NIPP1是一种39 kDa的核蛋白，在动植物中都有表达(11,17,29). 最初纯化为蛋白磷酸酶1（PP1）的一种强效和特异性抑制剂；因此得名，PP1的核抑制剂(三). NIPP1含有至少两个PP1结合位点，并与PP1核池的三分之一络合(2,5,19). NIPP1-PP1复合物不活跃，但可以通过蛋白激酶A磷酸化NIPP1而激活(1,31)，蛋白激酶CK2(28,31)，以及高级工程师家庭(5). NIPP1在黑腹果蝇在一系列组织和发育阶段是致命的，可能是PP1抑制的结果(25).
NIPP1还与细胞周期调节的母胎亮氨酸拉链激酶（MELK）结合(30). 在有丝分裂期间，MELK通过磷酸化苏氨酸与NIPP1的Forkhead-associated（FHA）结构域相互作用。有趣的是，MELK是一种有效的剪接体组装抑制剂，这种抑制需要一个功能性NIPP1结合位点。因此，MELK-NIPP1相互作用可能有助于有丝分裂期间的剪接阻滞。NIPP1在前mRNA剪接中的关键作用的其他证据来自与NIPP1片段的竞争实验(4)根据观察，NIPP1在剪接因子储存位点或“斑点”和剪接体中富集(4,17,26). NIPP1对这些亚核隔室的靶向性由其FHA结构域介导(4,17)可能是由FHA结构域与剪接因子CDC5L磷酸化形式的相互作用引起的(8)和SAP155(7).
对NIPP1功能复杂性的进一步了解来自最近的观察，即NIPP1也与Polycomb公司蛋白质EED（胚胎外胚层发育），多梳抑制复合物2（PRC2）的一种成分，与维持基因处于抑制状态有关(20). 在瞬时转染实验中，EED和NIPP1都起到靶基因转录抑制因子的作用。此外，含有NIPP1、EED、PP1和组蛋白去乙酰化酶HDAC2的大分子复合物已被鉴定，表明组蛋白脱乙酰化在NIPP1的转录抑制中起作用。
人类NIPP1编码基因，PPP1R8页，可产生多个拼接变体(27). 普遍表达的NIPP1亚型被称为NIPP1α（或仅NIPP1）。另一种亚型是NIPP1γ/Ard1(12,27)，对应于NIPP1α的C端三分之一。有趣的是，NIPP1γ显示了一种内核糖核酸酶活性，其特异性类似于细菌RNase E，它是各种RNA衰变和加工的关键调节因子(21,32). 然而，广泛表达的NIPP1α亚型没有内核糖核酸酶活性(18)表明这种酶活性的表达受到严格控制。
总之，NIPP1是一种多功能蛋白质，是转录、RNA处理和细胞周期进展的候选“整合者”。为了进一步研究NIPP1的复杂功能，我们破坏了编码NIPP1基因(第1页第8页)在小鼠中通过同源重组。NIPP1公司−/+小鼠没有表现出明显的表型，而NIPP1−/−胚胎在怀孕后6.5天左右死亡。这种早期胚胎致死性与细胞增殖能力普遍下降有关。囊胚生长实验和培养细胞中NIPP1的RNA干扰（RNAi）介导的敲除证实了NIPP1在细胞增殖中的重要作用。
材料和方法
同源重组靶向载体的构建。
两个重叠的12.5-kb基因组噬菌体克隆，包含第1页第8页，从来自Stratagene（加利福尼亚州拉霍亚）的129SvJ小鼠lambda文库中分离得到（图。). 分离噬菌体DNA，将所有EcoRI和XbaI片段亚克隆到pBluescript SK中。亚克隆通过限制性内切酶图谱分析和测序进一步表征，并用于构建靶向载体（图。). 以pPNT质粒为主干的靶向载体含有3.2 kb的第1页第8页5′臂序列（侧翼1）和4.3kb第1页第8页在3′臂上（侧面2）。A类液氧磷-侧翼新霉素耐药盒（Neo第页)在侧翼1和2之间插入阳性选择，在侧翼2外克隆一个胸腺嘧啶激酶表达盒。新霉素盒以与NIPP1基因片段相反的方向引入。通过限制性酶切和核苷酸测序验证了靶向载体的完整性。
