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临床投资杂志。1999年12月15日；104（12）：R63–R67。
数字对象标识：10.1172/JCI8476号
预防性维修识别码：项目经理480919
PMID：10606632

MHC II类四聚体鉴定肽特异性人CD4+T细胞增殖对甲型流感抗原的反应

埃里克·J·诺瓦克,1中，2 安德鲁·W·刘,1 杰拉尔德·T·内蓬,1和威廉·W·郭1
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摘要

存在于外周血中的极低频率抗原特异性T辅助细胞能够在抗原激发期间快速克隆扩增。这种反应的高度特异性可激活和扩大一组非常精选的T细胞，这是我们用来直接识别和量化外周血中人类表位特异性T辅助细胞的特征。构建了可溶性四聚体II类MHC分子，该分子装载了来自血凝素（HA）的免疫优势肽并用荧光染料标记，用于直接识别流感免疫个体的抗原特异性T细胞。在HA肽或流感疫苗刺激下增殖7天后，HA四聚体阳性的细胞经历了6到9次分裂，CD3+，CD4细胞+，CD25+和CD8–激活的T辅助细胞对抗原反应的特征。对全流感疫苗的复杂反应中HA表位特异性成分是增殖性T辅助细胞的主要亚群。可溶性II类四聚体允许直接分析免疫显性抗原特异性。外周血中抗原特异性T辅助细胞的鉴定为追踪感染因子和自身免疫疾病的免疫反应提供了一种手段。

这篇文章可能是在印刷版之前在网上发表的。发布日期可从JCI网站获取，http://www.jci.org。临床杂志。投资。 104：R63–R67（1999年）。

介绍

选择性扩增和激活极少数抗原特异性前体细胞是适应性免疫反应的一个显著而基本的特性。评估人类抗原特异性T细胞反应的技术受到检测如此小的反应细胞群所需的特异性和敏感性要求的阻碍。在模型系统中，单T细胞受体（TCR）分子转基因小鼠已成功用于跟踪抗原特异性反应的演变，并对抗原特异性扩增的机制提供了很多见解(1–5). 尽管如此，这些方法仅限于固定TCR的研究，无法解决跟踪TCR库进化或识别复杂系统中抗原特异性T细胞的问题。新的方法对于研究人类TCR序列的进化尤其重要，其中表位特异性TCR的发展模式可以决定对疾病的反应和自身免疫性疾病的风险(6,7).

最近，使用MHC I类配体开发了一种检测可溶性多聚肽-MHC复合物特异性T细胞的关键方法(8). 许多研究已将可溶性MHC I类分子用于抗原特异性CD8的鉴定、计数和表型分析+外周血T细胞(9–11). Ⅱ类依赖性CD4的比较研究+然而，由于可溶性II类肽复合物的制备困难，抗原特异性CD4的频率较低，T细胞反应一直缺乏+T细胞和MHC-肽-TCR结合的低分子间亲和力。

此前，Crawford等人描述了一种设计II类分子的方法，其中感兴趣的肽与MHC分子的β链共价连接，以确保其在合成过程中位于肽结合槽中(12). 以这种方式产生的肽-MHC多聚体已被用于鉴定转基因小鼠的T细胞，该转基因小鼠具有蛾细胞色素特异性的α/βTCRc（c）由于TCR转基因的引入，大多数T细胞在此系统中被II类四聚体结合。相反，人类表位特异性T细胞的频率明显较低，这就需要一个更敏感的系统来成功追踪CD4+T细胞反应。CD4细胞+T细胞在启动和引导大多数适应性免疫反应中的抗原识别以及对疫苗和自身免疫刺激的反应中起着关键作用。因此，我们开发了一种使用可溶性人类II类四聚体检测此类细胞的通用方法，并描述了对甲型流感病毒复杂免疫反应的表位特异性成分的特性。

