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科学代表。2016; 6: 24436.
2016年4月18日在线发布。 数字对象标识：10.1038/代表24436
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PMID：27087234

外泌体的淋巴运输是向淋巴结快速传播信息的途径

斯威莎·斯里尼瓦桑,1,2 弗雷德里克·范伯格,b中，1,2,*和J.布兰登·狄克逊a、，2,三，*
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摘要

有充分的证据表明，细胞分泌外泌体，外泌体可以转移影响受体细胞在各种生理和疾病过程中功能的生物分子。尽管淋巴管在免疫中起着关键作用，并且外泌体处于淋巴运输的理想尺寸范围内，外泌物的淋巴引流和运输作用尚不清楚。通过体内近红外（NIR）成像显示，外泌体在几分钟内通过淋巴管从外周迅速转移到淋巴结。使用在体外在淋巴吸收模型中，我们发现淋巴内皮细胞积极地促进了淋巴吸收和外泌体向血管腔侧的转运。此外，我们还证明了外泌体在引流淋巴结中的不同分布取决于淋巴流。最后，通过外泌体在淋巴结中细胞分布的端点分析，我们确定巨噬细胞和B细胞是外泌物摄取的关键参与者。总之，这些结果表明，外体通过淋巴流从外周转移到淋巴结可以提供一种机制，在迁移细胞到达之前快速交换感染特异性信息，从而使淋巴结产生更有效的免疫反应。

多细胞生物依靠细胞间通信进行信息交换，以促进组织的生存、适当发育和功能。这种通信通过纳米管直接物理接触进行1分泌化学信号，如细胞因子、趋化因子或小分子介质（蛋白质、核酸），或通过外泌体交换信息2外显子提供了在细胞间远距离传递信息的能力，它们在远距离通信中的作用已经得到了很好的确立三外显体中功能性、可运输的mRNA和miRNA的发现进一步增加了细胞间通信的复杂性。它们可以与受体细胞融合，并将其内容物传递到受体细胞的细胞质中，扰乱受体细胞，特别是因为miRNA可以介导RNA干扰4它们还可以携带配体组合，同时与几个细胞受体结合，调节受体细胞的变化。

外显子被认为在调节免疫反应中具有多种作用体内：a）树突状细胞衍生的外泌体携带抗原并将其呈现给T细胞5，b）来自被细胞内病原体感染的巨噬细胞的外泌体在未感染的巨噬细胞中诱导促炎反应，从而激活免疫反应6c）肿瘤衍生的外泌体携带多种免疫抑制分子，通过减少各种免疫亚群（如自然杀伤细胞、调节性T细胞或髓细胞）的增殖来抑制对肿瘤的免疫反应7.

淋巴流是循环的重要组成部分，因为它通过淋巴结和胸导管将组织间质液体回流到循环中8组织的淋巴引流导致抗原、免疫细胞和大分子从外周运输到淋巴结，从而引发先天性和适应性免疫反应。因此，每个淋巴结都通过淋巴毛细血管获得区域特异性抗原信息，毛细血管排出周围，使抗原提呈细胞（APC）启动免疫反应9有趣的是，大蛋白的间质和血管排斥所产生的内在物理屏障为淋巴转运创造了5–100 nm的“最佳”尺寸范围，这主要是外泌体的尺寸范围。小于此值的颗粒很容易被毛细血管吸收，而较大的颗粒通常被困在细胞外基质中10,11虽然最近的证据表明，1微米大小的颗粒可以被淋巴管吸收12.

外泌体大小的主要优点之一可能是，它们小到可以通过间质流通过间质基质，但大到可以将其吸收分隔到淋巴循环中，从而使它们成为一种理想的载体，外周细胞可以通过它向淋巴结快速发送信号并传输信息。有趣的是，黑色素瘤衍生的外泌体通过启动促血管生成程序和重塑组织基质来启动前哨淋巴结的肿瘤转移13和CD169+细胞被确定为淋巴结和脾脏中B细胞衍生外泌体的靶细胞14表明淋巴系统在外周体向淋巴器官和淋巴结的转运中起着重要作用。然而，涉及节点中外泌体信号传递的实验通常在数小时或数天内进行，因此尚不清楚外泌体能以多快的速度贩运和吸收到节点中的细胞中，如果利用外泌体内的外泌物来增强先天免疫性，速度应特别重要。

近红外成像是一项新兴技术，已用于非侵入性成像和量化功能性淋巴运输15并进行前哨淋巴结定位16因为它以最小的自体荧光提供最大的组织渗透性17另一方面，外显子通过荧光团共价标记成像18或使用DiL或DiO等多种脂类染料13在可见范围内，允许在细胞培养物或端点中贩运外泌体体内外泌体的生物分布研究，但受深度穿透限制，不适合体内成像。我们已经成功地用近红外染料标记了外泌体，这使我们能够监测外泌体的运输体内使用近红外成像。因此，我们可以建立并量化外泌体从外周组织到淋巴结的淋巴运输动力学，这在先天免疫的情况下尤其重要，因为快速抗原运输对建立宿主免疫和限制病原体传播至关重要19描述外泌体通过淋巴管的转运以及由此在淋巴结中产生的细胞摄取，为研究淋巴引流的作用以及外泌物在免疫方面的旁分泌作用提供了一些关键见解。

