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科学代表。2016; 6: 24618.
在线发布2016年4月20日。 数字对象标识：10.1038/srep24618
预防性维修识别码：第8387354页
PMID：27094951

低氧诱导因子脯氨酰羟化酶1（PHD1）缺乏促进小鼠肝脏脂肪变性和肝脏特异性胰岛素抵抗

阿曼丁·托马斯,1,2 伊丽莎·贝莱迪,1,2 朱迪思·阿伦·维斯纽斯基,三，4,5 Gerard C.van der Zon公司,6 帕特里克·利维,1,2 卡琳·克莱门特,三，4,5 Jean-Louis Pepin女士,1,2 黛安·戈丁·里布特,1,2和布鲁诺·吉加斯a、，6,7
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摘要

肥胖与局部组织缺氧和代谢组织中低氧诱导因子1α（HIF-1α）升高有关。脯氨酸羟化酶（PHD）在调节HIF-α亚型稳定性中起着重要作用。在本研究中，我们研究了全身PHD1基因的后果(Egln2号机组)小鼠代谢稳态失活。在基线时，与年龄匹配的野生型（WT）小鼠相比，PHD1−/−小鼠表现出更高的白色脂肪组织（WAT）质量，尽管体重较低，并且胰岛素敏感性和糖耐量受损。当喂食合成低脂饮食时，与WT小鼠相比，PHD1−/−小鼠也表现出更高的体重增加和WAT质量，以及葡萄糖不耐受和全身胰岛素抵抗。PHD1缺乏导致糖酵解基因表达、脂肪生成蛋白ACC和FAS、肝脂肪变性和肝特异性胰岛素抵抗增加。此外，PHD1−/−小鼠的肝脏中炎症基因标记物也增加，但WAT或骨骼肌中没有增加。正如预期的那样，高脂肪饮食（HFD）促进了WT小鼠的肥胖、肝脂肪变性、组织特异性炎症和全身胰岛素抵抗，但在PHD1−/−小鼠中，这些饮食诱导的代谢改变并未加剧。总之，PHD1缺乏会促进肝脏脂肪变性和肝脏特异性胰岛素抵抗，但不会加重HFD对代谢稳态的有害影响。

肥胖被认为与代谢器官的某种程度的缺氧有关，尤其是白色脂肪组织（WAT）1,2氧张力显著降低（pO2)确实在不同肥胖小鼠模型的不同脂肪垫以及超重和肥胖受试者的皮下WAT中报告了三尽管这一后来的观察结果仍有待讨论4.缺氧可能与WAT炎症有关5并在肥胖诱导的代谢功能障碍中发挥主要作用，至少部分是通过损害脂肪细胞胰岛素敏感性6,7在机制水平上，WAT缺氧促进低氧诱导转录因子（HIFs）基因和蛋白表达的增加8HIF是由构成HIF-β核亚单位和O的三种亚型之一组成的异二聚体2-调节HIF-α细胞溶质亚单位，即HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α9,10HIF-α的表达和转录活性受到抑制HIF（FIH）的氧敏感因子和脯氨酰羟化酶（PHD）家族成员的严格调节9,10PHD是进化保守的双加氧酶，需要氧和2-氧戊二酸作为共底物，铁和抗坏血酸作为辅助因子，用于HIF-α上特定脯氨酸残基的羟基化。已在哺乳动物中鉴定出三种PHD亚型（PHD1、PHD2和PHD3），并在大多数组织中普遍表达9,10，尽管它们在控制HIF-α亚型组织特异性水平中的各自作用仍有待阐明11在常氧条件下，PHD充当氧敏感酶并促进HIF-α亚基的羟基化，允许蛋白质von Hippel-Lindau（pVhl）泛素连接酶复合物识别并随后降解蛋白酶体9,10相反，缺氧期间PHD活性降低，导致HIF-α亚单位稳定，随后转移到细胞核，在那里它们可以与HIF-β二聚体，随后触发特定靶基因的转录12在各种HIF中，HIF-1转录因子似乎在肥胖相关的胰岛素抵抗和代谢障碍中起着主要作用，尤其是通过促进趋化因子/脂肪因子的表达和分泌、促炎性巨噬细胞的招募和缺氧WAT中T细胞的积聚2相反，据报道，药物或基因抑制HIF-1α可减少高脂肪饮食诱导的代谢障碍13,14,15,16,17脂肪组织纤维化和炎症减弱13减少肝脏脂肪变性14总之，这表明代谢组织中HIF-1转录活性的调节可能与缺氧和肥胖相关的代谢改变有关。已开发出各种用于三种PHD亚型的全身和组织特异性失活的基因工程小鼠模型18,19,20但这种缺陷对全身代谢稳态的确切影响尚不清楚1目前没有PHD1缺乏小鼠的数据。