NIPP1基因的靶向破坏。（A） 的部分限制映射第1页第8页位点（小鼠NIPP1基因）、靶向载体和靶向位点。顶部显示了从129SvJ小鼠λ基因组文库中分离出的两个12.5-kb噬菌体基因组克隆。在野生型（wt）基因座中，外显子1至5（E1至E5）显示为实心框，“ATG”代表第一个编码外显子。限制场所：B、BamHI（未全部注明）；E、 EcoRI（所有指示）；P、 PstI（并非全部显示）。wt位点和靶向载体之间的虚线描绘了基因组位点和替换载体共同的区域。新霉素耐药盒（Neo第页)在替换向量的两侧是液氧磷（未指明），胸苷激酶盒（TK）位于替代载体侧翼2的下游。目标位点代表与替换载体同源重组后NIPP1位点的预测结构。包含部分启动子区域以及外显子1至2的6.6-kb片段已被Neo盒所取代。（B） NIPP1杂合子杂交新生儿的Southern blot基因分型。基因组DNA用EcoRI酶切并与探针A杂交，wt等位基因产生9-kb带，突变等位基因形成5.8kb带。（C） NIPP1杂合子杂交获得的E7.5胚胎的PCR基因分型。如材料和方法中所述，wt特异性巢式PCR扩增出402 bp的带，而突变特异性PCR扩增出696 bp的带。M、 标记；C、 控件。（D） NIPP1杂合杂交分离的囊胚（E3.5）的RT-PCR基因分型。wt NIPP1等位基因的存在导致350-bp片段，而突变的NIPP1等位基因导致696-bp产物的扩增。（E） 通过免疫染色检测NIPP1杂合子杂交E6.5胚胎中的NIPP1。用E6.5蜕膜制作石蜡包埋胚胎的连续横切面。切片用抗NIPP1抗体（a和c）或抗HDAC2抗体（b和d）染色。图中显示了一个表达NIPP1（a和b）的胚胎和一个缺乏NIPP1的胚胎（c和d）。面板c和d中的对照条件不包含DNA模板。面板Ea中的钢筋，50μm。
ES细胞转染和NIPP1的产生−/−老鼠。
将NotI-线性化靶向载体电穿孔至R1胚胎干细胞(13). 在用更昔洛韦（2μM）进行阴性选择和用Geneticin（200μg/ml）进行阳性选择后，获得了抗性ES克隆，并用Southern blotting进行了分析。NIPP1公司−/+如前所述，ES细胞与瑞士韦伯斯特桑椹期胚胎聚集，生成嵌合体动物(13). 由此产生的嵌合体雄性与瑞士雌性杂交，NIPP1−/+通过对尾部活检获得的基因组DNA进行Southern blot分析，鉴定转基因后代。杂交杂合小鼠获得NIPP1−/−整体比例为50:50 R1 129的小鼠：瑞士遗传背景。
基因型分析。
通过Southern印迹或通过PCR从ES克隆、小鼠尾尖或胚胎中分离用于基因型分析的DNA。NIPP1的正确同源重组−/+使用紧邻侧翼1上游的0.8-kb EcoRI-PstI片段（探针a）和位于侧翼2下游的1.7-kb HindIII-BamHI片段（探针B）通过Southern blot分析证实了两侧侧翼的克隆（图。). 为了排除靶向载体的额外随机整合，使用位于侧翼2的内部1.1-kb XbaI片段（探针C）来验证SpeI-消化DNA中没有额外的带。将EcoRI消化的DNA与探针A杂交，可检测到野生型等位基因的9 kb带和目标等位基因5.8 kb带（图。). SpeI消化的DNA与探针B的杂交鉴定出野生型等位基因的13kb带和靶向等位基因的8kb带（数据未显示）。
小鼠尾尖和胚胎第8.5天（E8.5）或E10.5天胚胎的PCR基因分型（表)采用三引物策略：位于侧翼1的普通引物（5′-CCTCAGCAGATAGCCCACGG-3′）可以与位于缺失区域的野生型等位基因特异性反义引物配对（5′-GATGCTTGGCCACTGAAGGCC-3′）或使用位于新霉素基因中的突变等位基因特异反义引物（5′-CGCATCGCCTTCTATCGCCCTTGAC-3′）。野生型等位基因的扩增产生402-bp的带，而突变等位基因扩增产生623bp的产物。E7.5胚胎的PCR基因分型（表; 图。)通过野生型特异性巢式PCR和突变型特异性PCR进行。用正义引物5′-CCTCAGAGATAGCCCACGG-3′和反义引物5’-GTACTGTAATCTAAGAGTCACC-3′从野生型等位基因中扩增出475-bp片段。将初级产物作为模板，用相同的正义引物和嵌套的反义引物5′-GATGCTTGGCACTGGAAGAGGCC-3′进行二次PCR。这种扩增产生402-bp野生型特异性PCR产物。用5′-CAACAGACATCGGCTGCTGATGC-3′和5′-GATAGAGCGCTGCGAATCG-3′两个新粘菌素特异性引物扩增出突变等位基因产物，长696 bp。
表1。
| 年龄 | 具有以下基因型的数量（%）：
| 吸收次数（%） | 总计 | 检测方法 |
|---|
| 野生型 | 杂合子 | 纯合子 |
|---|
| 第3.5页 | 12 (23) | 29 (56) | 11 (21) | | 52 | 逆转录聚合酶链反应 |