结果

外显体和珠的特征

利用动态光散射、扫描电子显微镜和流式细胞术对HEY细胞系的外显子以及大小和密度匹配的聚苯乙烯微球进行分离和表征，并用于表面标记表达。HEY外泌体的平均大小为78.82±19.17SD nm，而珠子的平均大小是67.34±13.7SD nm(图1a). 外泌体呈球形，直径约为60–75 nm，扫描电镜观察结果与文献报道的外泌体形貌和大小一致20(图1b). 经典的四spanin表面标记CD63和CD81，已知其在外体膜上富集4，在HEY外显体上约80%的表达水平[图1c–e]. 因此，本研究中使用的HEY外显体符合已知的外显体大小范围，表达经典的四spanin标记，并且如之前报道的那样呈球形。

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外泌体和珠的特征。

(一)HEY外显子与珠粒的大小分布比较。(b条)外泌体的扫描电子显微照片。比例尺=500 nm。(c（c）)CD63和(d日)外显体和珠上的CD81。(e（电子）)流式细胞术定量外显体和珠上的CD63和CD81（p值<0.01）。

外泌体通过淋巴管内皮快速而有选择性地运输在体外

为了验证外泌体通过淋巴管内皮的转运高于大小和密度匹配的珠粒的假设，细胞的有效渗透性(P（P）有效单元格)如前所述，使用transwell系统测量基底至顶端方向的荧光标记外泌体和珠21(图2a). 在没有细胞的情况下，外显子、珠和右旋糖酐可以自由地跨膜运输(图2b，虚线），既没有外显体也没有珠子粘附在膜上(补充图1d). 此外，顶端侧收集的外显体的大小范围与基底侧相似，进一步证实了外显体从基底侧向顶端侧的运输(补充图1e). 为了了解LECs外显子转运的动力学，每5分钟对转运进行一次评估。珠的转运在30分钟时低于检测限，因此在零标记处以实线表示没有转运。计算有细胞和无细胞时的通量，以确定LECs增强选择性转运或提供选择性转运屏障的程度。极小量的右旋糖酐（3kDa）在无细胞的情况下通过Transwell膜自由扩散，但在有LECs的情况下，转运略有减少，约15分钟后迅速达到平衡有细胞时的min和转运比无细胞时要高得多（~2倍），转运在~20min达到平衡(图2b，实线）。为了量化这种差异，在与外泌体和珠培养75分钟后计算细胞的有效通透性，以便在37°C和4°C下运输可以达到平衡。37°C时，与荧光大小匹配的珠状物相比，外显体通过淋巴管内皮的转运量增加了约10倍（p值<0.01）(图2c). 当细胞被固定并用共焦显微镜检查时，在37°C下的细胞内可以看到外泌体(图2d)而珠子不是(补充图1b). 然而，在4°C时，胞外体摄取大大减少(补充图1a). 在37°C和4°C下对与外泌体和珠相对应的图像中的荧光进行量化，表明外泌物运输在4°C时减少了约80%(图2e，p值<0.001）。总的来说，这些数据表明淋巴管主动运输外泌体在体外.

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外泌体快速选择性地通过淋巴管内皮运输体外试验。

(一)运输实验示意图(b条)外泌体通过淋巴管内皮的转运迅速发生（t=5–30分钟），并在细胞存在时增强(c（c）)外泌体选择性地运输到淋巴管内皮（与珠状物相比）(d日)LEC（细胞核用DAPI染色，肌动蛋白染色为红色）与PKH67外泌体的正交视图，37°C。比例尺，5μm和(e（电子）)37°C和4°C下通过荧光强度定量细胞外体和珠。

外泌体迅速进入淋巴管体内

利用组织模型测试NIR成像系统检测双标记外泌体的灵敏度。在1–6毫米的深度检测到外泌体，信噪比>4(补充图2b). 我们通过组织模体运行几份外泌体溶液稀释液来测试血管内外泌体液的检测极限，能够检测出0.1μg外泌物，即10μg注射剂量的1%(补充图2c). 最后，淋巴结模型能够检测到0.01μg/μl的外泌体浓度，或1μg/微升注射剂量的1%(补充图2d).

实时跟踪外泌体的运动体内，一个近红外荧光团与外体膜蛋白的N端偶联。在外泌体的脂质双层中添加第二个荧光团，以使体外受精细胞外体摄取和转运的多尺度分析(图3a). 小鼠皮下注射10µg双标记外泌体10µL PBS。近红外激发源和CCD发射探测器的视野集中在尾尖注射部位下游10 cm处（朝向尾基）的小鼠尾部(图3b). 该位置可确保仅显示下游收集淋巴管，从而最大限度地提高检测灵敏度，避免注射部位的图像饱和(图3i).