在本研究中，我们旨在研究PHD1基因组成性失活的后果(Egln2号机组)是HIF-PHD氧敏感途径的关键组成部分之一，对低脂（LFD）和高脂（HFD）饮食中的肥胖、全身葡萄糖稳态和组织特异性胰岛素敏感性均有影响。

结果

PHD1缺乏损害全身代谢稳态

我们首先确定了PHD1基因构成性缺失对其他PHD亚型和HIF-1靶基因表达的影响利达肝脏、附睾白色脂肪组织（eWAT）和骨骼肌(图S1). 正如预期的那样，完整长度的表达式Egln2号机组在每个组织中都检测不到编码活性PHD1蛋白的mRNA。在肝脏中埃及3观察到（PHD3）(图S1A)，同时上调出口1（PHD2）和下调出口3在eWAT中得到证明(图S1B). 无影响Egln2号机组在骨骼肌中检测到其他PHD亚型表达的（PHD1）缺失(图S1C)，与之前的报告一致21.的表达式利达，一个HIF靶基因，在PHD1缺乏小鼠的肝脏和WAT中升高，表明这些组织中HIF转录活性增加(图S1A、B).

为了研究PHD1对全身代谢稳态的作用，首先比较了12周龄PHD1缺乏（PHD1−/−）小鼠和正常饮食的WT对照小鼠。PHD1−/−小鼠的体重和肝脏重量较低（分别为−8%和−18%；p<0.05；图1A、B)附睾和皮下脂肪组织重量较高（分别为+83%和+58%；p<0.05；图1A、B)与WT小鼠相比，表明PHD1控制肥胖。与体重下降相关，PHD1−/−小鼠的平均每日食物摄入量也低于WT小鼠(图1C). 尽管体重减轻，PHD1缺乏与空腹血浆甘油三酯（TG）升高相关(图1D)，葡萄糖(图1F)和胰岛素(图1G)而总胆固醇（TC）没有变化(图1E). 与WT小鼠相比，PHD1−/−小鼠计算的HOmeostasis模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）评估（针对啮齿动物调整）增加(图1H)提示全身胰岛素抵抗。为了评估PHD1缺失对全身葡萄糖稳态和胰岛素敏感性的影响，接下来分别对小鼠进行腹腔内葡萄糖试验（GTT）和胰岛素耐受性试验（ITT）。与HOMA-IR增加一致，PHD1−/−小鼠表现出全身糖耐量受损(图1I–K)和胰岛素敏感性(图1L、M)与WT小鼠相比。

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PHD1缺乏导致标准喂养小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。

体重(A类)在12周龄的WT（开放栏）和PHD1−/−（黑栏）小鼠的标准饮食中，在牺牲时测量肝脏、附睾白色脂肪组织（eWAT）和皮下白色脂肪组织的重量(B类). 每日食物摄入量(C)监测时间为5周。空腹血浆甘油三酯(D类)，总胆固醇(E类)，葡萄糖(F类)和胰岛素(G公司)在6小时未喂食的小鼠和HOMA-IR中测定水平(H（H）)已计算。对6小时未喂养的小鼠进行腹腔内葡萄糖耐量试验（ipGTT，2 g/kg体重）。在指定的时间点测量血糖水平(我)计算葡萄糖漂移曲线的AUC，作为全身糖耐量的替代物(J型). 在15分钟时测量ipGTT期间的血浆胰岛素水平(K（K）). 在4小时未喂养的小鼠中进行了腹腔内胰岛素耐受试验（0.5 U/kg总体重）。在指定的时间点测量血糖水平(我)计算葡萄糖漂移曲线的AUC作为全身胰岛素敏感性的替代物(M（M）). 数据为平均值±SEM（WT为n=7；对于PHD1−/−，n=13）。#p<0.05与WT小鼠。