方法

DR0401–亮氨酸拉链–生物素化位点表达载体的构建。

利用PCR-介导的剪接重叠技术制作了包含DR/亮氨酸拉链（LZ）编码区的嵌合盒(13,14). 为了生成可溶性DRA1链，在第一轮中使用引物对（+）5′-AGAATTCATGGCATAAGTGGAGTCCC-3′和（-）5′-CGAGGTGCTGGACGACTCGTAGTCTGGG-3′（与碱性LZ的5′端同源）扩增DRA1*0101的cDNA，每个引物的浓度为4 nM。在第二轮扩增中，第一轮产物被用作pN15LZα模板上的初始（+）引物，该模板包含基本的LZ cDNA基序，浓度为10 pM，以形成DRA1/LZ嵌合体（pN15L Zα和pN15L2β是美国纽约布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院D.Ostrov和S.Nathenson赠送的礼物）。引物对（+）5′-AGAATTC公司ATGGCATAAGTGGAGTCCC-3′和（–）5′-CTGGTACC公司然后用ATCCTACTGGGCGAGTT-3′（与碱性LZ的3′端同源）扩增嵌合体。将该片段TA克隆到pCR2.1-TOPO（Invitrogen Corp.，San Diego，California，USA）中，测序，然后亚克隆到Cu诱导的果蝇属表达载体pRmHa-3（来自L.S.B.Goldstein，Howard Hughes Medical Institute，LaJolla，California，USA的礼物）使用生态RI和千磅我的网站被设计成第二轮引物（下划线）。为了生成可溶性DRB1链，第一轮使用引物对（+）5′-ACTCGAGCCATGGTGTGTGTGAGTTCCC-3′和（-）5′-CCAGGTCTGACGACTTGCTGCTCTGT-3′（与酸性LZ的5′端同源）扩增DRB1*0401的cDNA，每个引物的浓度为4 nM。对于第二轮扩增，第一轮产物用作pN15LZβ模板上的初始（+）引物，该模板包含10 pM浓度的酸性LZ cDNA基序，以形成DRB1/LZ嵌合体。引物对（+）5′-ACTCGAG公司CCATGGTGTCTGAAGTTCCC-3′和（–）5′-ACAAGCTT公司然后用GCCTGAGCCAGTTCTTTTCC-3′扩增嵌合体。将DRB1/LZ盒克隆在载体pAC1（Avidity，Denver，Colorado，USA）中存在的生物素化序列的5′框中，使用Xho公司我和后面的III位点（在第二轮引物对中下划线）。然后使用引物对（+）5′-A扩增出完整的DRB1/LZ/生物素化位点盒GAATTC公司ATGGTGTTCTGAAGTTCCC-3′和（–）5′-CTGGTACC公司TTAG TGCCATTCGATTTTCTG-3′。将该片段TA克隆到pCR2.1-TOPO中，测序，然后亚克隆到果蝇属表达载体pRmHa-3使用生态RI和千磅I站点（下划线）。

生成DRA1*0101/DRB1*0401四聚体。

将施耐德表达载体pRmHa-3中的嵌合cDNA与质粒pUChsneo（来自美国加利福尼亚州圣地亚哥Salk研究所M.McKeown的礼物）（携带新霉素抗性标记）共同转染到施耐德细胞S-2（来自美国新泽西州Rahway默克研究实验室D.Zaller的礼物）通过标准磷酸钙转染技术。用2mg/mL的G418筛选细胞。将细胞扩增并生长至密度为107细胞/mL.CuSO4以1 mM的浓度添加以诱导产生可溶性II类分子。如前所述，使用L243通过亲和层析纯化DR0401分子(15).

将II类分子浓缩至2 mg/mL，然后针对10 mM Tris、pH 8.0、10 mM NaCl进行透析。然后根据制造商的条件（美国科罗拉多州丹佛市Avidity），使用Bir A酶对蛋白质进行生物素化(16). 通过透析去除多余的生物素。然后将生物素化的DR0401分子在37°C下与10倍摩尔过剩的血凝素肽残基307–319（HA307–319)或破伤风类毒素残基830–843（TT830–843)100 mM NaPO中4pH 5.5和0.2%n个-辛基--D类-吡喃葡萄糖苷。然后在室温下将II类分子与藻红蛋白（PE）-链霉亲和素（BioSource International，Camarillo，California，USA）以8:1摩尔比孵育过夜，以形成四聚II类肽复合物。