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外泌体通过淋巴管内皮快速运输体内.

(一)外泌体的双重标记(b条)小鼠注射和可视化方案。在淋巴管中快速检测到外显体(c（c）)船舶在0分钟时(d日)船舶在2分钟内(e（电子）)船在5分钟时(（f）)船舶20分钟(克)容器在2小时内(小时)2天时(我)注射部位附近2小时可见毛细淋巴管(j个)2小时注射部位，以及(k个)注射部位2天。比例尺；5毫米。

在注射部位下游10厘米处的尾部尖端注射丸后2分钟内，在淋巴收集血管中发现了外显体(补充视频1). 首先在排出尾部的优势血管中检测到外显体，大约2.5分钟后在非优势血管中发现外显体。注射后20分钟，两条血管均达到荧光稳态值(图3c–f). 这一结果与之前的研究结果一致，即通过NIR成像测量，啮齿类动物尾部和小鼠后肢的两条收集血管具有不同的功能容量，而这两条收集管道的淋巴运输22,23。注射后6小时内，收集容器保持这些稳定状态值，但注射24小时后，容器内没有残留可检测信号。收集容器的代表性图像显示在我们研究的2小时和2天时间点(图3g，h分别）。注射部位在2小时2天时继续保留部分注射的外泌体(图3j，k分别）。

外泌体转运的特性体内

从注射胞外体丸到达到稳态荧光为止，对主要和非主要收集血管中的荧光到达进行分析和定量。与非优势血管相比，优势血管在所有试验中始终具有显著更高的荧光(图4a; p值<0.05），并显示了两个血管的代表性线强度剖面(图4b). 对引流淋巴结中的荧光到达进行分析，类似地，先观察优势淋巴结（由优势收集血管引流），然后再观察非优势淋巴结，其亮度较低(图4c). 显示了两个引流淋巴结的代表性线强度分布(图4d). 线强度图中有两个不同的区域，分别对应于a）外体运输迅速增加的“到达”区域和b）外体输送稳定的“稳态”区域。到达时优势血管中的包频率显著高于稳态时的包频率（p值<0.05），而非优势血管中包频率的差异不显著(补充图3a，p值=0.068）。淋巴结中的包频率遵循相似的模式，在到达状态和稳定状态下，优势淋巴结的包频率显著高于非优势淋巴结（p值<0.05，补充图3b). 优势血管的转运时间明显较短，优势血管中首先出现荧光的时间比非优势血管早至少30秒[p值<0.05]，并且这种趋势在淋巴结中复制，优势淋巴结中的荧光出现在非优势淋巴结前约1.5分钟(图4e).

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外泌体转运特性体内试验。

(一)淋巴收集管中的稳态荧光(b条)在10分钟内代表性血管中外显子运输的特定感兴趣区域的强度分布(c（c）)引流淋巴结中的稳态荧光(d日)10分钟内代表性淋巴结中特定外显子转运感兴趣区域的强度分布(e（电子）)主要和非主要收集血管和引流淋巴结的荧光检测水平到达时间。

为了验证HEY外泌体的转运特征是淋巴转运的特征，而不是细胞来源的特异性，我们注射了来源于小鼠淋巴内皮细胞系（SV-LEC）的外泌物。我们能够概括收集血管和淋巴结的转运动力学和特征(附录4a–d). 收集血管和引流淋巴结的到达时间具有可比性(补充4e)HEY和SV-LEC外泌体之间的包频率具有可比性。

外显子滞留的表征体内

在收集淋巴管排出的坐骨神经淋巴结中可以快速看到胞外体团，荧光到达两个主要淋巴结(图5a)5分钟内非优势节点(图5b,补充视频2). 注射后30分钟，节点达到稳定的荧光状态，与收集血管非常相似；然而，与荧光在24小时内消失的血管不同，注射后至少2天，可以通过皮肤检测到淋巴结荧光(图5c、e分别）。2小时2天切除的淋巴结呈强荧光(图5d，f分别）。

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外显子滞留的表征体内试验。

在节点中快速检测到外显体：(一)5分钟时，只有主节点可见体内, (b条)两个节点在15分钟时都可见体内, (c（c）)在切除前2小时观察到引流淋巴结（动物）(d日)注射后2小时切除淋巴结(e（电子）)2d预切除时显示的引流淋巴结（动物）(（f）)注射后2天切除的淋巴结，规模=5 mm(克)注射后2小时和2天分析小鼠器官中外泌体的生物分布，以及(小时)荧光法测定注射后1小时淋巴结中残留的外泌体和珠蛋白的定量。

在注射后2小时和2天从两只小鼠身上采集包括心脏、肺、肾脏、脾脏、肝脏和胰腺在内的多个器官并消化。在每个器官中测量荧光，以量化每个器官的胞外体滞留。注射后2小时，外显子主要分布在注射部位、引流淋巴结、肾脏和肝脏中，2天后，外显体在淋巴结、脾脏、胸腺和肾脏中积聚。尾部注射部位仍有很大一部分(图5g).

