血管基底膜作为液体进出大脑的通道

Aβ的实质内注射

为了确定可溶性Aβ从实质向血管移动时在ISF中的超微结构位置，10周龄雄性野生型C57Bl6小鼠(n个使用上述注射技术，将浓度为100μM的0.5μL生物素化人类Aβ40（AnaSpec，美国）微量注射到海马[11]. 生物素化Aβ用于防止外源性人类Aβ和内源性小鼠Aβ之间的任何潜在交叉反应。三只小鼠只注射磷酸盐缓冲盐水作为对照。通过用抗生物素预孵育注射了生物素的Aβ的组织切片，使结合Aβ的生物素结合位点饱和，证实了Aβ染色的特异性。随后，用DAB作为染色剂对切片进行4G8抗Aβ免疫组化(n个=3只小鼠）或免疫荧光(n个=3）使用链霉亲和素Alexa Fluor 546（英维特罗根，英国）。

为了在超微结构水平上确定幼年小鼠大脑中Aβ的清除途径，对6个100μm厚的自由漂浮切片、注射生物素化人Aβ40的小鼠海马和注射磷酸盐缓冲盐水的对照小鼠海马进行酶联免疫组化。切片在PBS中清洗3×5 min，然后用70%甲酸处理30 s。清洗3×5 min后，用3%过氧化氢处理30 min。在PBS中进一步清洗切片3×5 min。然后，使用Vectastain™ABC试剂盒在室温下处理切片1 h，并使用DAB作为显色剂的葡萄糖氧化酶增强进行显影。一些部分被安装在结霜的载玻片上，脱水后使用DPX安装介质盖住滑盖。使用尼康80i亮场显微镜在10倍和175倍放大率下对这些切片进行成像，并将图像导出到Photoshop CS软件进行定位。将TEM切片转移到0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）中，pH值为7.2，清洗3×5 min，然后在室温下用1%四氧化锇在0.1 M PB中后固定，pH值7.2，固定1 h。在PBS中进一步洗涤3×5 min后，通过酒精系列（30%–2 min、50%–2 min，70%–10 min、90%–10 min，2×100%–20 min）对切片进行脱水。然后用乙腈处理切片10分钟，然后将其放置在乙腈和TAAB树脂（英国TAAB实验室）50:50的混合物中12小时。树脂渗透后，将切片放入新鲜TAAB树脂中6 h，然后嵌入新鲜TAAB-树脂中，并在60°C下聚合48 h。使用Reichurt Ultracut E超微切片机（德国Reichurt.）对聚合树脂块进行切片。切割半薄切片（0.5μm厚）并用甲苯胺蓝染色（Agar Scientific，英国）。使用尼康80i亮场显微镜在10倍和175倍放大下对这些切片进行分析，以评估组织的质量。进一步对超微结构保存良好的区域进行显微解剖。使用硅藻金刚石刀从微细切割的块体上切下超薄切片（90 nm厚），并漂浮到TEM网格上进行可视化。共对36个切片进行TEM分析，每个切片中观察到5-10个毛细血管内的Aβ。通过该部分的检查覆盖了从右上角到左下角的每个方格。使用日立H7000透射电子显微镜进行分析。使用iTEM软件（德国穆恩斯特软成像系统通用TEM成像平台）操作MegaView III数字相机（德国穆斯特软成像系统）拍摄图像。

Aβ定位的免疫荧光

对于双标记免疫组织化学，组织切片用抗α平滑肌肌动蛋白（1:500，英国多塞特Sigma-Aldrich）和抗层粘连蛋白（1:50，英国多赛特Sigma Aldrich，英国多塞特）孵育过夜，并用Alexa荧光结合二级抗体（Invitrogen，英国佩斯利）培养。使用Leica SP5共焦激光扫描显微镜（Milton Keys，UK）从距离注射部位至少100μm的组织切片上采集三重标记免疫组织化学的显微照片，并导出至Photoshop CS软件。

