性氧水平，将10000个细胞接种到96周板的每个孔中。24小时后，用含有1μM MitoTracker Red CM-h的培养基培养细胞2X ROS 30分钟。然后用PBS清洗细胞两次，并在上述相同条件下测量荧光强度。
基于Amplex Red的上清液过氧化氢定量（秀丽隐杆线虫）
用pH值为7.4的0.05M磷酸钠缓冲液将蠕虫从平板上取出，清洗两次，然后转移到垂直的有机玻璃圆筒（1.5 ml体积）中，在20°C下以低速（100 rpm）持续搅拌。首先，仅在1μM Amplex Red（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）存在的情况下，在不使用辣根过氧化物酶（HRP）（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）的情况下进行荧光测定，以检测荧光可能的非特异性增加（未观察到）。接下来，添加0.01 U/ml HRP，并使用荧光检测器（LF402 ProLine，IOM，Berlin，Germany）在分别为571 nm和585 nm的激发和发射波长下记录荧光变化至少15分钟。随后，立即移除蠕虫并收集其进行蛋白质测定，以使荧光值正常化。为了测定成纤维细胞中过氧化氢的产生，将10000个细胞接种到96孔板的每个孔中。24小时后，根据制造商的说明进行Amplex红试验。使用良好扫描模式（例如：570 nm，em:590 nm），在微孔板阅读器（德国奥芬堡BMG Labtech的FLUOstar Optima）中测量荧光强度。
线粒体的分离
如前所述分离线粒体(Kayser等人，2001年)除了线虫的最初破裂是由Potter/Elvehjem组织研磨机以400 rpm的速度进行的，有3次缓慢的上下冲程。将50μg分离的线粒体转移到直立的有机玻璃圆筒（1.5 ml体积）中，并在30°C下以低速（100 rpm）持续搅拌。由于Amplex Red氧化引起的荧光增加的测量完全如上所述进行（对于整个蠕虫），而仅使用0.1U/ml辣根过氧化物酶。同时添加2.5 mM丙酮酸和1.25 mM苹果酸（最终浓度）作为呼吸链底物。
抗氧化酶活性如前所述，线虫和MEF中的（SOD，CAT）通过标准光度分析测定(Schulz等人，2007年)稍作修改。
荧光显微镜
用MitoTracker红CM-H2X ROS完全如上所述。将单个蠕虫放在琼脂糖垫上，并用1 mg/ml的四咪唑使其瘫痪（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。使用滤光片组（BP546/12、FT580、LP590）在荧光显微镜（Axiovert 100，Zeiss，Oberkochen，Germany）下检查蠕虫，并使用数码相机（Moticam 2300，Motic，中国厦门）拍摄照片。
蛋白质含量在线虫和MEF中都是按照前面描述的标准方法测定的(Schulz等人，2007年)经过小的修改。
秀丽线虫和成纤维细胞总RNA的提取
根据制造商的说明，使用基于酚-氯仿提取方法的商用试剂盒（德国希尔登市齐根试剂盒，Rneasy Mini试剂盒）进行RNA分离。
实时PCR
根据制造商关于LightCycler 480系统（德国曼海姆罗氏）的说明，使用GoTaq 2步RT-qPCR系统（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）进行反转录和定量实时PCR。数据标准化为cdc-42(Hoogewijs等人，2008年)并使用ΔΔC进行分析T型方法。用于B0513.3和cdc-42的引物序列为：fwd 5′AAGCCAGCGCGATGACAC和rev 5′AACACCTGCCGCCGATCTC，以及fwd 5'CTGCTGGACAGGAAGATTACG和rev 5'CTCGGACATTCGAATGAAG。
使用深度测序进行转录组分析
对于文库制备，按照制造商的指示，使用Illumina的mRNA-Seq样品制备试剂盒（Illuminia；圣地亚哥；加利福尼亚州，美国）处理每个样品5μg的总RNA。使用Illumina GAIIx，以单个76 nt读取方法对这些库进行测序。每个库在一条通道上进行排序，每个样本的读取量约为30-4000万次。序列数据以FastQ格式提取并用于绘图。将通过质量筛选的读取映射到秀丽线虫使用Bowtie建立基因组和外显子连接剪接数据库(Langmead等人，2009年). 只有唯一映射的读取被用于计数。RefSeq注释用于为外显子、转录物和基因指定映射位置。本出版物中讨论的数据保存在NCBI的基因表达总览中，可通过GEO系列登录号GSE36041访问(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE36041).
统计分析
除非另有说明，否则数据表示为平均值±SD。除寿命和抗应力分析外，所有数据的统计分析秀丽线虫由Student的t吨-在测试数据集内数据的均匀分布和方差相等后进行测试（非成对，双尾）。为了比较寿命分析和抗应激分析中不同组之间的显著分布，使用对数秩检验进行了统计计算。所有计算均使用Excel 2007（Microsoft，Albuquerque，NM，USA）和SPSS 13.0版（IBM，Armonk，NY，USA”）进行。低于0.05的P值被认为具有统计学意义。