| E6.5类 | ND（无损检测）一 | ND（无损检测） | 30 (19) | 4 (3) | 155 | 免疫染色 |
| 第7.5页 | 15 (25) | 32 (54) | 1 (2) | 11 (19) | 59 | 嵌套PCR |
| E8.5段 | 19 (44) | 12 (28) | 0 (0) | 12 (28) | 43 | 聚合酶链反应 |
| E10.5级 | 20 (33) | 22 (37) | 0 | 18 (30) | 60 | PCR+Southern印迹 |
| 新生儿 | 95 (35) | 176 (65) | 0 | | 271 | 聚合酶链式反应+Southern印迹 |
采用逆转录PCR（RT-PCR）对E3.5囊胚进行基因分型。将冲洗后的囊胚立即冷冻在干冰上，并在−80°C下保存，直至使用。囊胚通过三个冷冻和解冻循环进行溶解。根据制造商的说明（RevertAid first strand cDNA合成试剂盒；Fermentas，St.Leon-Rot，德国），使用寡核苷酸（dT）引物生成第一链cDNA。为了检测野生型cDNA，我们进行了以下巢式PCR。用五分之一的RT产物与5′-GAACTCCGGCTCCCCCCCCCCG-3′和5′-GATCTCGTCACTCACTG-3′的反义引物进行初级PCR，得到612-bp的PCR产物。将此PCR混合物的5μl等分样品用于第二次PCR，通过将正引物5′-GATCTGTGTGACTTCACTATCGACC-3′和反义引物5’-GGCAGGTGAACTCAGG-3′组合，扩增出350 bp的产物。通过上一段中给出的两个新霉素特异性引物的组合扩增突变等位基因产物。
胚胎的组织学分析。
将蜕膜从子宫组织中剥离出来，在新制备的1%对甲醛-磷酸缓冲盐水（PBS）中固定过夜，在PBS中清洗，用越来越高浓度的乙醇脱水，在二甲苯中清除，并包埋在石蜡中。然后在横向或矢状平面上连续切割石蜡包埋块，厚度为7μm。第一组等距切片用哈里斯苏木精和伊红染色（VWR，比利时鲁汶）。
免疫组织化学。
Perkin-Elmer（Wellesley，Mass.）的TSA生物素系统用于免疫组织学染色。石蜡切片再水化（两次，每次5分钟，在二甲苯中；两次，每一次3分钟，在100%乙醇中；3分钟在70%乙醇中；三分钟在50%乙醇中；和5分钟在水中），在柠檬酸缓冲液（1.5 mM柠檬酸、8.5 mM柠檬酸钠、0.05%Dreft洗涤剂）中在热板上煮沸20分钟，并冷却到室温。在TBST（20 mM Tris-HCl[pH 7.4]，0.15 M NaCl，0.1%Triton X-100）中清洗切片5分钟。用0.03%H去除内源过氧化物酶2O（运行）2随后，将切片在TBST中清洗三次，每次5分钟，然后用20%山羊血清或20%兔血清（DAKO，Glostrup，Denmark）在TNB阻断缓冲液（Perkin Elmer）中阻断，根据辣根过氧化物酶（HRP）-二级抗体分别为结合羊抗兔抗体和兔抗鼠抗体。切片在一级抗体（1/50 in TNB）中培养过夜，用TNT（0.1 M Tris-HCl[pH7.5]，0.15 M NaCl，0.05%Triton X-100）洗涤三次，每次5 min，在室温下用二级抗体（1/100 in TNB。通过在生物素酪胺中培养8分钟来放大信号，生物素酪酰胺在扩增稀释剂（Perkin Elmer）中稀释50倍，在TNT中洗涤三次，每次5分钟，在TNB中与链霉亲和素HRP（1/100）培养30分钟，最后在50 mM Tris（pH 7.5）中洗涤三遍，每次5 min。使用二氨基苯甲脒（DAB；1 mg/ml，50 mM Tris-HCl[pH7.5]）作为显色剂，过氧化氢（0.01%）作为底物，通过HRP反应显示信号。切片用哈里斯苏木精复染。抗-Gata4抗体（sc9053）、抗Oct4抗体（sc5279）、抗HDAC2抗体（sc7899）和抗Brachyury抗体（sc17745）均来自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）。抗Cdx2抗体购自BioGenex（加利福尼亚州圣拉蒙）。从DAKO中获得抗溴脱氧尿苷（BrdU）抗体（M0744）和HRP偶联的山羊抗兔或兔抗鼠二级抗体。针对含有NIPP1残基341至351的合成肽产生抗NIPP1抗体(29).