PHD1缺乏可促进体重和脂肪增加、血脂异常和葡萄糖不耐受，但不会加重HFD诱导的代谢改变

为了进一步研究PHD1缺失对代谢稳态的影响，接下来用合成低（LFD，10%kcal来自脂肪）或高（HFD，60%kcal从脂肪）饮食对WT和PHD1−/−小鼠进行12周的挑战。与WT小鼠相比，喂食LFD 12周的PHD1−/−小鼠体重增加、肝脏和脂肪质量增加(图2A-C)尽管每天的食物摄入量相似(图2D). 与常规饮食的观察结果一致，与WT小鼠相比，喂食LFD的PHD1−/−小鼠的空腹血浆TG和胰岛素水平以及HOMA-IR显著升高(图2E、H、I)表明全身代谢稳态受损。此外，与WT小鼠相比，经腹腔注射GTT后，LFD喂养的PHD−/-小鼠的葡萄糖耐量增加，血浆胰岛素水平升高(图2J–L). 值得注意的是，在6周的合成饮食后，已经观察到不同基因型之间体重增加、血浆参数和全身代谢稳态的差异(图S2). 总的来说，这些结果表明，与WT小鼠相比，LFD上的PHD1−/−小鼠保持着不利的代谢表型。

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PHD1缺乏可促进体重增加和胰岛素抵抗，但不会加重高脂肪饮食诱导的代谢改变。

WT（开放条形）和PHD1−/−（黑色条形）小鼠喂食低脂（LFD，10%脂肪）或高脂肪（HFD，45%脂肪）饮食12周。在整个实验期间监测体重(A类). 饮食开始时体重的Delta（Δ）变化(B类)，肝脏、附睾（eWAT）和皮下（scWAT）白色脂肪组织以及骨骼肌（Sk.）的重量(C)在第12周献祭后测量。平均每日食物摄入量(D类)记录时间为12周。第12周，血浆甘油三酯(E类)，总胆固醇(F类)，葡萄糖(G公司)和胰岛素水平(H（H）)在6小时未喂食的小鼠和HOMA-IR中测量(我)已计算。在第11周对6小时未喂养的小鼠进行腹腔内GTT（2 g/kg总体重）。在指定的时间点测量血糖水平(J型)，并计算葡萄糖漂移曲线的曲线下面积（AUC），作为葡萄糖耐受性的测量(K（K）). 在15分钟时测量ipGTT期间的血浆胰岛素水平(我). 数据为平均值±SEM（LFD-WT的n=4；LFD-PHD1−/−的n=7；对于HFD-WT，n=5；对于HFD-PHD1−/−，n=7）*p<0.05与喂食LFD的小鼠，#p<0.05与WT小鼠。

正如预期的那样，喂食HFD 12周的WT小鼠的体重、肝脏和脂肪质量以及空腹血浆TC、葡萄糖和胰岛素水平都有所增加(图2A–H). 与喂食LFD的小鼠相比，HOMA-IR和全身葡萄糖耐量也显著受损(图2I–L). 令人惊讶的是，尽管HFD也促进PHD1−/−小鼠的代谢改变，但饮食对这些小鼠全身葡萄糖稳态的影响似乎有所减弱。事实上，喂食HFD的PHD1−/−小鼠的空腹血糖水平显著降低(图2G)以及更好的葡萄糖耐受性(图2J、K)而不是WT对手。