HA的表征和染色307–319-特异性T细胞克隆。

哈307–319-从一名8个月前接种过流感病毒的DRB1*0401、DRB1*0101个体中克隆出特异性T细胞，如前所述，该个体通过限制自身照射抗原呈递细胞（APC）的稀释度进行免疫(17). 为了证实克隆的特异性，用10μg/mL HA刺激克隆细胞307–319使用转染的裸淋巴细胞综合征细胞系（BLS-1），其表达唯一的II类分子DRA1*0101/DRB1*0401(18).三72小时后测量H-胸腺嘧啶掺入量。克隆细胞在37°C的50μL培养基中用1μg聚乙二醇标记的四聚体染色3小时。然后在含有1%FBS和0.1%NaN的PBS中清洗细胞三，并用荧光标记的抗CD4抗体染色（美国加利福尼亚州圣何塞市PharMinen）。培养30分钟后，再次清洗细胞，并使用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪（美国加利福尼亚州圣何塞）进行分析。

PBMC的分离、刺激和染色。

通过梯度离心法从肝素化静脉血中分离出来自相同DRB1*0401、DRB1*0101个体（克隆来源）和第二个体（DRB1*0.401、*0401）的PBMC（淋巴泵；Nycomed Pharma AS Diagnostics，挪威奥斯陆）。细胞在RPMI-1640（GIBCO BRL，Rockville，Maryland，USA）中培养，补充2 mML（左）-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100μg/mL青霉素/链霉素和15%vol/vol混合人血清。通过5×10的PBMC电镀制备粘附细胞624孔板中每孔细胞数为1小时。使用移液管去除非粘附细胞。用10μg/mL HA培养粘附细胞3小时307–319肽，含有11μg/mL HA的全流感疫苗（Connaught Laboratories Inc.，Swiftwater，Pennsylvania，USA），或最大刺激剂量的全破伤风类毒素。将非粘附部分通过尼龙羊毛柱，用无血清PBS洗涤两次，并在37°C下用0.8μM 5-（和-6）-羧基荧光素二乙酸丁二酰酯（CFSE；Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA）染色10分钟。通过添加100%FBS并随后在RPMI-1640培养基中清洗细胞两次来停止染色。然后将CFSE染色的尼龙棉纯化T细胞以2.5×10的密度添加回粘附细胞6每个孔的细胞数。培养7天后，用PE-标记的四聚体和荧光标记的抗CD3组合对细胞进行染色-CD4、-CD8和-CD25（PharMinen；Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，California，USA）如上所述，并通过流式细胞术进行分析。

计算细胞分裂和前体频率。

用2.5μg/mL植物血凝素（PHA）和10 U IL-2刺激一部分CFSE染色的细胞，并在第7天用FACS检测。用PHA和IL-2对T细胞进行多克隆刺激，导致细胞分裂，出现不同的CFSE荧光峰，从而可以测定每代的平均CFSE荧光。这些值用于计算抗原刺激细胞的平均细胞分裂数。通过将四聚体阳性细胞的数量除以2来估计前驱体频率x个，其中x个是细胞分裂的平均数，用于确定四聚体阳性细胞的前体细胞的绝对数量，然后将该值除以所分析的细胞总数。

结果和讨论

早期的研究表明，以前接触过甲型流感病毒的人的外周血淋巴细胞对HA产生II类DR限制性T细胞增殖反应307–319表位(19). 这种保守肽可以在许多不同的DR单倍型中诱导增殖反应，包括DR1、DR4、DR5和DR7(20).