我们将珠子和SV-LEC外泌体一起注射到小鼠体内，以比较淋巴吸收特性，并在注射后1小时在平板阅读器上使用荧光定量淋巴结中注射剂量的百分比。虽然外泌体被保留到相似的程度，但珠子保留得很差，主要节点仅占摄取的2%。非优势节点的珠子保留率很低（<1%）(图5h).

引流淋巴结中胞外体滞留的特征

为了调查负责外泌体在引流淋巴结中摄取和滞留的细胞群，通过免疫染色或消化淋巴结，并使用FACS定量外泌物信号与免疫细胞标记物的共定位来分析显性和非显性淋巴结(图6a). 显性淋巴结中的外泌体比例明显高于非显性淋巴结，（p值<0.05）这一现象在2小时和2天都可以观察到(图6b、c分别）。虽然消化结细胞中残留的外泌体数量从2在显性淋巴结和非显性淋巴结注射后2小时至2天，它们仍然含有10–15%的注射外泌体，并且外泌体量是腋窝淋巴结的1500倍，腋窝淋巴淋巴结是研究的对照淋巴结，因为它没有直接排出局部外泌体内的注射部位(图5g和​和6d）。6d） ●●●●。在引流淋巴结内，外泌体主要存在于2个特定区域：淋巴结的整个外围和靠近外围的小圆形区域，分别对应于肩胛下窦（SCS）和淋巴结滤泡区域(图6e–g).

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外泌体滞留在引流淋巴结中的特征。

(一)小鼠切除后节点处理示意图(b条)优势淋巴结在2小时时保留大量外泌体(c（c）)优势节点在2天时保留了大量外泌体(d日)显性和非显性节点分别在2小时和2天时对胞外体保留的定量(e（电子）)第2天节点内的外显子定位；(（f）)融合图像与整个节点核染色和外显子定位(克)节点中的放大区域显示外显子定位。比例尺；10微米。

CD11b+和CD19+细胞在外体摄取中的作用

确定主要体内针对外泌体，我们对PKH阳性细胞进行分类，并用各种免疫细胞亚群标记物（包括CD11b（巨噬细胞）、CD19（B细胞）、CD4（辅助T细胞）和CD8（杀伤T细胞）量化外泌物信号的共同定位。CD11b在位于淋巴结包膜下窦内的单核细胞和巨噬细胞表面大量表达24在显性和非显性淋巴结中，外显体与CD11b+巨噬细胞共定位，但在2小时时，显性淋巴结的巨噬细胞-外显体共定位比非显性淋巴结大约2倍(图7a，b）。从2小时到2天，显性和非显性淋巴结中巨噬细胞内的外显子定位都减少了一半(图7c、d、i）。

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流式细胞术检测淋巴结中CD11b和CD19细胞对外显子的摄取。

主要淋巴结被消化并染色(一)CD11b在2小时时(c（c）)CD11b在2天时(e（电子）)CD19在2小时时(克)CD19为2天。非优势淋巴结染色(b条)CD11b在2小时时(d日)CD11b在2天时(（f）)CD19在2小时时(小时)CD19在2天和(我)显性和非显性淋巴结在2小时和2天时对胞外体摄取的定量分别表示为PKH67阳性细胞的百分比。

CD19在B细胞上表达，并存在于淋巴结包膜下窦下方的B细胞滤泡中。外显子在2小时时未与CD19+B细胞共定位(图7e，f），但在2天时强共定位，优势节点保留约2倍于非优势节点(图7g–i）。在任何一个时间点都没有与CD4+或CD8+T细胞共定位（数据未显示）。

最后，我们通过冰冻淋巴结切片的免疫染色证实了外泌体与CD11b巨噬细胞和CD19 B细胞的共同定位。我们观察到来自外泌体的PKH（绿色）信号与来自巨噬细胞的CD11b和来自B细胞的CD19强烈共存(图8a、c分别）。此外，我们还检查了CD169与外显子的共定位，以确认巨噬细胞介导的外显子捕获(图8b). 为了确保PKH信号仍然存在于完整的外显体上，我们检查了CD81的表达，发现CD81和PKH的共存程度很高，表明染料仍然与外显体膜相关(图8d).