囊胚的体外培养。
杂合NIPP1雄性与超排卵杂合雌性杂交。妊娠第3.5天，在M2培养基（Sigma，St.Louis，Mo）中从子宫中冲洗出胚泡，并在37°C和5%CO下培养2在TX-WES培养基（Thromb-X，NV）中的明胶涂布的带腔盖玻片（SanBio，Uden，The Netherlands）上。每天用数码相机记录外生长形态。NIPP1公司−/−培养5天后，用NIPP1抗体通过免疫荧光鉴定囊胚。
胚胎和胚泡发育的BrdU标记。
在E6.5时，将BrdU（100μg/g体重）腹腔注射到怀孕雌性体内。注射后1 h处死雌性动物，取出子宫，将蜕膜肿胀固定在新鲜制备的1%副甲醛-PBS中过夜，并进行免疫组织化学处理。将BrdU（50μM）加入到在明胶包腔盖玻片上生长4天的胚泡培养基中。16小时后，将细胞固定在2%副甲醛-PBS中，并进行免疫荧光。
RNAi。
用于击倒NIPP1的小干扰RNA分子（siRNAs）是使用来自Gene Therapy Systems，Inc.（加利福尼亚州圣地亚哥）的Dicer siRNA生成试剂盒制造的。为了制备NIPP1的双链RNA（dsRNA），我们使用了以下PCR引物，其前20 bp来自T7启动子：5′-GCGTAGACTCACTATAGAGGAGGGTCATTACTGCTGGA-3′和5′-GCCTAGACTACTAGAGGACCATGCTACTCTGCTACTTC-3′。使用MEGAscript T7试剂盒（英国剑桥郡亨廷顿Ambion）在体外用T7 RNA聚合酶转录PCR产物以形成dsRNA。为了转染一个24孔培养的HEK293或U2OS细胞，用1 U重组Dicer酶在体外切割1μg该dsRNA。层粘连蛋白A/C siRNA双链（5′-AACUGGACUCAGAGAACA-3′）购自Dharmacon，Inc.（科罗拉多州拉斐特）。根据制造商的协议（基因治疗系统），使用GeneSilencer siRNA转染试剂转染层粘连蛋白dsRNA或切割和纯化的NIPP1 dsRNA。对于Western blot分析，收集所有细胞，用PBS洗涤两次，然后在含有50 mM Tris（pH 7.5）、0.3 M NaCl、0.5%Triton X-100、0.5 mM二硫苏糖醇、0.5 mM-苯甲烷磺酰基氟化物、0.5 mM.苯甲脒和5μM亮氨酸蛋白酶的溶液中进行溶解。超声处理后，通过离心（在16000×克)，并在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中测量蛋白质浓度以使负载相等。
细胞培养和免疫荧光。
HEK293细胞在添加了10%胎牛血清、100 U青霉素/ml、100μg链霉素/ml和2 mM的Dulbecco改良Eagle's培养基中生长我-谷氨酰胺。U2OS细胞在McCoy的5A培养基中生长我-谷氨酰胺，补充10%胎牛血清、100 U青霉素/ml和100μg链霉素/ml。免疫荧光实验中，细胞和胚泡生长物在PBS中清洗5分钟，在PBS-2%甲醛中固定10分钟，在PBS-0.5%Triton X-100中渗透10分钟，最后在含有3%牛血清白蛋白的PBS中封闭20分钟。对于BrdU染色，胚泡外生长物在PBS-0.5%Triton-0.1 M HCl中渗透。一级和二级抗体（四甲基罗丹明异硫氰酸盐[TRITC]共轭抗鼠免疫球蛋白G；异硫氰酸酯荧光素和TRITC共轭抗兔免疫球蛋白G[DAKO]）以1/200的最终稀释度使用，并在细胞上保留1小时。每一步之后用PBS三次洗涤5分钟。使用共焦显微镜（蔡司LSM 510）进行显微镜检查。
TUNEL分析。
使用DeadEnd比色细胞凋亡检测系统（荷兰莱顿Promega）对切片胚胎进行了末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）介导的dUTP掺入DNA末端的研究。简单地说，用蛋白酶K消化粘附在玻片上的脱蜡和再水化切片，并用4%多聚甲醛在PBS中固定。在37°C的玻片上加入TDT酶荧光标记的核苷酸60分钟。在每个染色实验中，已知TDT-介导的dUTP-生物素缺口末端标记（TUNEL）阳性样品（DNA酶处理）用作阳性对照。作为阴性对照，反应在没有TDT的情况下进行。
结果
有针对性地中断第1页第8页.