PHD1缺乏损害肝脏胰岛素敏感性

为了研究PHD1缺失对全身胰岛素敏感性的影响，对喂食LFD和HFD的WT和全身敲除小鼠进行了腹腔内ITT。与WT小鼠相比，LFD喂养的PHD1−/−小鼠对胰岛素的低血糖反应受损(图3A、B)，反映了系统性胰岛素抵抗。在平行实验中，在注射胰岛素10分钟后采集代谢组织（肝脏、eWAT和骨骼肌），通过Western blot评估组织特异性胰岛素敏感性。值得注意的是，与LFD上的WT小鼠相比，PHD1−/−小鼠肝脏中胰岛素诱导的蛋白激酶B（PKB）磷酸化显著降低(图3C、D)而在eWAT和骨骼肌中未观察到显著影响(图3E–H)表明LFD喂养的PHD1−/−小鼠的系统胰岛素敏感性改变主要是由于肝脏胰岛素抵抗。当受到HFD影响时，WT和PHD−/−小鼠都出现了系统性和肝脏胰岛素抵抗，但两种基因型之间没有观察到显著差异(图3A–H). 由于在eWAT和PHD1小鼠骨骼肌中典型的胰岛素信号通路未受损，我们接下来研究了AMP-activated protein kinase（AMPK）信号通路是否在这些组织中受到影响，AMPK信号通路是一种参与葡萄糖稳态外周调节的胰岛素依赖性通路。在骨骼肌中，通过pThr172-AMPKα/AMPKα比率评估的AMPK活性，在HFD组PHD1−/−小鼠的骨骼肌中显著高于WT组小鼠，而在LFD组小鼠中没有发现差异(图S3A–D). 与此相一致，AMPK的主要下游靶点之一乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的磷酸化状态也发生了类似的变化(图S3A、E、F). 值得注意的是，无论营养状况如何，在PHD1−/−小鼠的骨骼肌中，AMPKα和ACC的蛋白表达分别增加和减少(图S3A–G). 在eWAT中，与WT小鼠相比，喂食LFD和HFD的PHD1−/−小鼠的AMPK活性更低(图S4A–D). 正如预期的那样，HFD降低了两种基因型ACC和脂肪酸合成酶（FAS）的蛋白表达，但发现与WT小鼠相比，喂食LFD的PHD1−/−小鼠的ACC和FAS的蛋白表达显著降低(图S4E、F). 值得注意的是，与脂肪组织生物学有关的关键基因的mRNA水平在WT和PHD1−/−小鼠的eWAT中具有可比性(图S4G)，除了以下明显的例外勒普（瘦素）和Ucp1单位PHD1缺乏小鼠的脂肪含量明显较高，与在这些小鼠中观察到的较大脂肪量一致。此外，PHD1缺陷不会影响LFD喂养小鼠eWAT中炎症基因的表达(图S4H).

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PHD1缺乏导致全身和肝脏特异性胰岛素抵抗。

在低脂饮食（LFD，正方形）或高脂饮食（HFD，圆形）11周后，对6小时未喂食的WT（开放符号/条）和PHD−/−（黑色符号/条状）小鼠进行腹腔内ITT（0.5 U/kg总体重）。在指定的时间点测量血糖水平(A类)并计算葡萄糖漂移曲线的AUC作为胰岛素抵抗的测量值(B类). 在单独的实验中，在注射胰岛素15分钟后处死小鼠，并通过Western blot研究肝脏、eWAT和骨骼肌（Sk.M）中的组织特异性胰岛素信号。代表性斑点如所示(C、 E、G). 进行密度定量，结果表示为相对于WT-LFD小鼠的倍数变化(D、 F、H). 数据为平均值±SEM（LFD-WT的n=4；LFD-PHD1−/−的n=7；对于HFD-WT，n=5；对于HFD-PHD1−/−，n=7）*p<0.05与LFD小鼠，#p<0.05与WT小鼠。

PHD1缺乏促进肝脏脂肪变性和肝脏炎症

肝胰岛素抵抗通常与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）相关，其特征是肝脏中TG的炎症和异位积聚。引人注目的是，服用LFD的PDH1−/−小鼠表现出明显的脂肪变性，肝胆固醇和TG含量显著升高(图4A-C). 这与脂肪生成酶ACC和FAS的基因和蛋白表达增加有关(图4D–G)与WT小鼠相比。值得注意的是，与WT小鼠相比，常规饮食的PDH1−/−小鼠中也发现了类似的脂肪基因表达增加(图S5). 有趣的是，参与糖酵解的关键基因在PDH1−/−小鼠的肝脏中的表达也上调(图4H). 此外，在喂食LFD的PHD1−/−小鼠的肝脏中观察到一些炎症基因标记物的高表达(图4I). 正如预期的那样，HFD增加了WT小鼠的肝脏胆固醇和TG水平，同时肝脏相关蛋白的代偿性下调从头开始脂肪生成(图4A-I). 然而，在HFD小鼠中，WT和PHD1−/−小鼠的肝脏脂质组成和脂肪生成蛋白表达均无显著差异，表明HFD诱导的肝脂肪变性不会因PHD1缺乏而加重。