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外泌体在淋巴结内的定位。

图示为注射10 ug外泌体（绿色）后2天的连续淋巴结切片。免疫细胞被鉴定为显示（红色）的抗体(一)CD11b（巨噬细胞）(b条)CD169（巨噬细胞），和(c（c）)CD19（B细胞）(d日)CD81（红色）被用作二级定位标记，以确认外显子在淋巴结中的滞留。白色比例尺=50 um，而黄色比例尺为5 um。

讨论

引流淋巴结是外泌体的稳定保留位点，优势淋巴结和非优势淋巴结中保留的外泌体数量从2小时到2天稳步增加。外显子携带功能性mRNA和miRNA，导致受体细胞基因表达的改变25它们还被证明在从感染细胞释放时携带抗原，从而抑制炎症反应体内26因此，胞外体在淋巴结的转运和滞留速度在先天免疫反应中具有重要意义。抗原提呈细胞可以在皮肤等周围组织中获得抗原，通过淋巴管迁移到淋巴结并激活免疫反应27巨噬细胞可以释放携带特异性抗原的外泌体，以在淋巴结处启动免疫反应：结核分枝杆菌感染的巨噬细胞释放含有分枝杆菌脂蛋白的外泌体，能够刺激小鼠的促炎反应6我们的数据表明，外泌体可以在5分钟内到达淋巴结并被Cd11b+巨噬细胞吞噬，因此，与皮肤抗原提呈细胞向淋巴结迁移相比，外泌物提供了从外周向淋巴结转移信息和抗原的更快途径，而外泌物向淋巴结移动可能需要数小时。此外，这一过程将允许一些APC留在感染的周边部位，以调查进一步的感染迹象，同时预先警告淋巴结有危险，并提供编码在外泌体中的感染性质的具体信息。观察到DC在毛细淋巴管内部继续爬行，即使在炎症期间，也常常是沿着与淋巴流相反的方向爬行，这一点得到了支持28进一步研究阐明APC通过外泌体包装和分泌相关抗原和RNA分子的时间，有助于更全面地理解这一过程。此外，引起反应所需的外泌体数量尚不清楚，可能会影响节点处反应的大小。

虽然从检测时起，两个淋巴结都显示出稳定的荧光，并且在切除后（2小时或2天）都显示出明亮的荧光，但淋巴结中的大多数外体摄取是在注射后的第一个10分钟内。虽然动物体内两个淋巴结的深度和直径的细微差异可能会导致这种现象，但我们在切除后无法观察到淋巴结大小的明显差异。

外显体在肝脏中积累最多，其次是注射部位和肾脏，胃和肠显示少量外显体存在。另一项外体生物分布的研究表明，尾静脉注射30分钟后，肝脏和脾脏中存在外体29。虽然我们检测到来自肝脏的强烈信号，但在2天的时间点之前，我们无法检测到脾脏中的任何外泌体。通过血液和淋巴的运输可能会导致外泌体在整个动物体内的不同生物分布，皮内注射导致淋巴运输，并在淋巴结和肝脏中积聚，而静脉注射则导致血液运输和在脾脏和肾脏中积聚。这是一个重要的发现，因为体内间质细胞释放的外泌体必然通过淋巴运输集中在淋巴结中。有趣的是，在这两种情况下，淋巴器官与肝脏一起参与胞外体滞留。桑德森证实了这一现象等人。14，其中静脉注射的外泌体在脾脏中积聚，皮下注射导致注射后60分钟在淋巴结中积聚。我们认为，由于外泌体的淋巴靶向性和对淋巴结的高滞留水平，外泌物在2小时内没有足够的量进入循环，从而解释了仅在两天的时间点脾脏和胸腺中出现外泌物质的原因。

众所周知，淋巴流和由此产生的免疫反应密切相关30在某些炎症情况下，淋巴流本身可以通过免疫细胞的募集来调节，从而改变引流淋巴结的传入血管的收缩力31虽然一些论文暗示了外泌体的淋巴运输13,14他们关注的是外泌体在淋巴结的下游滞留和影响，而淋巴引流的作用被忽视了。我们的结果表明，淋巴流可以将外泌体从外周转移到引流淋巴结，而引流至淋巴结的传入血管的运输能力有助于外泌物在淋巴结之间的分布，由于主要的收集血管将较高的外泌体有效载荷传送到主要的淋巴结，即使两个淋巴结似乎都在排出相同的组织空间。这种分布即使在两天内也保持一致，这是我们所知的第一项研究，表明淋巴结中抗原的数量与淋巴流向该淋巴结的流量相关。此外，人类和小鼠细胞系来源的外泌体的淋巴吸收动力学相似，这意味着淋巴运输是外泌物从外围运输到引流淋巴结的常见方式，而不是取决于细胞来源生物状态的选择性途径。未来对不同细胞类型的外泌体的淋巴滞留和生物分布进行研究，有助于了解起源细胞在外泌体命运中的作用体内.

HEY细胞是一种卵巢癌细胞系，HEY外泌体在淋巴结中的强烈滞留相当于黑色素瘤外泌体在淋巴结的滞留32鉴于卵巢癌的预后最差33，在转移过程中通过腹膜后淋巴管扩散34以及大量关于肿瘤外泌体调节淋巴结免疫反应的报道7,35，了解这些外泌体的淋巴运输将进一步阐明淋巴运输在癌症进展中的作用。