直径为15nm的柠檬酸盐包覆球形金纳米粒子的合成

采用Turkevich方法制备柠檬酸钠稳定的球形金纳米粒子（NPs）[18]. 简单地说，将2.5 ml 19.5 mM柠檬酸三钠煮沸，并与脱水四氯金酸钠（III）煮沸溶液（0.5 mM，25 ml）快速混合同时剧烈搅拌（溶液从浅黄色变为无色，然后变为紫色，最后变为深红色，表明形成了15nm球形金NP）。5分钟后，将溶液冷却至室温，并使用0.45μm注射器过滤器进行过滤。然后用bis覆盖柠檬酸盐涂层的NP-(第页-通过将27.5 ml金NP与10 mg BSPP混合并搅拌过夜，使用50 mg氯化钠沉淀，并在20°C下以5000 rpm离心5 min来纯化磺基苯基苯基膦二水合物二钾（BSPP）。将所得纳米粒子在100μl Milli-Q水中超声分散，并保存在4°C下。使用直径3.05 mm的碳涂层400目铜网格和紫外-可见光谱通过TEM证实了金纳米粒子的尺寸。使用比尔-朗伯定律估算金NP浓度，然后在Milli-Q水中稀释至所需浓度。

15nm金纳米粒子的表面功能化

用聚乙二醇（PEG）化合物涂覆直径为15 nm的柠檬酸盐涂层球形NP，聚乙二醇化合物含有正（SH-PEG-COOH）、中性（SH-PEG-OCH）_三)或阴性（SH-PEG-NH₂)功能组。对于每个功能组，将NP（5 nm，10 ml）与PEG化合物（5 mg，200μl）混合，同时持续搅拌，在振动筛（500 rpm）上培养2 h，并在4°C下放置过夜。然后通过离心（3×16400 rpm，15 min，10°C）纯化功能化的金纳米粒，并在100μl Milli-Q水中通过超声波重新分散。

15纳米金纳米粒子的实质内注射

10周龄雄性小鼠立体定向注射1μl正电荷、负电荷或中性电荷的15nm金纳米粒子(n个=3/组），以0.2μl/min的速率（从Bregma得到的坐标：AP=−1.9 mm；ML=1.5 mm，DV=−1.3 mm）。注射用移液管在原位放置2分钟以防止反流，注射后5分钟处死小鼠。

在海马注射部位前后200、400、600和800μm处制备冠状切片，用于透射电镜检查。每100μm切片四个1mm²从左侧海马显微解剖样本并进行TEM处理（每只小鼠32×样本，每组96×样本）。TEM是通过从右上角到左下角系统地扫描每个样品，并对含有纳米颗粒的区域进行数字拍摄来完成的。

海马注射生物素化Aβ的分布

根据之前使用荧光示踪剂的实验[7]据估计，注射后5分钟是检查脑细胞外间隙中生物素化Aβ与毛细血管基底膜中生物素化Aβ之间关系的最佳时间。随后，细胞外空间中的荧光示踪剂数量减少，同时毛细管基底膜中示踪剂的存在减少。

在海马注射5分钟后，在神经元和胶质突起之间的狭窄细胞外间隙中可以看到生物素化Aβ的浓密染色（图2a） ●●●●。在同一时间间隔对毛细血管壁的检查显示，毛细血管基底膜内存在生物素化Aβ的深色颗粒染色（图2b） 。放大倍率较高时（图2c） ，Aβ染色延伸至基底膜的整个宽度和毛细血管周细胞的两侧。将图像与注射磷酸盐缓冲盐水和未注射生物素化Aβ的动物毛细血管基底膜进行比较（图2d） ；未注射动物的基底膜显示Aβ无颗粒致密染色。

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图2

在海马灰质细胞外间隙和毛细血管基底膜中发现的生物素化Aβ。一海马神经膜在细胞外间隙显示深染的生物素化Aβ(箭头标记的Aβ）；b条海马毛细血管基底膜生物素化Aβ染色深；c（c）图2b中正方形内区域的高倍视图，显示细胞外间隙中生物素化Aβ的深色染色(正确的)贯穿毛细血管基底膜(左边)包裹周细胞的(第页);d日未注射生物素化aβ的对照海马毛细血管。基底膜(cvbm公司)Aβ染色阴性。英语内皮，卢流明，第页周细胞，cvbm公司脑血管基底膜。比例尺 一500纳米；b条–d日200纳米