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PHD1缺乏可促进肝脏脂肪变性。

对低脂（LFD）或高脂（HFD）饮食的WT（开放栏）和PHD−/−（黑栏）小鼠的肝脏进行取样(A类)12周后。肝胆固醇(B类)和甘油三酯（TG，C)测定含量。肝TG合成调控关键基因的mRNA表达(斯雷布1：SREBP-1c；阿卡卡：ACC1；Fasn公司：FAS；第1页：SCD1），胆固醇合成(Srebf2型：SREBP2；嗯2：HMGCoA合成酶；嗯：HMGCoA还原酶）和脂肪酸氧化(Ppara公司：PPARα；预测值k4：PDK4；Cpt1a型：CPT-1α；Acox1型：酰基辅酶A氧化酶1）通过RT-qPCR测定(D类). Western blot检测肝ACC和FAS蛋白表达。代表性斑点如所示(E类). 通过密度分析量化总蛋白表达，并表示为相对于WT-LFD小鼠的折叠变化(F、 G公司). HSP90用于内部看家蛋白表达。肝糖酵解关键基因的mRNA表达；Slc2a1：GLUT1公司；Slc2a2，GLUT2公司；盖普，GAPDH公司；Eno1、，烯醇化酶；Pklr公司，PK）和炎症（I；电子邮件1：F4/80；Vsig4：VSIG4；Tnfa：肿瘤坏死因子α；第6页：IL6）通过RT-qPCR测定。所有RT-qPCR结果都是相对于看家基因RPLP0以倍数变化的形式表达的与WT-LFD小鼠。数据为平均值±SEM（LFD-WT的n=4；对于LFD-PHD1−/−，n=7；对于HFD-WT，n=5；对于HFD-PHD1−/−，n=7）*p<0.05与LFD小鼠，#p<0.05与WT小鼠。

总之，我们的结果表明，小鼠体内PHD1缺乏会促进肥胖、肝脏脂肪变性和肝脏特异性胰岛素抵抗，但不会恶化HFD对代谢稳态的有害影响。

讨论

在本研究中，我们报告了小鼠全身PHD1缺失会损害标准饮食或低脂饮食小鼠的系统葡萄糖稳态和胰岛素敏感性，这是一种与肝脏脂肪变性和炎症增加以及肝脏特异性胰岛素抵抗相关的有害代谢表型。然而，PHD1缺乏不会加重HFD对全身胰岛素敏感性和代谢稳态的有害影响。

在我们的条件下，在LFD的PHD1−/−小鼠中，明显参与全身胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受改变的主要代谢组织似乎是肝脏，其中胰岛素信号显著降低。在机制水平上，在喂食LFD的PHD1−/−小鼠中发现糖酵解酶和脂肪生成酶、肝脏脂质含量和炎症标记物均增加。有趣的是，缺氧和PHD-1缺失均被证明激活了炎症前IKKβ/NFkβ的典型途径在体外癌细胞模型22这表明代谢组织中也可能发生类似的改变，这是局部炎症和胰岛素抵抗增加的基础。另一方面，PHD1−/−小鼠肝脏脂肪变性的增加可能是由于从头开始脂肪生成，在参与糖酵解和脂肪生成途径的关键酶的控制下，将糖酵化过程中产生的碳水化合物衍生乙酰辅酶a转化为TG的代谢过程23,24事实上，糖酵解基因和脂肪生成酶ACC和FAS表达的强劲增加可能有助于增强喂食和LFD的PHD1−/-小鼠肝脏中观察到的肝脏TG含量。有趣的是，先前也有报道称，三种PHD亚型的肝脏特异性缺失会导致严重的肝脂肪变性20,25,26虽然在实验条件下，仅删除PHD1或PHD2以及两者的组合（1+2和2+3）似乎不足以促进肝脏TG含量的显著增加20,25,26然而，与我们的结果相反，在三重PHD基因敲除小鼠中，肝脏脂质积累增加与脂肪生成基因mRNA表达减少相关斯雷布1（SREBP-1C）和Fas公司（FAS）而糖酵解基因的表达Slc2a1系列（GLUT1）也同样增加20这些相互矛盾的结果表明，各种PHD特异性下游靶点和/或通路可能参与脂肪肝的发展。

PHD的典型功能是使HIF-α亚基羟基化，导致其被pVhl泛素化，随后被蛋白酶体降解。重要的是，通过HIF-α亚型的过度表达或pVhl的失活，肝脏HIF的持续激活先前已被证明会导致肝脏脂肪变性和炎症27,28,29,30值得注意的是，尽管pVhl的破坏激活HIF并导致HIF-1α和HIF-2α靶基因的上调31,32在该模型中，肝脂肪变性和炎症的诱导似乎完全依赖于HIF-2α29,30确实，肝脏特异性pVhl和pVhl/HIF-1α失活促进了肝脏甘油三酯含量的增加29,30以及促炎性Il6和Il1b基因表达29而pVhl/HIF-2α突变小鼠的表型正常29,30.