生成NIPP1−/+通过同源重组，我们构建了一个替换型靶向载体，目的是交换一个6.6kb的片段第1页第8页对于新霉素盒（图。). 已删除的第1页第8页该片段包括启动子区的3.2kb片段以及外显子1和2。将线性化靶向载体电穿孔至R1 ES细胞后，8个NIPP1−/+获得ES细胞克隆。NIPP1−/+将ES细胞聚集到瑞士小鼠桑椹胚中，并将其植入养母体内。将产生的嵌合体雄性与瑞士雌性杂交，并通过Southern blot分析鉴定杂合子代。
NIPP1公司−/+小鼠在长达1年的时间里没有表现出明显的表型（数据未显示）。因此，杂合子表现出正常的生育能力，并且在此期间没有发生肿瘤。有趣的是，免疫印迹分析没有显示野生型和NIPP1器官中NIPP1表达水平的差异−/+小鼠（数据未显示），表明一个NIPP1等位基因的丢失不会影响细胞NIPP1浓度。
NIPP1缺乏会导致早期胚胎死亡。
为了检测NIPP1-null小鼠的表型，NIPP1−/+对小鼠进行杂交，并对其后代进行基因分型。新生儿的PCR和Southern blot分析未发现NIPP1存活的证据−/−小鼠，而野生型和杂合型动物以预期的1:2比例获得（表; 图。). 检查NIPP1在胚胎发育的哪个阶段−/−胚胎死亡，我们对定时交配的胚胎进行了RT-PCR和免疫组织化学分析。59个PCR-基因型E7.5胚胎中只有1个纯合子，没有存活的NIPP1−/−胚胎检测时间超过7.5天（表; 图。). 然而，我们注意到，20%至30%的E7.5至E10.5胚胎被吸收（表)，大致对应于预期NIPP1的数量−/−胚胎（25%）。E3.5囊胚在NIPP1中仍显示正常的孟德尔分布+/+（23%），NIPP1−/+（56%）和NIPP1−/−通过RT-PCR分析确定的（21%）基因型（表; 图。). 此外，石蜡包埋E6.5胚胎切片的免疫染色显示，19%的NIPP1胚胎−/+交叉组分不表达NIPP1，但其不相关的核组蛋白去乙酰化酶HDAC2水平正常（表; 图。). 应该注意的是，通过免疫荧光进行的基因分型并不能区分NIPP1−/+和NIPP1+/+基因型；因此，以这种方式进行基因分型的胚胎统称为野生型（NIPP1重量).
上述数据表明NIPP1−/−胚胎在发育6.5至7.5天之间死亡。苏木精和伊红染色显示E6.5 NIPP1−/−胚胎的大小只有野生型E6.5胎仔的一半左右（图。). 这种差异在横切面和矢状切面上都很明显。在E6.5的野生型胚胎中，可以观察到胚胎轴（图。)胚胎外和胚胎外胚层被组织成围绕羊膜前腔的上皮（图。). 然而，在NIPP1-null胚胎中，胚胎轴几乎看不到，来自胚胎和胚外外胚层的细胞似乎没有清楚地组织成上皮层，这是NIPP1出现紊乱的原因−/−胚胎。此外，NIPP1-null胚胎中的羊膜前腔缩小，有时甚至根本看不见。此外，NIPP1-null胚胎中无法区分起源于极性滋养层的外胎盘锥（图。).