海马注射荧光Aβ5min后软脑膜动脉中膜基底膜中的Aβ

为了证明注射到海马的可溶性Aβ在注射5分钟后到达软脑膜动脉，用免疫细胞化学和共焦显微镜检查了脑切片。图三显示了一系列共焦图像，描绘了aβ、基底膜层粘连蛋白和平滑肌肌动蛋白的染色。图中软脑膜动脉三被视为斜向观察的圆柱体。aβ（图三a） 血管壁的染色模式与层粘连蛋白相似（图三b） 但并不完全相同。可以在合并的图像中检测到差异（图三d） ；尽管Aβ在整个血管壁段与层粘连蛋白融合，但动脉外侧的外膜染色层粘连素，但缺乏Aβ。图三c显示动脉壁上有一层薄而完整的平滑肌细胞圆周膜，在横切面上最明显的部位是动脉。平滑肌外皮的完整性使动脉可以与血管区分开来，血管壁上偶尔只有平滑肌细胞。层粘连蛋白和Aβ的基底膜染色与平滑肌细胞层有关（图三d） ●●●●。这些图像支持以前发布的数据[7]脑动脉中膜基底膜内有荧光示踪剂。未观察到与静脉相关的示踪剂。

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图3

免疫细胞化学/共聚焦图像显示，在海马注射可溶性Aβ5分钟后，Aβ与海马裂动脉壁内的基底膜蛋白相关。一Aβ(红色)软脑膜动脉壁；b条层粘连蛋白(蓝色);c（c）一层平滑肌细胞(绿色)在动脉壁上，当血管在横截面上被切开时，最清晰可见；d日显示aβ和层粘连蛋白共同定位的合并图像(紫色–请参见箭头)与平滑肌细胞相关。动脉的最外层，外膜(助教)，仅为层粘连蛋白染色(蓝色)而不是Aβ。SP5徕卡共焦图像。比例尺50微米

注射后5分钟15纳米金纳米粒子在海马的分布

为了测试毛细血管周围淋巴引流的能力，将15纳米金纳米粒子注射到海马灰质中，并在注射5分钟后检查标本。这样，结果可以与注射生物素化Aβ进行比较。金纳米粒子分布在海马实质的细胞外间隙，一些被神经元和可能的星形胶质细胞突起吸收（图4a） ●●●●。然而，在毛细管基底膜内没有发现纳米颗粒（图4b） 尽管它们位于毛细血管周围的细胞外间隙和邻近的神经元突起内。这些结果表明，尽管15nm纳米颗粒广泛分布于细胞外间隙，但它们并未进入血管周围淋巴引流途径的基底膜。

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图4

纳米颗粒分布在细胞外空间，但不进入毛细血管基底膜。一细胞外间隙可见密集染色的点状纳米颗粒(锿)大脑和神经元的细胞内过程，可能还有星形胶质细胞。b条神经肽和毛细血管显示纳米粒子(净现值)在神经膜的细胞外空间，偶尔在细胞突起中，但毛细血管基底膜中没有纳米颗粒(cvbm公司).比例尺 一300纳米；b条500纳米

基底膜作为液体和溶质进出大脑的通道

本研究表明，大量液体进出大脑的解剖室沿着基底膜。参与这一过程的所有血管基底膜似乎都由两种元素组成。毛细血管基底膜由内皮细胞和神经胶质细胞的元素融合而成。中膜中的基底膜是由相邻平滑肌细胞的元素融合而成的。软膜-胶质基底膜是脑脊液中示踪剂进入的通路，部分由软脑膜提供，部分由胶质界限蛋白提供。超微结构研究已经确定了这种基底膜中的三层，两层外层的rarae和一层位于基底膜两个元素融合处的中央致密层。虽然在本研究中，Aβ填满了毛细血管基底膜的整个宽度，但有一些迹象表明，致密层可能是溶质沿着基底膜在血管平滑肌细胞之间运输的途径。在脑淀粉样血管病（CAA）的早期阶段，不溶性Aβ纤维首先在致密层沉淀[26]. 随后沉积的Aβ扩张并分离相邻平滑肌基底膜的两个成分[16]. 当微粒被注入大脑并在动脉壁和周围的胶质细胞界限之间扩散时，胶质-软脑膜基底膜的两种成分也会发生类似的分离[29].

对神经免疫学、阿尔茨海默病、药物输送和Virchow–Robin空间概念的意义

本研究由（1）生物技术和生物科学研究委员会拨款BB/K015540/1资助；（2） 英国Age Grant Nr PhD-368；（3） 生物素。