外泌体进入淋巴结的快速摄取似乎也受到初始淋巴管内皮细胞中对外泌体具有选择性的主动转运机制的促进，因为LEC的存在在体外特别增强了外泌体通过渗透膜的转运，但没有大小匹配的纳米粒子或低分子量右旋糖酐。事实上，在37°C时，胞外体的转运比大小匹配的珠高10倍。在4°C时，胞外体转运减少80%，进一步表明细胞转运活跃。这与先前的数据一致，表明外显子摄取是肌动蛋白依赖性的18和活动36。外显子摄取的分子机制没有很好的特征，存在争议。包括网格蛋白介导的内吞作用在内的几种机制37胞饮作用、血浆和膜融合以及吞噬作用38没有达成多少共识。一旦对摄取机制有了更清楚的了解，特异性抑制剂可以梳理出这些途径在淋巴内皮细胞外泌体摄取中的作用。进一步研究细胞内隔间以及参与外体穿梭的表面受体的特性，将揭示能够实现选择性吸收和运输的潜在运输机制。最近有报道称，淋巴管内皮细胞中其他颗粒的快速和主动运输，包括脂蛋白、抗原和白蛋白结合的游离脂肪酸，表明主动淋巴运输虽然具有选择性，但并不局限于外泌体39,40,41,42.

体内，最初的淋巴管有独特的纽扣连接，当与锚定纤维结合时，可以吸收液体并将其从间质运输到最初的淋巴道43此外，研究表明，跨壁血流增加可改变LEC中细胞-细胞连接蛋白的表达，从而增加摄取44因此，注射外泌体丸将增加间质流体压力、淋巴流，从而通过主动重新排列连接处间接或直接吸收外泌体来改变淋巴通透性。很可能这种被动引流与主动细胞转染协同作用，进一步增强胞外体从间质空间的清除。

淋巴管内皮细胞（LECs）最近被证明在清除抗原并将其呈递给同源T细胞方面发挥积极作用45收集淋巴通透性也可以通过周围脂肪组织中的抗原提呈细胞来增强淋巴抗原的取样46因此，LEC对外泌体的选择性运输进一步证明了它们在建立免疫中的积极作用，因为它们有助于外泌体暴露于免疫细胞。

巨噬细胞和B细胞对显性和非显性淋巴结的胞外体摄取存在很大差异。虽然这种差异可能部分是由于每个节点接收到的外泌体数量不同造成的，但它可能无法完全解释所观察到的差异。囊下窦中的巨噬细胞可以捕获并保留淋巴管中的抗原长达72小时，然后将其完整地呈递给B细胞47,48此外，T细胞通过同源相互作用将外显体转移到免疫突触处的APC49虽然还需要进一步研究，以了解外泌体在淋巴结内运动的动力学，例如RNA和蛋白质从淋巴结外泌体内释放的时间和位置，以及这种机制对免疫细胞亚群的调节，但类似的机制可能是外泌物体转移的潜在原因。需要进行进一步的研究，以确定这些共同定位的差异是否会影响抗原存在时每个淋巴结的免疫反应，这可能揭示淋巴结先天免疫反应发展的重要信息。

总之，我们的研究结果强调了淋巴通透性和引流在外泌体从外周向淋巴结转运中的重要性。这项工作还揭示了参与外显子在淋巴结滞留的免疫细胞亚群，这是迄今为止未知的，可能被用于淋巴结靶向。出乎意料的是，两个引流淋巴结之间的外泌体的差异分布，这就为免疫反应和疫苗反应期间抗原的分布提出了新的问题，表明显性淋巴结和非显性淋巴结中的免疫细胞生态位之间存在细微差异。淋巴向淋巴结的快速输送和外泌体对下游细胞的功能影响可能是药物输送的有力结合，但还需要做大量的进一步工作才能释放所有的可能性。

方法

细胞培养

将胎牛血清（亚特兰大生物制品公司，佐治亚州劳伦斯维尔）在120000 g，4°C下离心15小时，以去除外泌体，并用于制备无外泌物细胞培养基。人类新生儿皮肤淋巴管内皮细胞（LECs）最初如前所述采集39LECs在烧瓶中用50μg/mL I型鼠尾胶原蛋白（BD Biosciences，Bedford，MA）在0.1%乙酸中涂敷1小时，并在补充了20%不含胞外体的FBS、1%青霉素-链霉素-安非他命霉素、1%谷氨酰胺（均来自纽约州格兰德岛生命科技公司）、25mg/mL环腺苷酸和1 mg/mL醋酸氢化可的松（均来自密苏里州圣路易斯市西格玛）。每2-3天更换一次培养基，并在第9代和第10代使用LEC进行实验。人类卵巢腺癌细胞系HEY细胞（加拿大安大略省Cedarlane实验室）在RPMI 1640（Mediatech，Manassas，VA）中培养，补充10%的游离胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES缓冲液（均来自Mediaech）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）（Life Technologies）48培养基用于超速离心分离外泌体。如前所述培养SV-LEC30并被用作小鼠外泌体的来源。

外显子的分离和鉴定

从90%汇合处的HEY细胞中收集条件培养基，用于外泌体分离。简单地说，以300 g的浓度旋转培养基10 min，以去除死细胞，然后以16500 g的浓度进行旋转20 min。然后，通过0.22μm过滤器过滤上清液，并以120000 g的速度离心120 min。将含有外泌体的颗粒重新悬浮在适当体积的PBS中。