肝脏表达所有三个HIF-α家族成员，在全身PHD1−/−小鼠中观察到的代谢障碍，尤其是肝脂肪变性，是否是由特定HIF的稳定引起的，尚待阐明。研究表明，靶向HIF-α亚基的三种PHD亚型之间存在功能冗余11,33这表明PHD单独或联合可能对肝脏中HIF-1α或HIF-2α的调节有所不同。发现在PHD1−/−肝脏的细胞核中，HIF-1α和HIF-2α水平更为丰富，其中HIF-2α是上调最多的同种型34由于缺乏材料，我们无法在本研究中评估这一方面，但HIF-1α特异性靶基因的增加，如Slc2a2公司（GLUT2），利达（乳酸脱氢酶），Eno1公司（烯醇化酶），Pklr公司（L-PK）和出口3（PDH3）35，表明PHD1−/−小鼠肝脏中HIF-1α依赖性代谢重编程促进糖酵解和丙酮酸代谢。总之，各种HIF-α亚型在PHD1−/−全身敲除小鼠代谢表型中的组织特异性各自贡献仍有待更广泛的研究。

虽然肝脏似乎是由全身PHD1−/−缺失引起的代谢紊乱的中心参与者，但我们不能排除控制外周组织营养代谢的关键途径中的其他缺陷也可能发生在其他代谢器官中。例如，PHD1−/−小鼠WAT中ACC和FAS蛋白表达和AMPK活性的降低可能分别导致组织特异性脂肪储存和氧化受损，间接促进肝脏中异位脂肪积聚。有必要进一步研究，以解剖在全身PHD1−/−基因敲除小鼠中观察到的代谢表型的相应组织贡献。

正如预期的那样，当喂食HFD时，WT小鼠出现肥胖、肝脂肪变性和系统性胰岛素抵抗，并且发现这些饮食诱导的代谢障碍在PHD1−/-小鼠中的程度相似，尽管标准饮食中的基线体重和胰岛素抵抗较高。令人惊讶的是，在HFD 6周和12周时，PHD1−/−小鼠的葡萄糖耐量稍有但显著低于WT小鼠。值得注意的是，PHD1−/−小鼠此前曾被报道具有耐缺氧能力，部分是通过代谢重编程导致骨骼肌和肝脏从氧化代谢转变为厌氧/糖酵解代谢21,34HIF-1介导的丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）表达增加抑制丙酮酸转化为乙酰辅酶A及其随后进入线粒体三羧酸循环，被认为是这种代谢适应的机制之一21,36有趣的是，根据这些观察结果，我们还观察到PHD1−/−小鼠肝脏中各种糖酵解基因的表达增加，PDK4 mRNA水平显著升高。总之，与WT小鼠相比，喂食HFD的PHD1−/−小鼠的葡萄糖耐受性更高，这可能是由于肝脏中葡萄糖摄取和氧化增加所致，而肝脏是促进系统葡萄糖稳态的主要代谢组织之一。

