自噬最初由Christian de Duve定义为“细胞质部分的大量分离和消化；”1后来格伦·莫蒂莫尔建议指定大自噬以将这种大量过程与其他自噬机制区分开来。2近年来选择性自噬这使得保留术语“宏观自噬”用于批量过程变得更加重要。三
具有不同半衰期的细胞溶质酶都以相同的速率被隔离到自噬液泡中，这也使它们成为大分子自噬货物隔离的潜在探针，这一事实显著地证明了大分子自吞噬的整体性质。4我们通常使用LDH（乳酸脱氢酶）来达到这一目的，因为它是存在于所有细胞中的一种细胞溶质酶，并且只能通过自噬-溶酶体途径降解。4我们的大自噬货物螯合测定可以适用于任何细胞类型，5在亮氨酸蛋白酶或巴非霉素A存在的情况下，测量LDH向可沉积自噬液泡的净转移1防止LDH在两性体和溶酶体中降解。细胞通常在无氨基酸和无血清的缓冲液中孵育，以确保能够测量到最大限度的自噬活性（自噬能力）。对于LC3的定量测量，使用了一种免疫印迹程序，该程序将细胞溶质（未液化）形式LC3-I与吞噬物附着（浸脂）形式LC3-II分离。由于抗LC3抗体对LC3-II的染色效率高于LC3-I，在斑点扫描和带定量后，后一个值通常乘以4，这是我们通过分析ATG4介导的LC3-II脱脂而得出的染色比率。6
通过阻断，我们简化了肝细胞LC3动力学的分析从头开始蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺的LC3流入。在这些条件下，总LC3（LC3-I+LC3-II）迅速下降（半衰期～2 h）；6这种早期LC3的消失在很大程度上可以解释为自噬溶酶体的降解，而自噬溶酶体的降解被自噬螯合抑制剂（3MA，TG）或溶酶体功能抑制剂（NH4氯，巴非霉素A1，亮普汀）6(，0分钟添加抑制剂）。3MA和TG效应的可逆性允许进行区块释放实验，这表明虽然只有3MA抑制LC3脂质氧化，但这两种抑制剂都阻止了吞噬细胞的闭合，从而阻止了散装货物的隔离。7释放封闭封闭物后，重新添加TG可能通过抑制吞噬细胞/自噬体与两性体/溶酶体的融合来阻止随后的LC3降解。相反，重新添加的3MA虽然仍然阻止货物隔离，但允许一些降解的LC3通量，这表明配备LC3的吞噬细胞可以通过自噬-溶酶体途径而不携带大量细胞质货物。7
饥饿期间细胞溶质散装货物LC3-非依赖性自噬的实验证据。（A） 大鼠肝细胞在37°C下与环己酰亚胺（100μM）单独（CTR）或3-甲基腺嘌呤（3MA，10 mM）、thapsigargin（TG，5μM）或NH孵育200分钟后LC3的周转4在0分钟或100分钟添加Cl（20 mM）（导致降解自噬溶酶体LC3通量受到抑制）或（没有影响，表明没有自噬溶酶体LC2通量）。200 min时剩余的LC3总量表示为0 min值的百分比（括号中给出的实验次数的平均值±SE）。（B） 携带自噬性隔离LDH（开环）或细胞器相关LC3-II（填充环）的可沉积肝细胞器的密度梯度分布。在放线菌酮处理4小时后收集细胞，在2小时时添加亮氨酸肽（0.3 mM），以允许LDH在2-4小时期间积累。（C） 52小时siRNA介导的Atg8同源物LC3A、LC3B、GABARAP（GAB）、GABARSAPL1（GL1）和GABARAPL2（GL2）的敲除对LNCaP前列腺癌细胞中相应免疫印迹蛋白表达的影响（siCTR，非靶向siRNA；I，非脂化；II，脂化形式）。细胞在完整的培养基中或在缺乏氨基酸和血清的条件下（EBSS）和巴非霉素a的存在下培养4小时1（200 nM），如图所示。（D） 敲除对大分子自噬货物（LDH）隔离的影响，表示为每小时隔离的细胞LDH的百分比（3个实验的平均值±SE）。数字改编自参考。6.