E6.5 NIPP1的组织学分析重量和NIPP1−/−同窝的人。图中显示了嵌有石蜡的NIPP1的苏木精和伊红染色切片重量（A至C）和NIPP1−/−（D至F）胚胎在E6.5。NIPP1公司重量指NIPP1+/+或NIPP1−/+基因型。图中显示了胚胎外（B和E）和胚胎（C和F）两极的横截面以及矢状截面（A和D）。面板A中的箭头表示胚胎和胚外区域之间的连接。NIPP1公司−/−胚胎的大小约为野生型同胞的一半。无法区分外胎盘锥。Ec，外胎盘锥；ExEc，胚外外胚层，ExVE，胚外脏内胚层；EmEc，胚胎外胚层；胚胎内脏内胚层；R、 Reichert膜；PrC，羊膜前腔。面板A中的棒材，50μm。
为了进一步详细检查分化为不同的细胞谱系，我们对顶叶和内脏内胚层（Gata4）、胚胎外胚层（Cdx2）和胚胎外胚层（Oct4）的特异性标记物进行了免疫染色。所有三种细胞谱系都清楚地存在于NIPP1中−/−胚胎（图。). 内脏内胚层组织良好，形成上皮层（图。)，来自胚胎外的细胞（图。)和胚胎（图。)NIPP1-null胚胎中的外胚层更分散。早期中胚层标记Brachyury在野生型胚胎中呈阳性染色，但在NIPP1中呈阴性染色−/−胚胎（数据未显示）。
NIPP1中的细胞谱系重量和NIPP1−/−胚胎。嵌蜡NIPP1的横截面（A）和矢状截面（B）重量和NIPP1−/−如图所示，对胚胎（E6.5）进行NIPP1、Gata4、Cdx2和Oct4免疫染色。Gata4特异性染色内脏和壁内胚层，Cdx2是胚外外胚层的标记，Oct4在胚胎外胚层中特异性表达。NIPP1中可以区分所有三种细胞系−/−胚胎，但胚外胚层和胚胎外胚层没有组织成透明的上皮层。缩写如图图例所示。.VE，内脏内胚层。面板Aa和Ba中的棒材，50μm。
NIPP1-null胚胎的增殖率降低。
上述数据表明NIPP1−/−胚泡正常植入，发育成双层卵圆形，但卵圆形严重缩小，外胚层结构紊乱。NIPP1公司−/−胚胎也不能形成外胎盘锥和中胚层。为了进一步探讨NIPP1基因敲除物早期胚胎致死的原因，我们研究了NIPP1−/−胚胎凋亡水平增加。对E6.5胚胎切片的TUNEL分析显示，野生型和敲除型胚胎的凋亡水平相似（图。). 然后，我们通过测量E6.5胚胎中BrdU与DNA的结合来研究NIPP1缺乏对体内细胞增殖的影响。对标记和未标记细胞核的计数显示，NIPP1中只有45%的细胞被标记−/−胚胎，相比之下NIPP1的63%重量胚胎。这些数据表明NIPP1的细胞增殖率降低−/−胚胎（图。).
NIPP1的细胞凋亡和增殖率重量和NIPP1−/−胚胎。（A） NIPP1嵌蜡横截面重量（a和b）和NIPP1−/−（c和d）E6.5胚胎用苏木精和伊红染色（a和c），并用TUNEL分析（b和d）显示凋亡。野生型和敲除型胚胎的细胞凋亡没有差异。面板Aa中的钢筋，50μm。（B） 在处死前1小时向怀孕小鼠注射BrdU。NIPP1部分重量和NIPP1−/−用抗BrdU抗体进行免疫染色，对胚胎（E6.5）进行BrdU掺入分析。五个NIPP1的染色细胞核重量和六个NIPP1−/−对胚胎进行计数，并将其表示为切片中细胞核总数的百分比。在突变胚胎中发现近20%的BrdU掺入量降低，表明细胞增殖率降低。结果为平均值±标准误差(P（P）=0.0074（未配对）t吨测试）。
NIPP1缺陷囊胚的延迟生长。