在系统水平上，我们的PHD1−/−小鼠在标准食物或LFD上的代谢表型改变与脂肪组织特异性HIF-1激活的小鼠模型中观察到的代谢表型相似。事实上，WAT中HIF-1α组分活性形式的过度表达导致标准饮食小鼠体重增加、脂肪质量增加和全身糖耐量受损37然而，与我们的研究相比，当受到HFD的攻击时，这些小鼠的代谢表型明显恶化，这与WAT中的炎症、纤维化和胰岛素抵抗增加有关37在我们的条件下，我们观察到PHD1−/−小鼠中HFD诱导的WAT炎症有降低的趋势，正如一些促炎症巨噬细胞基因标记物的下调所证明的那样CD68型和ITGAX公司(图S4). 有趣的是，最近的一项研究报告称，PHD2的全身和脂肪组织特异性缺失都可以保护小鼠免受HFD诱导的代谢紊乱的影响18此外，PHD3的肝脏特异性缺失单独或与PHD1或2同时出现，也可改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性20与WT小鼠相比，HFD上脂肪细胞特异性PHD2−/−小鼠的特征确实是脂肪质量和脂肪细胞大小减少，以及WAT中巨噬细胞浸润、促炎细胞因子表达和脂肪生成减少18,19此外，由于脂肪细胞中糖酵解基因的上调，WAT中葡萄糖氧化的增加也可能有助于改善全身葡萄糖稳态18,19HFD诱导的肝糖异生和肝脂肪变性的减少也被认为与这些不同PHD缺乏模型的良好代谢状况有关18,19,20值得注意的是，无论使用何种饮食，我们都未发现两种基因型之间的肝糖原异基因表达有任何显著差异（数据未显示）。总的来说，这种对比结果可能来源于这些不同研究中使用的特定PHD缺失。我们在此展示了全身PHD1缺失的代谢后果，这可能与肝脏特异性缺失诱导的代谢后果不同。例如，可以推测，全身PHD1缺失对代谢稳态的部分有害影响可能仅次于中枢效应，即下丘脑调节外周胰岛素敏感性和营养代谢的改变。一些HIF-α亚型确实在下丘脑不同区域表达38因此，PHD1缺失可能影响参与代谢稳态的关键脑区HIF-α蛋白含量和转录活性。有趣的是，PHD1最近被确定为神经元代谢的调节剂，通过糖酵解和磷酸戊糖途径调节葡萄糖流量39此外，据报道，大脑中的胰岛素信号通过刺激肝脏TG分泌来保护肝脏免受异位脂肪堆积40表明PHD1−/−小鼠中枢胰岛素敏感性的改变也可能导致肝脂肪变性。显然需要进一步研究来调查这些大脑介导的方面。

总之，各种PHD缺失小鼠模型显示的代谢表型差异背后的原因尚不清楚，但可能是由于每个PHD对各种HIF-α亚型的组织特异性控制存在差异和/或冗余。值得注意的是，大多数研究表明，HFD喂养的PHD基因敲除小鼠的代谢稳态得到改善，在这种情况下，我们还观察到与WT小鼠相比，我们的全身PHD1−/−小鼠的葡萄糖耐量有更好的趋势。然而，与我们的研究相比，关于这些动物在LFD或标准饮食中的代谢表型的信息相对较少。最后，需要强调的是，在我们的组成性全身敲除模型中，当PHD1被删除时，我们观察到其他PHD亚型的表达发生了一些组织特异性变化，尤其是在肝脏中。因此，我们不能排除在我们的模型中发现的对代谢稳态的一些有害影响实际上是由于各种代谢组织中PHD亚型的组成（和功能）发生变化而产生的。此外，不能排除除HIF以外的分子，尤其是参与调节细胞葡萄糖和脂质代谢的分子，也可能是PHD的潜在下游靶点，例如通过与氨基末端结构域的直接羟化酶非依赖性相互作用35,36.

总之，我们在此报告，全身PHD1缺乏可促进肝脏脂肪变性和肝脏特异性胰岛素抵抗，但不会恶化HFD对代谢稳态的有害影响。显然，需要利用PHD1的组织特异性和诱导性缺失进行进一步研究，以研究参与代谢稳态调节的器官（包括中枢神经系统）在HIF依赖性或独立性全身胰岛素敏感性和葡萄糖稳态损害中的各自作用。

方法

伦理学

动物实验按照实验动物研究所的《实验动物护理和使用指南》进行，并已获得格勒诺布尔阿尔卑斯大学伦理委员会的批准（协议编号：B3851610006）。

动物和实验设计

第一阶段(Egln2号机组)如前所述，在Peter Carmeliet组（比利时鲁汶VIB）中生成−/−小鼠（瑞士×sv129背景）21和繁殖夫妇被友好地提供用于群体扩张。在本研究中，PHD1−/−小鼠及其野生型（WT）窝鼠在标准条件下被安置在传统笼子中随意食物和水。环境温度保持在20–22°C。在第一个实验中，雄性小鼠被喂食标准的饮食（英国埃塞克斯特殊饮食服务公司RM1），并在10至12周龄时进行研究。在第二组实验中，10周龄的雄性PHD1−/−和WT小鼠在12周内被喂食低脂（10%的能量来自脂肪；D13091501；研究饮食）或高脂肪（60%的能量来自油脂；D1309.1502；研究膳食）饮食。

血浆分析

通过尾静脉出血，在6小时未喂食的小鼠（早上8:00取出食物）中获取血样。使用血糖仪测定血糖水平（OneTouch ultra、Lifescan、Issy-Les-Moulinaux、法国）。分别使用商用酶试剂盒236691、11488872（印第安纳波利斯罗氏分子生物化学公司）和ELISA胰岛素试剂盒（米利波雷EZRMI）测量血浆TC、TG和胰岛素水平。适用于小鼠的稳态模型评估（HOMA）计算为（[葡萄糖（mg/dl）*0.055]×[胰岛素（ng/ml）*172.1]）/3857，并用作全身胰岛素敏感性的替代测量41.