检测HA特异性T细胞307–319在DR4背景下呈现的肽，我们合成了负载HA的II类DRA1*0101/DRB1*0401四聚体307–319肽。我们测试了HA的特异性307–319使用对HA特异性的DRB1*0401限制性人类T细胞克隆的四聚体307–319如图所示​图1a，1a、 该克隆表现出针对HA的抗原特异性增殖307–319在BLS-1细胞系中表达DRB1*0401(18). 我们给HA染色307–319-使用负载HA的DRB1*0401四聚体进行特定克隆307–319肽。如图所示​图1b，1b、 几乎所有细胞HA染色呈阳性307–319四聚体和CD4，与克隆的表型一致。作为对照，我们还构建了一个含有TT的DRB1*0401四聚体830-843肽(21). 如图所示​图1c，1c、 没有HA307–319克隆细胞TT染色阳性830-843四聚体。

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HA的特异性和HLA限制性307–319四聚体。(一)与无抗原脉冲（左栏）转染DRA1*0101/DRB1*0401转染BLS-1的T细胞克隆和10μg/mL HA培养72小时时胸腺嘧啶掺入的比较307–319肽（右栏）。误差条表示三倍的SEM。在b条和c（c），克隆细胞在37°C下用PE-标记的四聚体染色3小时，洗涤，用CD4抗体染色，再次洗涤，并用流式细胞仪进行分析。用负载HA的四聚体染色307–319如所示b条，和装载TT的四聚体830-843肽显示在c（c）在这两种情况下，细胞在正向和侧向散射时都处于门控状态，纵轴显示四聚体荧光，横轴显示CD4荧光。每个面板边距中显示的百分比表示每个象限中存在的总单元格的百分比。

然后我们测试了HA的能力307–319四聚体检测从2名DRB1*0401捐献者（包括获得HA特异性克隆的同一捐献者）的外周血采集的抗原特异性T细胞。用CFSE（一种稳定结合细胞骨架肌动蛋白的荧光染料）对来自外周血的尼龙毛纯化T细胞进行染色(22). CFSE染色细胞与HA脉冲处理的自体贴壁细胞培养307–319肽、全流感疫苗或TT。培养7天后，HA307–319在流式细胞仪分析之前，用四聚体对细胞进行染色。每次细胞分裂时，CFSE在子细胞中平均分配，导致CFSE荧光减半。因此，可以通过比较生成的CFSE荧光和父代群体的原始荧光来确定细胞分裂的数量。如图所示​图2，2如水平轴上显示的CFSE荧光降低的细胞群体所示，所有3种抗原均诱导细胞增殖。纵轴显示了PE标记HA的荧光307–319四聚体和两个柱代表了在两个供体细胞上进行的等效实验。如图的左上象限所示​图2，2标记的四聚体清楚地识别出大量HA307–319-HA中的特定细胞307–319以及两名捐赠者的流感疫苗样本。据我们所知，这是第一次在外周血淋巴细胞刺激中直接发现表位特异性T辅助细胞。

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哈307–319与CFSE荧光相关的抗原特异性细胞的四聚体鉴定。尼龙羊毛纯化的T细胞，在与自体粘附细胞和抗原培养前用CFSE标记，在第7天用PE标记的HA染色307–319四聚体，随后用流式细胞仪进行分析。每行显示来自两个不同个体的不同刺激抗原的细胞：(一)10μg/mL透明质酸307–319肽(b条)μg/mL HA的全流感疫苗(c（c）)最大刺激剂量下的整个TT。在所有面板单元中，前向和侧向散射选通，垂直轴显示HA的PE荧光307–319四聚体，水平轴显示了40年对数尺度的CFSE荧光。此外，横轴显示相应的细胞分裂数，“P”表示未分裂的亲本种群。根据方法中所述的PHA和IL-2多克隆刺激产生的不同CFSE荧光峰计算出该量表。每个面板边距中显示的百分比表示每个象限中存在的总单元格的百分比。这些面板描述了具有代表性的单个实验的结果。

HA刺激细胞的检查307–319肽显示，在这两个个体中，约90%的四聚体结合细胞位于分裂的群体中，这反映了这一组T细胞的特定扩张。给定CFSE荧光的观察细胞分裂数显示在所有图形部分的水平轴上。根据CFSE荧光计算，供体1的四聚体结合细胞群在7天培养期间平均分裂6.5倍，而供体2的四聚物结合细胞平均分裂9倍。分裂数的差异是供体2中分裂细胞数量较多的原因。DRB1*0401四聚体特异性细胞的计算前体频率对于2个个体是相似的，范围在每100000个细胞中3到5个之间，这取决于个体实验。