更好地了解NIPP1生长迟缓的本质−/−胚胎，我们检测了植入前胚胎的体外生长能力。囊胚在TX-WES培养基中培养，以便从透明带孵化，粘附在涂有明胶的盖玻片上，并将内细胞团膨胀成多层，将滋养层膨胀成滋养层单层。在从杂合杂交中分离出的42个囊胚中，29个囊胚可以成功培养。其中8例（27%）通过免疫染色鉴定为NIPP1−/−囊胚。经过2到3天的培养，所有29个胚胎都从透明带孵化出来，并附着在盖玻片表面（图。). 然而，3天后，NIPPl重量囊胚已经显示出明显的突起，而NIPP1没有形成突起−/−囊胚（图。). NIPP1的衍生产品−/−培养5天后，可以看到囊胚（图。)但Hoechst染色检测到的内细胞团中的细胞数量明显低于NIPP1生长的细胞数量重量囊胚（图。). 此外，NIPP1来源的滋养层巨细胞细胞核−/−胚泡比野生型胚泡小。由于滋养层巨细胞是通过重复复制生长的，而没有干预细胞分裂(16)，这些数据可能表明G需要NIPP11/S转换或复制（请参阅讨论）。
NIPP1缺陷囊胚生长迟缓。按照材料和方法中的描述，分离、培养杂合子杂交后代的囊胚并进行基因分型。（A） NIPP1的副产物照片重量（a至c）和NIPP1−/−（d至f）囊胚在体外培养指定时间后。3至5天后，内细胞团（ICM）被滋养层巨细胞（TG）包围。3天后，NIPP1−/−胚泡尚未形成突起。ZP，透明带。（B） 培养4天后，NIPP1重量和NIPP1−/−用BrdU孵育囊胚外生长16h。通过BrdU免疫荧光（b和e）观察BrdU掺入。图中还显示了通过免疫荧光（a和d）和Hoechst染色（e和f）对NIPP1和DNA的囊胚生长进行染色。NIPP1公司−/−囊胚发育延迟，BrdU掺入严重减少。抗体。棒材，20μm。
我们还将培养4天的囊胚在BrdU的存在下孵育16小时，然后用抗BrdU抗体对其生长进行免疫染色，以识别标记期间发生DNA合成的细胞（图。). 与NIPP1相比重量胚泡生长，NIPP1中标记的细胞很少−/−胚泡发育不全，表明后者的细胞周期延长。
缺乏NIPP1的细胞系是不可行的。
为了检测培养细胞的增殖是否也需要NIPP1，我们首先尝试生成NIPP1−/−ES细胞。对单个克隆进行选择，增加基因素浓度（2 mg/ml[23])，但在169个存活的ES亚克隆中，没有一个存活的NIPP1−/−线路已识别。作为替代方案，我们试图从NIPP1囊胚中获得ES细胞系−/+交叉路口。在102个用于ES细胞衍生的囊胚中，建立了42个细胞系。通过Southern blot分析进行基因分型得到16个NIPP1+/+（38%）和26 NIPP1−/+（62%）细胞系，但没有一个带有NIPP1的细胞系−/−基因型（数据未显示）。我们未能获得NIPP1−/−ES克隆表明NIPP1对ES细胞的活性也至关重要。
为了进一步探索NIPP1对培养细胞增殖的需求，我们检测了HEK293细胞中RNAi介导的NIPP1敲低的作用（图。)和U2OS单元（数据未显示）。为此，用Dicer酶在体外切割NIPP1转录物中衍生的700-kb dsRNA片段，并转染到细胞中。这导致NIPP1在72小时内几乎完全消失，如两种免疫印迹法所检测到的（图。)和免疫荧光分析（图。). 相反，这种转染并不影响SIPP1的水平（图。)，一种不相关的核支架蛋白(22). 此外，用siRNAs转染细胞以击倒层粘连蛋白A/C并不会影响NIPP1的水平（图。). RNAi诱导的NIPP1基因敲除与细胞增殖完全失败相关，存活细胞数量较少证明了这一点（图。).
