纳米银通过ROS介导的信号通路诱导HePG-2细胞凋亡

AgNPs的合成

AgNO储备溶液_三通过溶解16 mg AgNO制备（400μg/ml）_三将粉末放入40 ml Milli-Q水中。维生素C（400μg/ml）也通过将16 mg维生素C溶解在40 ml Milli-Q水中来制备。AgNPs的制备如下：简单地，将0.1 ml 400μg/ml维生素C滴加到4 ml 400μg/ml AgNO中_三磁力搅拌2h。过量VC和AgNO_三通过对Milli-Q水进行24小时透析消除。在每次实验之前，使用水浴2分钟对含有纳米颗粒的溶液进行超声波处理（KQ-100VDB），并通过0.2微米孔径的过滤器。AgNP浓度通过ICP-AES（电感耦合等离子体原子发射光谱法）检测。

AgNP的表征

通过透射电子显微镜（TEM，Hitachi，H-7650）对银纳米粒子的形态进行了表征。通过Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments Limited）颗粒分析仪检测AgNPs的粒度分布和zeta电位。在EX-250系统（Horiba）上进行EDX分析，并用于检查AgNPs的元素组成。

细胞活力测定

HePG-2细胞在添加抗生素和10%FBS、青霉素和链霉素的DMEM中培养，培养箱中有5%的CO₂大气温度为37°C。如前所述，AgNPs的细胞毒性通过MTT试验检测[30]. 简单地说，通过测量细胞将MTT转化为紫色甲素染料的能力来测定细胞活力。HePG-2细胞以4×10的密度接种在96周的培养板中⁴37°C下每孔细胞数24小时。然后，用不同浓度的AgNPs处理细胞72小时。处理后，添加20μl/孔MTT溶液（PBS中为5 mg/ml），并再培养5 h。去除培养基并用150μl/孔二甲基亚砜替换，以溶解甲霜晶体。使用微孔板分光光度计（Versammax）在570 nm处测量甲霜溶液的颜色强度，以反映细胞活力。测试重复次数为三次。

AgNP的细胞内贩运

为了测定AgNP的体外细胞摄取，将含有荧光染料6-香豆素的纳米粒子添加到反应系统中。作为AgNPs探针的掺入染料提供了一种灵敏的方法来确定其细胞内定位。与之前一样，用DAPI和Lyso Tracker监测6-香豆素标记的5μg/ml AgNP在HePG-2细胞中的定位[31]. 在2-cm细胞培养皿中培养至70%融合的处理细胞与Lyso Tracker Red（染色2 h）和DAPI培养{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“H33258”，“term_id”：“978675”，“term_text”：“H13258”}}H33258号加入（染色30分钟）。用PBS冲洗细胞三次，然后用6-香豆素载银纳米粒孵育0至120分钟，荧光显微镜检测。

流式细胞术分析

如前所述，流式细胞术用于表征AgNPs对细胞周期分布的影响[32,33]. 简单地说，收集与AgNP孵育24小时的细胞，并以1500 rpm离心5分钟。将收获的细胞在−20°C下用预冷却的70%乙醇固定24小时。细胞在黑暗中PI染色半小时，用Multicycle软件检测亚二倍体DNA含量的凋亡细胞。

ROS生成的测定

如前所述，用DCF荧光染色细胞检测AgNP处理的HePG-2细胞的细胞内ROS生成[34,35]. 简单地说，收集细胞并用DCFH-DA将其悬浮在PBS中，最终浓度为10 mM，温度为37°C，时间为30分钟。然后，收集染色细胞并将其重新悬浮在PBS中。通过使用荧光显微镜和微孔板阅读器检测荧光强度来检测ROS水平，并将激发波长设置为500 nm和529 nm。实验一式三份。

Western印迹分析

如前所述，通过Western blotting检测AgNPs对HePG-2细胞中各种细胞内蛋白表达水平的影响[36,37]. 用AgNPs处理HePG-2细胞，用裂解缓冲液培养以获得细胞总蛋白。用BCA法检测蛋白质浓度。将蛋白质（10μg）加入每个孔中。将膜与一级和二级抗体以1:1000的稀释度在5%的非脂肪乳中孵育。用增强化学发光检测试剂（ECL）观察蛋白质条带。

