自噬体的生物发生是由复杂的蛋白质信号级联启动的，以从内膜系统中动员膜。动员过程中产生的膜前体被组装成膜池，也称为吞噬体，其伸长形成杯状膜，在其末端密封成为自噬体。虽然从吞噬细胞伸长到自噬小体形成的这一步骤已经通过成像技术进行了形态学表征，但由于缺乏明确的膜形态来追踪这一事件，对于非常早期的步骤，即内膜转化为早期自噬体前体的过程知之甚少。多种自噬体前体被认为来自细胞膜的多个位置。在当前的研究中，我们的注意力集中在负责LC3脂质化的膜前体的生成上。前体在自噬体生物发生的早期阶段产生，是自噬体形成所必需的。LC3脂质化依赖于泛素样结合过程，在此过程中，蛋白质复合物ATG12–ATG5-ATG16L1以及蛋白质ATG3和ATG7的功能是将LC3与自噬体前体膜上的磷脂酰乙醇胺共价连接。该过程由由ATG14、BECN1/Beclin 1、PIK3C3/VPS34和PIK3R4/VPS15/p150组成的III类磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）复合物调节。据推测，激活PtdIns3K复合物会产生磷脂酰肌醇-3-磷酸（PtdIns3P），它与PtdIns4P效应器和下游因子一起触发向吞噬细胞的膜转换。
此前，我们建立了一种无细胞LC3脂质过氧化分析，该分析重述了LC3的PtdIns3K依赖性脂质过氧化。在这里，我们使用该分析来追踪PtdIns3K复合物诱导的膜动员事件。我们监测了LC3脂质化前体的生成附件5敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），在PtdIns3K下游的LC3脂质化步骤中吞噬细胞的形成被阻断。我们检测到在饥饿状态下，对LC3脂质化有活性的膜前体的PtdIns3K依赖性积累附件5KO MEF公司。这些前体是可能由供体膜出芽产生的小泡。基于这一观察结果，我们开发了一种基于我们成熟的体外COPII出芽系统的无细胞小泡形成分析方法。我们将此分析与无细胞LC3脂质体结合，从供体膜重建由饥饿诱导和依赖PtdIns3K生成的小LC3脂质活性囊泡的过程。通过膜分离实验，我们确定内质网（ER）-高尔基体中间室（ERGIC）是产生LC3脂质化活性小泡的供体。此外，PtdIns3K复合物的组分ATG14和BECN1以及上游调节物（如RB1CC1/FIP200）是生成LC3脂质化活性小囊泡所必需的。这些数据与我们之前的研究一致，该研究证明ERGIC通过为ATG14（PtdIns3K的关键靶向因子）的对接提供平台，在触发LC3脂质化方面发挥着关键作用。因此，结合我们之前的研究，当前数据表明ERGIC产生LC3脂质化的小膜前体，以响应活化的PtdIns3K。
ERGIC是一个与COPI和COPI囊泡进行动态膜交换的分选站。此外，COPI和COPII机制都具有从供体膜中芽出小泡的功能。我们发现，抑制COPII而非COPI可以阻止LC3脂质化活性小膜的生成，这表明COPII机制参与了ERGIC前体的萌芽。这一观察结果令人惊讶，因为人们认为在囊泡运输中，COPII机制只从内质网中萌发囊泡(). 我们认为，ERGIC产生COPII囊泡可能是饥饿诱导自噬相关膜动员的特殊事件。为了验证这一假设，我们进行了膜分离，并发现饥饿后COPII机器重新定位到ERGIC，这在营养丰富的条件下不会发生，并且在PtdIns3K抑制剂的存在下会受到很大影响。共聚焦显微镜和去卷积显微镜的共定位分析进一步证实了COPII在ERGIC中的饥饿诱导和PtdIns3K依赖性募集。值得注意的是，ERGIC组分产生的COPII囊泡的成分可能与ER产生的不同，因为它们富含触发LC3脂质化的活性（约为ER的5倍）。这些数据表明了一种由自噬信号诱导的膜动员机制，该信号产生早期自噬体前体。在这一过程中，PtdIns3K激活诱导COPII机制从ER向ERGIC移位。然后产生特殊的COPII小泡作为LC3脂质化的前体，这是自噬体发育的一个重要步骤().