RNAi介导的NIPP1敲低对哺乳动物细胞增殖的影响。（A） 用NIPP1特异性或层粘连A/C特异性siRNA或模拟转染（无siRNA）转染HEK293细胞72小时后，用抗NIPP1抗体（上面板）和抗SIPP1抗体进行免疫印迹分析，SIPP1是一种结构无关的核支架蛋白（下面板）。（B） 通过免疫荧光分析测定模拟转染细胞（a）和转染NIPP1特异性siRNAs（B）的细胞中NIPP1蛋白的水平。棒材，10μm。（C） 模拟转染（a）或转染NIPP1-特异性siRNAs（b）72小时后HEK293细胞的数量和形态。RNAi诱导的NIPP1基因敲除导致细胞数量减少，表明生长较慢。棒材，30μm。
讨论
NIPP1是小鼠早期胚胎发育所必需的。
为了研究NIPP1在体内的功能多样性，我们通过同源重组靶向NIPP1编码基因。令人惊讶的是，只有一个NIPP1等位基因的突变没有影响细胞NIPP1浓度，这解释了NIPP1缺乏显性表型−/+老鼠。这些发现与我们之前的观察结果吻合，即细胞NIPP1浓度受到严格控制，可能受到负反馈调节。例如，用NIPP1表达载体转染哺乳动物细胞导致NIPP1转录物的大量积累，而NIPP1蛋白的浓度没有相应的变化；这可以由涉及NIPP1转录物编码区的翻译抑制机制解释(17,33). 因此，杂合子组织中NIPP1蛋白的浓度可能正常，因为NIPP1转录物的基础水平较低，导致翻译抑制较小。然而，不能排除其他控制机制，例如转录水平的控制机制。
NIPP1等位基因的突变与早期胚胎致死有关。在E6.5，NIPP1−/−胚胎只有正常大小的一半左右（图。)它们的增殖率普遍较低，但与凋亡无关（图。). 此外，NIPP1−/−胚胎不能形成胎盘外锥和中胚层，它们的外胚层细胞也不能组织成上皮层（图。和). 到E7.5，几乎所有的NIPP1−/−胚胎被吸收（表). 总之，这些数据强烈表明，NIPP1是原肠胚形成前后胚胎快速生长和分化阶段所必需的。一个有趣的问题是为什么NIPP1−/−胚胎存活到E6.5（表)而NIPP1在培养细胞中的敲除与3天内增殖完全受阻有关（图。). 一种可能的解释是，NIPP1的需求随着细胞周期进展的速度而增加。这可以解释为什么NIPP1−/−胚胎在与增殖率增强相关的时期死亡，以及为什么NIPP1缺失会导致快速分裂的HEK293或U2OS细胞的细胞增殖立即受阻。在这方面，同样引人注目的是，NIPP1的缺乏阻碍了快速分裂的外胚层细胞与上皮层的结合，但似乎并不影响分裂较慢的内胚层细胞的上皮组织（图。). NIPP1缺失对胚胎发育影响相对较晚的另一种可能解释是，胚胎发育的第一天是由母体提供的NIPP1维持的。此外，NIPP1的库可能比培养细胞中的更新慢。有趣的是，与外胚层相比，内脏内胚层在NIPP1中仍然形成上皮层−/−根据野生型胚胎内胚层中NIPP1的相对低浓度判断，这符合内胚层对NIPP1明显较低的要求（图。). 因此，由于对NIPP1的需求较低，NIPP1中的内胚层细胞−/−胚胎可能比其他细胞谱系生长更长的时间。
NIPP1在细胞增殖中的作用。
我们已经获得了将NIPP1与细胞增殖联系在一起的各种独立证据。首先，NIPP1的缺乏与培养细胞的增殖率降低有关（图。)胚泡外生长的内细胞团（图。). 第二，BrdU在胚胎中的掺入（图。)和胚泡外生长（图。)在NIPP1中严重受损−/−条件。第三，NIPP1外生长的滋养层巨细胞的细胞核−/−囊胚保持相对较小（图。). 因为这些细胞内复制(16)也就是说，在没有进行有丝分裂的情况下，它们的细胞核通过重复的复制周期而增大，这些数据表明NIPP1缺乏与G缺乏有关1/S转换和/或阻碍DNA复制。
我们假设NIPP1对细胞增殖的贡献是由其蛋白配体介导的。例如，NIPP1是PP1的一种非常有效的抑制剂(31)可以设想，抑制PP1可能需要通过细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶实现视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）的净磷酸化，而这是G1/S过渡。在没有NIPP1的情况下，PP1不会被抑制使其建立的底物pRb去磷酸化(6,10)，从而阻碍进入S阶段。NIPP1介导的PP1池去磷酸化pRb的抑制将增加已建立的细胞周期调节机制，即通过其C末端的磷酸化抑制PP1(6,10).
NIPP1可能也有助于G1/S转换通过其干扰转录和/或（选择性）剪接的能力。这个Polycomb公司蛋白EED最近被鉴定为NIPP1的一种新配体，并且发现NIPP1和EED一样，在培养细胞中起到转录阻遏物的作用(20). EED的转录效应在很大程度上可以通过其招募组蛋白甲基转移酶EZH2的能力来解释。有趣的是，RNAi介导的EED或EZH2在培养细胞中的敲除(9)导致与NIPP1敲低相关的相同表型（图。). 此外，对EED编码基因的靶向性破坏(14,15)和EZH2(24)在小鼠中也与早期胚胎致死有关，尽管比NIPP1稍晚−/−胚胎。最后，EED和EZH2的表达由转录因子E2F1到E2F3控制(9)，受pRb负调控，NIPP1基因的启动子也含有E2F共识结合位点（我们未发表的观察结果）。总之，这些数据表明NIPP1、EED和EZH2都是促进G1/快速分裂细胞中的S转变。