分裂细胞的四聚体结合群体构成了HA中总分裂细胞的一个独特部分307–319模拟样本。在供体1中，一些四聚体阴性的分裂细胞可能代表HA特异性T细胞307–319在DRB1*0101的背景下，因为供体单倍型是DRB1*0401、DRB1*011，并且DR1被描述为能够呈现肽(23). 此外，即使在未添加抗原的对照样品中，也可以观察到占总细胞1%至7%的背景增殖水平，具体取决于个体（数据未显示）。抗原特异性HA释放的IL-2和其他细胞因子307–319细胞可能通过增加旁观者的激活和增殖来增加这种背景。

用全流感疫苗刺激的细胞内（图​（图2b），2b） ，对于两个个体，同样存在明确的四聚体阳性细胞群体，如左上象限所示。因此，即使在对病毒抗原产生强烈而复杂的增殖性T细胞反应的情况下，与免疫显性表位相对应的特异性T细胞也很容易被识别。尽管细胞增殖旺盛，但TT刺激的细胞没有四聚体标记（图​（图2c）。2c） ●●●●。这些结果表明，四聚体检测方法对HA反应的T细胞群体具有特异性和敏感性307–319.

使用四聚体染色和流式细胞术鉴定抗原特异性细胞，可以使用额外的荧光色素同时分析细胞。这种额外的表型分析可以提供有关抗原特异性反应的重要信息，例如涉及的T细胞类型、活化或其他标记物的存在以及通过细胞内染色产生的细胞因子。在这项研究中，我们检测了CD3、CD4、CD8和CD25的表面表达水平，以进一步表征HA鉴定的细胞307–319四聚体。图中的数据​图3三被选通以仅显示标识为HA的细胞307–319-四聚体阳性。图​图3，三a和b表明，几乎所有HA中的四聚体阳性细胞307–319肽刺激型和全流感疫苗刺激型样本为CD4+CD8（CD8）–类似地，图​图3，三c和d，表明大多数四聚体阳性细胞是CD3+CD25型+对于这两个样本。我们得出结论，DRB1*0401-HA307–319四聚体几乎完全与II类限制性、激活性和增殖性T细胞结合，这进一步支持了四聚体检测方法的特异性。

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HA的表型特征307–319四聚体特异性细胞。在用自体贴壁细胞和抗原培养前，用CFSE标记尼龙羊毛纯化的T细胞。第7天，在流式细胞术分析之前，用PE标记的四聚体对细胞进行染色，然后用荧光标记的抗CD3、-CD4、-CD8和-CD25抗体的组合进行染色。所有面板均位于四聚体阳性细胞上。上部面板显示CD8与CD4在受刺激细胞中的染色(一)透明质酸307–319肽，以及(b条)整体流感疫苗，而下部面板显示CD25与CD3在受刺激细胞中的染色(c（c）)透明质酸307–319肽，和(d日)全流感疫苗。阳性和阴性人群的边界由对照组确定。每个面板边距中显示的百分比表示每个象限中存在的总单元格的百分比。这些面板描述了具有代表性的单个实验的结果。

肽-MHC II类四聚体和CFSE染色的同时使用为评估和剖析抗原特异性T细胞反应提供了一个强大的工具。在原代培养物中直接鉴定肽特异性增殖避免了限制稀释分析以计算前体频率的需要，并且允许使用流式细胞术同时对抗原特异性细胞进行表型分析。本研究证明HA的免疫优势307–319全流感疫苗复杂反应背景下的表位，并说明了如何使用四聚体直接鉴定免疫显性抗原特异性。尽管特定肽类II四聚体的稳定性可能因肽而异，但将不同肽装载到四聚体中的潜力表明了多种应用。II类四聚体的使用提供了一种在更详细的水平上了解对传染源和自身免疫疾病的免疫反应的方法。

致谢

作者感谢S.Masewicz提供的专家技术援助，Å.Lernmark提供的建设性意见和建议，以及K.Nelson和M.Gallagher在4色流式细胞术分析方面的有益讨论和帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院AI-44443拨款的部分支持。E.J.Novak获得了Poncin和Acheivement大学科学家博士前奖学金的支持。

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会