COPII机制从ER-Golgi贩运转向自噬体生物生成的拟议模型。在ER-Golgi贩运中，COPII囊泡由ER的特殊亚结构域产生，称为ERES，在分泌途径中传递货物蛋白。ERGIC是ER和高尔基之间的回收站，从ER接收COPI囊泡，从高尔基接收COPI泡。在ERGIC中，货物被分拣并通过COPI囊泡向前或向后移动到高尔基体。在自噬（盒装区）中，饥饿等应激信号激活PtdIns3K，PtdIns3K随后作用于ERGIC，以促进COPII蛋白向ERGIC的重新定位。该过程导致产生ERGIC-衍生的COPII囊泡作为LC3脂质氧化的模板，LC3脂质化是自噬体生物生成的一个重要步骤。这些LC3-脂质小泡随后被运输到PAS，在那里与来自ER、ATG9室的其他膜前体融合，也可能来自质膜（PM）和高尔基体等，以完成自噬体的形成。
十多年前，Ohsumi组首次发现COPII参与自噬。然而，很难确定COPII囊泡是直接为形成自噬体提供膜，还是通过其在膜运输中的作用间接影响自噬。最近，在表明COPII囊泡对自噬体生物发生的直接贡献方面取得了重大进展。在哺乳动物细胞中，吉森和山本实验室使用电子显微镜，在发育中的吞噬细胞附近发现了成簇的COPII阳性小泡。在酵母中，Ohsumi、Suzuki和Nunnari实验室使用荧光显微镜和遗传学证明了ER出口位点（ERES，COPII组装位点）与吞噬细胞组装位点（PAS）的关联。Klonsky和Ferro-Novick实验室将Trs85鉴定为一种蛋白质因子，它决定了蛋白栓系复合体TRAPPIII的自噬功能。Ferro-Novick、Reinisch和Walz实验室随后证明TRAPPIII系留复合体与COPII组分相关。我们的研究为COPII囊泡在自噬体生物发生中的作用提供了直接证据，表明COPII微泡是LC3脂质氧化的膜模板。此外，我们发现，自噬性COPII囊泡可以通过生成和组成的不同位置与ER-Golgi贩运的囊泡区分开来，即自噬型COPII微泡是从ERGIC生成的，而不是从ER生成的，它们对LC3脂质化更为活跃。最后，我们证明了自噬COPII囊泡是由饥饿期间PtdIns3K的激活诱导的。
我们的研究表明，哺乳动物细胞中自噬体生物发生的COPII位置从ERES转换为ERGIC。然而，在酵母中没有观察到明显的ERGIC结构。酵母如何区分自噬COPII囊泡和ER-Golgi贩运囊泡？内质网可能为自噬COPII囊泡的生成分配一个特定的位点。Ohsumi和Nunnari实验室的研究支持这一观点，该研究表明，PAS附近的COPII地层位置存在空间分布。这个COPII形成位点可以专门用于自噬。如Ferro-Novick实验室所示，将这些自噬COPII囊泡输送到PAS需要与ER-Golgi转运相似的蛋白质机制，包括囊泡栓系复合物（TRAPPIII）、小GTPase（Ypt1）和蛋白激酶（Hrr25）。我们很想知道酵母中的这些自噬COPII小泡是否是为自噬目的而定制的，类似于哺乳动物细胞中ERGIC产生的小泡。
总之，我们的研究确定了从ERGIC生成自噬体前体的途径。该过程包括自噬PtdIns3K诱导的COPII机制的重新定位，以产生ERGIC衍生的COPII囊泡作为LC3脂质化的膜模板。未来的问题包括，在饥饿期间，COPII机器的哪些组件是如何从ERES迁移到ERGIC的；向PAS输送LC3-脂化COPII囊泡的分子要求是什么；两种COPII囊泡的区别是什么；以及这些LC3-脂化COPII囊泡如何促进吞噬细胞的生长。