AgNP的本地化和吸收途径

细胞内吞是细胞摄取纳米颗粒的主要途径之一[38]. 为了检测纳米粒子的细胞内移位，通过同时染色细胞核来追踪AgNPs在HePG-2细胞中的定位。

如图所示2发现AgNPs和溶酶体的共定位在HePG-2细胞膜中积累，此后逐渐增强。AgNPs在60分钟后从溶酶体中逸出，进入胞浆，120分钟后分布于细胞内。这一结果表明溶酶体是AgNPs的靶细胞器。

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图2

HePG-2细胞中6-香豆素标记的AgNPs。用6-香豆素标记的AgNPs处理HePG-2细胞不同时间，并在荧光显微镜下用Lyso Tracker Red（溶酶体）和DAPI（细胞核）染色

AgNPs的体外抗癌活性

MTT法检测AgNPs对HePG-2细胞的杀伤作用。如图所示3a年，AgNPs以剂量依赖的方式显著抑制HePG-2细胞的生长。

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图3

对HePG-2细胞的生长抑制作用。一用不同浓度的AgNPs处理细胞72 h，并用MTT法测定细胞活力。b条HePG-2细胞的形态学变化。具有不同字符的条形图在P（P） < 0.05（*）或P（P） < 0.01(**)

用5μg/ml AgNPs处理HePG-2细胞72小时后，细胞存活率降低至95%。在浓度为10和20μg/ml时，AgNPs使细胞存活率分别降至83%和49%。AgNPs的抗癌活性也得到了进一步证实，如图所示3亿用AgNPs处理的细胞表现出细胞质收缩和细胞间接触的丧失。综上所述，这些结果表明AgNPs以剂量依赖的方式抑制癌细胞生长。

AgNPs诱导细胞凋亡

细胞凋亡在多种不同的生物系统中起着重要作用，包括正常细胞周期、免疫系统、胚胎发育、形态变化和化学诱导的细胞死亡[39]. 因此，采用流式细胞术研究凋亡是否参与AgNPs引起的细胞死亡。DNA片段化的凋亡细胞在DNA直方图中呈现典型的亚G1峰。如图所示4a类,​、b、，b条5μg/ml的AgNPs使凋亡细胞的百分比增加到8.62%。然而，亚G1期凋亡细胞群以剂量依赖的方式显著增加。在浓度为10和20μg/ml时，AgNPs使凋亡细胞分别增加到19.83和25.11%。结果表明，AgNPs抑制HePG-2细胞增殖。

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图4

HePG-2细胞经AgNPs处理72h后流式细胞术分析，70%乙醇固定后PI染色。如所示一和b条采用PI流式细胞仪分析不同处理后细胞周期分布和凋亡细胞数量。具有不同字符的条形图在P（P） < 0.05（*）或P（P） < 0.01(**)

AgNPs诱导活性氧生成

活性氧被认为是细胞凋亡的关键激活剂，尤其是抗癌药物诱导的细胞凋亡[40]. 因此，在本研究中，通过DCF荧光分析测定活性氧的生成，以揭示其在AgNPs作用机制中的作用。如图所示5a、bAgNPs逐渐增加HePG-2细胞内ROS的生成；在浓度为20μg/ml的HePG-2细胞中发现DCF的荧光强度更强。如图所示5c、 当浓度为5、10和20μg/ml时，AgNPs使细胞内ROS生成分别增加至153、229和290%。这些数据表明，ROS的参与可能在抗癌作用中发挥重要作用。

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图5

AgNPs诱导的ROS过度生产。一–c（c）细胞内活性氧生成的变化。通过DCF荧光强度检测ROS水平。具有不同字符的条形图在P（P） < 0.05（*）或P（P） < 0.01(**)

本研究得到了国家自然科学基金（NO:309726300）和广东省自然科学基金会（NO:1015101200000002）的资助。