葡萄糖和胰岛素耐受性试验

所有实验均在6小时未喂食的小鼠中进行（上午8:00取出食物）。通过腹腔（i.p.）葡萄糖耐量（GTT）和胰岛素耐量（ITT）试验评估全身葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。在首次采血（t=0）后，对清醒小鼠进行静脉注射葡萄糖（2g/kg总体重）或胰岛素（0.5U/kg总体重，NovoRapid，Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark）。接下来用血糖仪在15、30、60、90和120分钟通过尾部出血测量血糖水平。使用梯形积分测量曲线下的葡萄糖或胰岛素面积（AUC）。

肝脏脂质组成

如前所述提取肝脏脂质42简单地说，小肝脏样本在冰镇甲醇中均质。离心后，通过添加1800μl CH提取脂质三OH：氯化氢三（1:3 v/v）至45μl匀浆，然后通过离心进行剧烈涡流和相分离（14000 rpm；室温下15 min）。将有机相干燥并溶解在2%Triton X-100水中。使用上述商用试剂盒测量TG和胆固醇浓度。肝脏脂质以毫克/毫克蛋白质表示，这是使用Bradford蛋白质检测试剂盒（法国圣昆廷·法拉维尔Sigma-Aldrich）测定的。

蛋白质印迹分析

将速冻的肝脏、骨骼肌和附睾WAT样品（~50 mg）溶解在含有以下成分的冰镇缓冲液中：50 mM Hepes（pH 7.6）、50 mM NaF、50 mM-KCl、5 mM NaPPi、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、1 m M DTT、5 mM-β-磷酸甘油酯、1mM钒酸钠、1%NP40和蛋白酶抑制剂混合物（Complete，Roche，Mijdrecht，荷兰）。如前所述进行蛋白质印迹42使用的主要抗体列于补充表1条带通过增强化学发光进行可视化，并使用图像J（美国国家卫生研究院）进行量化。

RNA纯化和qRT-PCR

使用三试剂RNA分离试剂（Sigma，Aldrich，Saint-Quentin Fallavier，France）从snap冷冻的肝脏、骨骼肌或附睾脂肪组织样品（~25 mg）中提取RNA。逆转录总RNA（0.5μg），然后使用SYBR Green Core Kit在MyIQ热循环器（Bio-Rad）上进行定量实时PCR。mRNA表达标准化为RPLP0 mRNA含量，并表示为与使用∆∆CT方法的对照小鼠相比的倍数变化。引物序列列于补充表2.

统计分析

所有数据均表示为平均值±SEM。使用Graphpad Prism 6 Windows软件包（美国加利福尼亚州圣地亚哥）和双尾非配对学生测试（WT）进行统计分析与标准饮食下的PHD1−/−或双向方差分析，进行多重比较，然后进行事后Fisher LSD测试（WT与LFD或HFD上的PHD1−/−）。当p<0.05时，组间差异被认为具有统计学意义。

其他信息

如何引用这篇文章：A.托马斯。等人。低氧诱导因子脯氨酰羟化酶1（PHD1）缺乏可促进小鼠肝脏脂肪变性和肝脏特异性胰岛素抵抗。科学。代表。 6, 24618; doi:10.1038/srep24618（2016）。

补充材料

补充信息：
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致谢

这项工作得到了Dotation基金会“Recherche en SantéRespiratoire”、Fonds de Dotation“Agir pour les Maladies Chroniques”、Souffle基金会和法国基金会的支持。

脚注

作者贡献A.T.进行实验，分析数据并起草手稿；E.B.进行实验，参与讨论并批判性地审查手稿；J.A.W.参与讨论并批判性地审查了手稿；G.C.v.d.Z.进行实验；P.L.、K.C.和J.L.P.参与了讨论，并对手稿进行了批判性审查；D.G.R.负责监督项目，参与讨论并批判性地审查了手稿；B.G.监督项目，构思项目，进行实验，分析数据，撰写和编辑手稿。B.G.是这项工作的担保人，因此，可以完全访问研究框架中生成的所有数据，并对其完整性和分析的准确性负责。

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