使用Zetasizer Nano ZS90（Malvern Instruments Ltd，Worcestershire，UK）检查获得的囊泡的大小均匀性，并使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）进行量化。为了分析外泌体表面标记物的表达，用抗CD9抗体（BD Biosciences，San Diego，CA）包被4μm醛/硫酸盐乳胶珠（Life technologies）过夜，并与30μg外泌体孵育。用生物素包裹珠子，捕获并评估经链霉亲和素包裹的荧光珠的表面标记表达。用抗人CD81-PE或抗人CD63-PE（BD Biosciences，San Diego，CA）探测外显体-基底复合物，并在BD-LSR II流式细胞仪上获得数据。使用FloJo软件（FlowJo版本10，阿什兰，OR）进行数据分析。

扫描电子显微镜

用3.7%戊二醛（Sigma–Aldrich GmbH，Taufkirchen，Germany）将外显体固定在碳棒上15分钟。用PBS洗涤两次后，用升序的乙醇（40%、60%、80%和98%）将固定的外显体脱水。乙醇蒸发后，将样品置于玻璃基板上在室温下干燥24小时，然后使用日立冷场发射SEM SU8200（日立High-Tec，日本东京）进行分析。

外泌体的荧光标记

按照制造商的说明，使用PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒（Sigma-Aldrich）对外显子进行标记。简单地说，将PBS中的外显体添加到500μL稀释剂C中，并将2μL PKH67染料添加到500微升稀释剂C中。将两种溶液混合并在室温下培养5分钟。添加1 ml 1%BSA以停止反应。标记的外泌体在120000 g下离心70分钟，并用PBS洗涤两次，以去除多余的染料。

根据制造商的说明，使用IRDye®800CW蛋白质标记试剂盒（利科尔，林肯，东北）用近红外染料标记PKH标记的外显子。简单地说，将PBS中的外显子与IRDye®800 CW NHS酯混合过夜，并使用Zeba脱盐自旋柱（Pierce）去除游离染料。

转运分析和数据分析

在PBS中用100μg/mL的I型鼠尾胶原蛋白涂覆具有3μm孔的Transwell®渗透膜支架（Corning Life Sciences，Corning，NY）1小时，并以100000个细胞/cm的密度接种LECs2培养48小时(图2a). 一部分Transwell没有接种细胞，并用于测定膜渗透性(P（P）eff_cell-free（无影响）). 在运输实验之前，细胞在无血清、无酚红EBM（Lonza）中培养1小时。用含有20μg/mL PKH标记的外泌体、20μg/mL FluoSpheres®羧酸修饰的40nm微球、5μg/mL 3kDa级联蓝葡聚糖（均来自Life Technologies）的荧光混合物培养单层的基底侧1h.从顶端收集含有转移荧光外显体和珠的样品。在一组实验中，转运时间从5分钟到30分钟不等，而不是1小时。使用Synergy™H4多模平板阅读器（Biotek、Winooski、VT）测量荧光，并根据荧光混合物生成的标准曲线计算相对浓度。外泌体、珠状物和右旋糖酐的有效渗透率使用以下公式计算：

P（P）效率 = Js公司ΔC⋅S公司，其中Js公司是通量，∆C是浓度梯度，以及S公司是表面积39.从横孔顶部取出样品进行荧光测量并计算P（P）效率，将含有LEC的膜用PBS冲洗两次，用4%PFA固定，用DAPI和Alexa Fluor®647 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific）染色，并安装在玻璃载玻片上，在蔡司LSM 700（纽约桑伍德蔡司）上成像。使用Image J分析软件（v 1.4.1，NIH）量化图像中的荧光。

外泌体近红外成像的优化

为了使用NIR表征真皮中外来体成像的参数，如前所述创建了组织模型（补充图2a）15此外，还创建了具有两个固定深度设置的节点模型；5 mm和7 mm用于描述节点外显子检测的成像设置。根据先前公布的方法，使用97.52%的硅橡胶基（Sylgard 184，Dow Corning）、2.22%的氧化铝（Sigma Aldrich）和0.26%的化妆粉（Max Factor Crème Puff Deep Beige 42）的混合物在标准培养皿中模制节点模体31.