在环己酰亚胺处理期间，LC3不间断循环约100分钟后，LC3降解对3MA、TG或NH不再敏感4Cl，表明其自噬-溶酶体通量已经停止(，在100分钟时添加抑制剂）。然而，尽管在100分钟后没有自噬溶酶体LC3通量，但货物（LDH）的螯合能力得到了令人惊讶的良好维持，并且始终对自噬抑制剂敏感。6,7密度梯度上的亚细胞分馏证实，在放线菌酮作用2-4小时后，隔离的LDH大量积累；引人注目的是，大量的LDH存在于不含LC3的组分中（1.03–1.07 g/ml；). 此外，用抗LC3抗体染色的肝细胞的免疫荧光显微镜显示，大的LC3点在2小时后消失，这可能反映了自噬空泡不再配备足够免疫检测的LC3。6在没有任何自噬溶酶体LC3通量的情况下，细胞质货物的有效隔离和降解在很大程度上发生在没有LC3的自噬液泡中，这与能够独立于LC3运行的宏观自噬过程相一致。尽管约一半的肝细胞LC3在环己酰亚胺处理100分钟后仍然存在，6这个LC3群体显然没有参与自噬溶酶体途径(，在100分钟时添加抑制剂），但可能有助于其他细胞功能。
为了测试这一结论是否可以推广到其他细胞类型和不含环己酰亚胺的条件，在LNCaP前列腺癌细胞中测量了大自噬货物（LDH）的隔离，8一种细胞类型（与肝细胞不同）允许进行基因敲除实验。我们发现，在这些细胞中表达的LC3家族成员（LC3A1、LC3A2、LC3B1）可以被siRNA的组合共同击倒。6如所示，免疫印迹法在LC3-siRNA-处理的LNCaP细胞中未检测到LC3-I，并且在LC3-II区域仅能识别出非常微弱的条带。然而，这种非常有效的敲除并没有损害在氨基酸和血清缺乏条件下测量的大分子自噬货物隔离（EBSS；)或在含有MTOR抑制剂Torin1的完整培养基中。6我们在其他细胞系（HeLa，PC3）中也获得了类似的结果，这表明LC3非依赖性可能是哺乳动物大自噬的一般特性。
尽管我们不能正式排除siRNA介导的敲除后残留的微量LC3可能完全支持大自噬的可能性，但我们发现，鉴于上述在肝细胞中的观察结果，6由于LC3靶向siRNAs可以完全消除EBSS和巴非霉素A治疗后观察到的LC3-II水平的增加1（LC3-II水平实际上低于完全喂养的细胞；). 此外，LC3B基因敲除未能影响饥饿诱导的小鼠胚胎成纤维细胞溶酶体群体的形态学变化，9与未受干扰的宏自噬-溶酶体功能相一致。
与LC3家族敲除无效相反，在LNCaP细胞中表达的GABARAP家族成员（GABARAP、GABARAPL1和GABARAPR2；)强烈抑制大量自噬货物隔离(). 因此，巨自噬似乎需要Atg8同源物，但这一要求显然是由GABARAP而不是LC3来满足的。6敲除GABARAPs后，饥饿诱导的大自噬活性仍然不受LC3表达程度的影响()将进一步支持LC3不参与该过程。值得注意的是，除了GABARAPs外，我们还发现LNCaP细胞的大自噬需要RB1CC1/FIP200蛋白（无疑还有更多）。5
尽管我们的密度梯度分馏显示，在放线菌酮处理后的早期，LC3和隔离LDH之间存在一些重叠，6他们真的不知道LC3是否与执行大分子自噬货物隔离的吞噬细胞有任何物理联系。如果有，LC3可以执行一些辅助功能也不是不可能的，10例如，鉴于LC3在选择性自噬中作为货物受体的招募者的既定作用，它可以拾取有缺陷的蛋白质、聚集物或细胞器，从而为非选择性的大自噬添加选择性元素。11
由于目前的自噬研究不分青红皂白地将LC3用作一般自噬指标，显然需要重新考虑和重新定义LC3非依赖性宏自噬相对于选择性自噬和其他自噬机制的分子要求。