小鼠的近红外成像

NIR成像系统的设置如上所述15摄像机被连接到一台计算机上，视频由定制的LabView VI（国家仪器）采集和分析。

外泌体的淋巴运输被量化体内按照佐治亚理工学院IACUC审查委员会批准的程序，在八周龄雄性Balb/C小鼠（马萨诸塞州威明顿市查尔斯·里弗实验室）的尾部进行试验。所有方法均按照这些批准的指南进行。为了最大限度地减少光散射，在实验前1天，使用脱毛乳液去除尾部和背部感兴趣区域的毛发。

用异氟烷通过鼻锥持续给小鼠（n=10）麻醉，并皮内注射10 ug（10 ul of 1）ug/ul）。注意将注射物放置在尽可能靠近尾部中线的位置，以避免一个收集血管优先于另一个。少量液体注射和使用近红外增强组织渗透，确保注射部位下游只能看到较深收集淋巴管中的荧光。在皮内注射染料之前开始图像采集，注射后20分钟以每秒1帧的帧速率对动物进行连续成像，相机曝光时间为50定期对引流血管、注射部位和引流淋巴结进行成像，以监测外泌体从外周向淋巴结的运动。

为了评估每只小鼠的淋巴功能，如前所述测量了两个参数：传输时间和包裹在记录位置视野中的平均速度22。在视频1中可以看到荧光到达收集容器的示例，在荧光到达期间荧光强度随时间变化的曲线图可以在中看到图4使用收集容器中两个感兴趣区域（ROI）产生的荧光强度随时间变化的曲线图测量数据包数量，称为数据包频率。

体外节点分析

将小鼠安乐死，分为2组；第1组（n=5）在安乐死前注射后2小时进行监测和成像，第2组（n=5）在注射后2 h进行成像，第1天和第2天再次进行安乐死。安乐死后，从两组小鼠身上采集引流（骶骨）淋巴结和对照（腋窝）淋巴结。此外，每组一只小鼠的肝脏、脾脏、胰腺、肾脏、心脏、肺、胃、肠、胸腺和注射部位均被切除，并在FastPrep 24均质机（MP Biomedicals，Santa Ana，California）中使用1.4 mm锆珠预填充管（OPS Diagnostics，Lebanon，NJ）均质。上清液用于测量Synergy™H4多模式平板读取器（Biotek）中的荧光，以计算每个器官的外显子滞留。两组中的一组淋巴结（骶部和腋下）在Tissue-Tek OCT（VWR，Radnor，PA）中进行snap冷冻，并在Winship癌症研究所的病理核心处进行切片。

淋巴结切片的荧光共聚焦显微镜

将切除的骶淋巴结和腋窝淋巴结冰冻切片用10%牛血清白蛋白封闭在PBS中，与一级抗体孵育过夜，然后用二级抗体孵育2天h.主要抗体为抗鼠CD19、抗鼠CD4、抗鼠CD8A（均来自Life Tech）、抗鼠CDM14（Sigma）、抗小鼠CD169（Thermo Fisher Scientific）、抗人CD81（BD Biosciences）。使用与Alexa Fluor 647或Alexa 680（Life Tech）结合的二级抗体检测这些切片，并使用蔡司LSM 700通过共焦显微镜成像。

节点流式细胞术

用胶原酶D（德国曼海因罗氏有限公司）消化第1组（n=3）和第2组（n/3）收集的淋巴结，并使用70μm孔径过滤器均质。用BSA（BD Pharmingen，加州圣何塞）冲洗细胞颗粒染色缓冲液，并在300 g离心1分钟。为了量化整个淋巴结中的胞外体滞留，使用LSR II流式细胞仪（BD Biosciences，加州圣荷西）分析PKH67阳性细胞群。为了确定引起胞外体摄取的细胞亚群，在FACS Aria II细胞仪（BD Biosciences）上对PKH67阳性细胞进行分类，并用抗小鼠CD14、抗小鼠CD19和抗人CD81的单克隆抗体与PE或AF647偶联，在4小时后染色30分钟在黑暗中°C。数据是在LSR II流式细胞仪（BD Biosciences）中获得的，使用单染色细胞进行补偿。使用FlowJo软件（版本10）进行数据分析。

统计分析

T检验用于比较外显体和珠子（未配对）、外显体及珠子在37℃和4℃下的转运（配对）、显性和非显性血管和淋巴结的到达时间（配对）之间的tetraspanin标记的表达水平。利用配对t检验分析外显子在淋巴结中的滞留以及巨噬细胞和B细胞的摄取。所有分析均在Prism 6（GraphPad Software Inc，La Jolla，CA）中进行，显著性定义为p>0.05（无显著性-ns）p≤0.05（*）、p≤0.01（**）、p≤0.001（***）和p≤0.0001（***）。所有数据均表示为平均值±标准偏差。

其他信息

如何引用这篇文章：Srinivasan，S。等人。外泌体的淋巴运输是向淋巴结快速传播信息的途径。科学。代表。 6, 24436; doi:10.1038/srep24436（2016）。

补充材料

补充电影1：
单击此处查看。（460万，移动）
补充电影2：
单击此处查看。（7.1M，mov）
补充信息：
单击此处查看。（690K，pdf）

致谢

这项工作的部分资金来自Petit生物工程和生物科学研究所的跨学科种子基金，S.S.的部分资金来源于Scheller商学院的TIGER奖学金。作者还想感谢Alana Reed博士在这个项目上的初步工作。

脚注

作者贡献J.B.D.和F.V.设计了实验。S.S.进行了所有的实验工作。S.S.、J.B.D.和F.V.分析了数据，撰写并审阅了手稿。

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